QC-FF-0039微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要點(diǎn)

1、微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制訂人/日期文件編碼：QC-FF-0039審核人/日期文件版本：00批準(zhǔn)人/日期第1頁共28頁生效日期：年月日第 份分發(fā)部門：質(zhì)量管理部、質(zhì)量控制部目的：建立微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程范圍：本規(guī)范適用于微生物限度檢查法檢查職責(zé)：質(zhì)量控制部全體人員內(nèi)容：第一部分：綜述1 .簡述細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方 法。也是評(píng)價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生 狀況的重要手段和依據(jù)。細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外均采用平板菌落計(jì)數(shù)法， 這是活菌計(jì)數(shù)的方法之一，也是目前國際上常用的一種方法。以瓊脂平

2、板上的細(xì)菌、霉 菌或酵母菌形成的一個(gè)獨(dú)立可見的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下 所生長的細(xì)菌（嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)，不包括對(duì)營養(yǎng)、 氧氣、溫度、PH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一個(gè)細(xì)菌、霉菌或酵 母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實(shí) 際為菌落形成單位數(shù)，不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌、酵母菌的個(gè)數(shù)。在進(jìn)行本法測定時(shí)，必須嚴(yán)格按本法所規(guī)定的條件操作，以免產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。2 .設(shè)備與儀器2.1 設(shè)備2.1.1 無菌室 微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的無菌室，每個(gè)無菌室應(yīng)有獨(dú)立的凈化空氣 系統(tǒng)。2.1.1.1 結(jié)構(gòu)和要求見中

3、國藥典二部無菌檢查法2.1.1.2 操作間 操作間應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空 氣應(yīng)保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于 4.9Pa。操作臺(tái)上備有電子天平，乙醇燈，火柴，乙 醇棉球，大、小橡皮乳頭等。2.1.1.3 緩沖間 緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不得微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第2頁共28頁放置培養(yǎng)箱和其他雜物。2.1.1.4 潔凈級(jí)別及檢查方法 通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測定法（參照 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮

4、游菌、和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn) 行潔凈度驗(yàn)證。沉降菌數(shù)測定（法）無菌室操作臺(tái)消毒擦拭后，先啟動(dòng)層流凈化裝置30min,將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)30-35C預(yù)培養(yǎng)48h,證明無菌落生長），以無菌方式（或 經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺(tái)左、中、右各 1個(gè)，開蓋，暴露30min后將蓋蓋上。 在30-35C培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)48h,取出檢查。3個(gè)平板生長的平均菌落數(shù)不超過 1個(gè)。2.1.1.5 在每次操作前、后，用 0.1%苯扎澳俊溶液或其他消毒液擦拭操作臺(tái)及可能 污染的死角。然后啟動(dòng)層流凈化裝置，同時(shí)用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2 陽性菌試驗(yàn)應(yīng)另設(shè)單獨(dú)的凈化工作臺(tái)，不得在供試品

5、檢驗(yàn)用的無菌室內(nèi)或凈化 工作臺(tái)上操作。2.1.3 無菌室與洗刷、滅菌消毒、培養(yǎng)、結(jié)果觀察及辦公間等配套設(shè)施應(yīng)相對(duì)集中， 布局合理，避免污染，便于管理。2.2 儀器2.2.1 恒溫培養(yǎng)箱（30-35C）、生化培養(yǎng)箱（20-25C）、微波爐、勻漿儀（3000-8000r/min） 或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱（250-300C）、電冰箱、離心機(jī)、離心管、0.45 pm濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器（使用時(shí)要進(jìn)行生物指示劑滅菌效果檢查并應(yīng)定期 請(qǐng)有關(guān)部門檢定）。菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（1500x）、電子天平或天平（感量 0.1g）,系 列比色計(jì)。2.2.2 玻璃器皿錐形瓶（250-300ml,內(nèi)裝玻

