RNA指導(dǎo)的DNA復(fù)制(逆轉(zhuǎn)錄)及病毒的復(fù)制

1、.1RNA replicationReverse transcription=replication.2逆轉(zhuǎn)錄酶 （reverse transcription) 1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。 表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過程中要合成DNA。 Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。 表明：轉(zhuǎn)錄對于RNA病毒增殖是必需的。.3 Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。 1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中

2、發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。.4多功能酶：1、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：合成互補(bǔ)DNA。4、沒有35外切酶活性。.5特點(diǎn)：含有Zn2+（是否有鋅指結(jié)構(gòu)、DNA結(jié)合功能？）DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物。需適當(dāng)濃度的二價(jià)陽離子（Mg2+、Mn2+）5 3合成方向.6逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過程 第一階段：合成負(fù)股cDNA的大部分 第二階段：以負(fù)股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。 第三階段：完成cDNA的全部復(fù)制。.7.8.9.10乙肝病毒基因組的復(fù)制 其復(fù)制需通過逆轉(zhuǎn)錄過程經(jīng)RNA中間體實(shí)現(xiàn) ，其DN

3、A聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。.11.12 逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA DNA RNA 乙肝病毒：DNARNA DNA.13試管內(nèi)cDNA的合成 常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可代表某一特定基因。 常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：* 來自鳥類成髓細(xì)胞瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒稱為AMV-RT；* 來自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。.14.15病毒RNA復(fù)制的主要方式 1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+） 蛋白質(zhì)（酶） RNA復(fù)制 2、病毒含有負(fù)鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（-） RNA（+） 蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA（-）。 3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。

4、如呼腸孤病毒。雙鏈RNA RNA（+） 蛋白質(zhì) RNA（-） 雙鏈RNA 4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。.16討論題 如何知道DNA復(fù)制中先要有RNA引物的合成？ (原料/新合成DNA序列分析/專一核酸酶水解).17病毒的復(fù)制病毒的復(fù)制 病毒在活細(xì)胞內(nèi)，以其基因?yàn)槟０?，在酶的作用下，分別合成病毒基因及蛋白質(zhì)，再組裝成完整的病毒顆粒，這種方式稱為復(fù)制（replication)。 從病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞開始，經(jīng)過基因組復(fù)制和病毒蛋白合成，至釋放出子代病毒的全過程，稱為一個(gè)復(fù)制周期。 病毒的復(fù)制周期主要包括吸附和穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放四個(gè)連續(xù)步驟。.18復(fù)制周期復(fù)制周期.19病毒的一步生長曲線病毒的一步生長

5、曲線病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線：以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒效價(jià)為：以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒效價(jià)為 縱坐標(biāo)，繪制出的病毒特征曲線?？v坐標(biāo)，繪制出的病毒特征曲線。.20一、吸附和穿入（一）吸附（一）吸附(adsorption)分兩個(gè)階段：分兩個(gè)階段： 靜電吸附：靜電吸附：病毒體與細(xì)胞接觸，進(jìn)行病毒體與細(xì)胞接觸，進(jìn)行靜電結(jié)合靜電結(jié)合。非特異性、可逆。非特異性、可逆。1. 真正的吸附真正的吸附：病毒體表面位點(diǎn)（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）與宿病毒體表面位點(diǎn)（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）與宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)的主細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合受體結(jié)合。是決定病毒感染的真。是決定病毒感染的真正開始。正開始。.21裸露病毒的吸附裸露病毒的吸附

6、 .22囊膜病毒的吸附囊膜病毒的吸附 .23（二）穿入（二）穿入(penetration) 病毒體吸附在宿主細(xì)胞膜上后，可通過數(shù)種穿入病毒體吸附在宿主細(xì)胞膜上后，可通過數(shù)種穿入方式進(jìn)入細(xì)胞：方式進(jìn)入細(xì)胞：1.1.無囊膜的病毒無囊膜的病毒 一般經(jīng)過細(xì)胞膜吞入，稱為病毒胞飲一般經(jīng)過細(xì)胞膜吞入，稱為病毒胞飲, ,如腺如腺病毒、小病毒、小RNARNA病毒等病毒等.24病毒胞飲病毒胞飲.252. 2. 有囊膜的病毒有囊膜的病毒 囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，病毒的核衣殼直接囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，病毒的核衣殼直接 進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi) 病毒胞飲病毒胞飲: : 細(xì)胞膜吞入細(xì)胞膜吞入.26(1) 膜融合后進(jìn)入膜融