6、璃珠若干；500ml, 1000ml）、培養(yǎng)皿（直 徑 9cm）、量筒（100ml, 500ml）、試管（18mrniX 18mm 28mnriX 198mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01, 10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）、注射針頭、載玻片、蓋玻片、 玻璃消毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水 滴，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距處塞入約2cm適宜疏松的棉花，置吸管筒內(nèi)或牛皮 紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加硅膠塞或棉塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用 玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于高壓 蒸汽1

7、21c滅菌30min,烘干或160c干熱滅菌2h,備用。2.2.3 用具大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）。無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用也可用 一次性無菌衣、帽、口罩、手套。接種環(huán)（白鉞金或鍥銘合金，環(huán)徑4-5mm、長度6-10cm）、 乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌銀子、滅菌鋼錐、滅菌稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第3頁共28頁樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3 .試液、稀釋劑和試劑3.1 試液3

8、.1.1 0.1%苯扎澳俊溶液或其它適宜消毒液（供洗手、擦拭操作臺(tái)面用）。3.1.2 5%石碳酸溶液或其他適宜消毒液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌 吸管用）。3.1.3 75%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2 稀釋劑和試劑稀釋劑配制后，高壓蒸汽滅菌法滅菌。3.2.1 0.9%無菌氯化鈉溶液。3.2.2 PH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液。3.2.3 無菌聚山梨酯80氯化鈉一溶液。3.2.4 PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液。3.2.5 PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液按藥典附錄 配制后，過濾，分裝，滅菌。3.2.6 0.1%無菌氯化三苯四氮口坐溶液（TTC）。3.2.7 PH7.2無菌磷

9、酸鹽緩沖液。4 .培養(yǎng)基4.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉豚葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.2 培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基PH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配制時(shí)瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純 以上。4.3 配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀。如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。4.4 培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3,以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊， 以免松動(dòng)或脫落造成染菌。4.5 培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。4.6 滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25C ,防止被污染，可在三周內(nèi)用畢；保存于密閉 容

10、器中，可在一年內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時(shí)間不宜過長，以免水分散失及染菌。4.7 用水浴或微波爐加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接溶化瓊脂培養(yǎng)基，以免營 養(yǎng)成分過度受熱而破壞。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，剩余培養(yǎng)基不宜再用。培養(yǎng)基不微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第4頁共28頁能反復(fù)加熱溶化。5 .供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量5.1 抽樣5.1.1 一般采用隨機(jī)抽樣方法，其抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的 3-5倍量（以備復(fù)試或留樣觀察）。5.1.2 抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異常或可疑的樣品，應(yīng)選取有疑問的樣品。機(jī)械損傷、明顯 破裂的包裝不得作為樣品。5.1.

11、3 凡藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀長蛾、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品， 可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗(yàn)。5.2 保存5.2.1 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)的污 染菌因保存條件不妥導(dǎo)致死亡，損傷或繁殖。5.2.2 供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作 為供試品。5.3 檢驗(yàn)量5.3.1 所有劑型的檢當(dāng)量均需取自2個(gè)以上包裝單位（中藥蜜丸需取自4丸、膜劑取 4片以上）。5.3.2 固體及半固體（黏稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。5.3.4 液體制劑檢驗(yàn)量為10ml。5.3.5 膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗(yàn)量為25cm2（

12、中藥膜劑較厚，不宜取量過多）， 化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗(yàn)量為50cm2 o5.3.6 特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不 低于3g ,液體制劑采用原液者不得少于 6ml,采用供試液者不得少于 3ml,外用藥品 不得少于5g。5.3.7 要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml。5.3.8 包裝材料，除另有規(guī)定外具檢驗(yàn)量 20 cm2。6 .試驗(yàn)準(zhǔn)備6.3 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管、量筒、稀釋劑 等經(jīng)傳遞窗移至無菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免 操作中出入無菌間。編號(hào)后將全部外包裝（牛皮紙）去

13、掉。6.4 .開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作不低于30min。6.5 關(guān)閉紫外殺菌燈后，操作人員用肥皂洗手，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用 0.1%微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第9頁共28頁苯扎澳俊溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。6.6 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、 盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)銀或剪將供試品啟封。7 .供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。如使用了乳化 劑、分散劑、中和劑或滅活劑，其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)