7、合后進(jìn)入.27(2) 病毒胞飲病毒胞飲.28二、脫殼二、脫殼(uncoating)(uncoating) 不同病毒脫殼方式不一，多數(shù)在宿主細(xì)胞溶酶體酶作不同病毒脫殼方式不一，多數(shù)在宿主細(xì)胞溶酶體酶作用下脫殼，釋放出基因組核酸。用下脫殼，釋放出基因組核酸。.29三、生物合成三、生物合成(biosynthesis) 病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細(xì)胞提病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細(xì)胞提供的低分子物質(zhì)合成大量的供的低分子物質(zhì)合成大量的病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白病毒核酸和結(jié)構(gòu)蛋白。 早期，根據(jù)病毒基因組轉(zhuǎn)錄成早期，根據(jù)病毒基因組轉(zhuǎn)錄成mRNA、指令合成轉(zhuǎn)錄、指令合成轉(zhuǎn)錄合成所必需的合成所

8、必需的復(fù)制酶復(fù)制酶和一些和一些抑制蛋白；抑制蛋白； 生物合成階段，病毒處于生物合成階段，病毒處于隱蔽期隱蔽期 病毒的生物合成過程可基本歸為病毒的生物合成過程可基本歸為6大類：大類：雙股雙股DNA病病毒、單股毒、單股DNA病毒、單正股病毒、單正股RNA病毒、單負(fù)股病毒、單負(fù)股RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙股病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙股RNA病毒病毒。 .30.31病毒病毒DNA早期早期mRNA早期蛋白（酶等）早期蛋白（酶等）子代病毒子代病毒DNA晚期晚期mRNA病毒結(jié)構(gòu)蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白子代病毒子子代病毒子雙股雙股DNA病毒病毒復(fù)制復(fù)制宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶.32單鏈正股單鏈正股RNARNA病毒病毒（

9、-）ssRNA親代病毒（親代病毒（+）ssRNA早期蛋白早期蛋白（+）ssRNAdsRNA復(fù)制中間型復(fù)制中間型（-）ssRNA（+）ssRNA大量子代（大量子代（+）ssRNA晚期蛋白晚期蛋白裝配子代病毒裝配子代病毒.33單股負(fù)股單股負(fù)股RNA病毒病毒病毒自身攜帶依賴病毒自身攜帶依賴RNA的的RNA多聚酶。多聚酶。親代（親代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（+）ssRNA子代（子代（-）sRNA子代病毒子代病毒多聚酶多聚酶.34逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙股雙股DNA整合至宿主細(xì)胞（前病毒）整合至宿主細(xì)胞（前病毒）mRNA病毒病毒RNA結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白裝配子代

10、病毒裝配子代病毒RNA:DNA轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶聚合酶聚合酶.35四、組裝四、組裝病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。絕大多數(shù)絕大多數(shù)DNADNA病毒均在細(xì)胞核病毒均在細(xì)胞核內(nèi)組裝內(nèi)組裝; ;RNARNA病毒和痘病毒在細(xì)胞漿病毒和痘病毒在細(xì)胞漿內(nèi)組裝。內(nèi)組裝。.36絕大多數(shù)絕大多數(shù)無囊膜病毒無囊膜病毒釋放，一次同步，破壞宿主細(xì)釋放，一次同步，破壞宿主細(xì)胞膜，細(xì)胞裂解釋放病毒顆粒，細(xì)胞迅速死亡。胞膜，細(xì)胞裂解釋放病毒顆粒，細(xì)胞迅速死亡。絕大多數(shù)絕大多數(shù)有囊膜病毒有囊膜病毒以以出芽方式出芽方式釋出時(shí)包上釋出時(shí)包上細(xì)胞核細(xì)胞核膜或細(xì)胞膜膜或細(xì)胞膜而成為成熟病毒。逐個(gè)釋出，非一次同而成為成熟病毒。逐個(gè)釋出，非一次同步，細(xì)胞死亡緩慢。步，細(xì)胞死亡緩慢。五、釋放五、釋放.37Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding .38復(fù)制周期復(fù)制周期.39思考題1 某種病毒DNA的堿基組成（摩爾百分比）如下： A=32；G=16；T=40；C=12 該病毒DNA的特點(diǎn)如何？.40思考題2 簡要說明怎樣進(jìn)行構(gòu)建cDNA文庫？ .41思考題3 組織培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞S期長達(dá)5 小時(shí)，經(jīng)放射自顯影測定DNA復(fù)制的速度是0.5微米/分，已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA全長1.2米，計(jì)算染色體