14、微生物的生長和存活無影 響性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45c , 30min。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：7.3 液體供試品 取供試品10ml,加 無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液至100ml,混勻， 作為供試液。油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯 80使供試品分散均勻，然后再加0.9% 無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液至100ml?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。7.4 固體、半固體或黏稠液供試品 取供試品，加0.9%無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液 至100ml,用勻漿儀或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山 梨酯80,并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻

15、。蜜丸等需剪碎，放入勻漿杯。7.5 非水溶性供試品軟膏、乳膏劑 先將已備妥滅菌的含司盤、單硬脂酸甘油脂、聚山梨脂80的混合 物融化，待冷至45c時(shí)，加入供試品5g （或5ml）,立即用玻棒攪拌均勻，分次少量慢 慢加入45c的PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液80ml,邊加邊攪拌，使供試品充分乳 化，作為1:20供試液。7.3.2 油齊1J取供t品10ml,加入無菌聚山梨酯，搖勻，再加入0.9%無菌氯化鈉一 蛋白陳緩沖液至100ml7.3.3 栓劑稱取供試品10g ,置滅菌錐形瓶中，加適量PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳 緩沖液，置45c水浴保溫10min,使溶，加入無菌聚山梨酯 80,振搖使之乳化

16、，再加 PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖7?。ㄏ♂寗┖途凵嚼骢?80總量為100ml ）,搖勻。7.3.4 眼膏劑取供11t品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法選用孔徑為 0.22 m）的脂溶性濾膜，以薄膜過濾法過濾除菌。濾器在140c干熱滅菌2小時(shí)，然后加入45c的PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液100,振搖5-10min,萃取，待油水明顯 分層，取其水層作為供試液。7.4 非水溶性膜劑供試品 化學(xué)藥膜劑一般取樣為100cm；置滅菌錐形瓶中，加入 適量的PH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液，于45c水浴中保溫，浸泡，振搖，以供試品 浸液作為供試液。中藥膜劑取，剪碎，加適量的PH7

17、.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液（通 常加1ml或2ml ）,浸泡,振搖，以供試品浸液作為供試液。7.5 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品10g,腸溶制劑加PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液 至100ml,結(jié)腸溶制劑加PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml,均置錯(cuò)誤！未找到引用源。 水 浴中，振搖，使溶解，作為供試液。7.6 氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約 1h。取出，速消 毒供試品容器的開啟部位周圍，用無菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn) 動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的PH7.0氯化鈉無菌一蛋白凍緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌

18、聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。7.7 茶劑 取供試品10g,置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml,振搖2-3min,以滅 菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取 2袋，以稱樣結(jié)果按1:10加稀釋劑，浸泡30min）以上供試品如吸水膨脹，或黏度過高，可增加稀釋劑的量，制成1:20-1:100供試液。7.8 具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后， 再依法檢查。常用的方法如下：7.8.2 稀釋法 取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品 含量減少至不具抑菌作用。用平板法測定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分

19、注多個(gè)平皿；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。7.8.3 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液，3000r/min離心20min,棄去上清液， 留底部集菌液約 2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。如供試液中有不溶顆粒、沉淀，先以 500r/min,離心5min,留離心沉淀物，取全部上清液按上述高速再離心，留底部集菌液 約2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。7.8.4 薄膜過濾法見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) 。7.8.5 中和法 凡含汞、種或防腐劑等的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化、中和其抑菌 活性，制成供試液。7.9 包裝材料供試品取試樣用開孔面積為20cm2的消毒過的金屬模板壓

20、在內(nèi)層表面上，將無菌棉簽用氯化鈉注射液稍沾濕，在板孔范圍內(nèi)擦抹5次，換1支棉簽再擦抹5次，每個(gè)位置用2支棉簽共擦抹10次，共擦抹5個(gè)位置100 cm2。每支棉簽?zāi)ㄍ旰罅?即剪斷（或燒斷），投入盛有30ml無菌生理鹽水的錐形瓶（或大試管）中。全部擦抹棉 簽投入瓶中后，將瓶迅速搖晃1分鐘，即得供試液。8 .供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法）8.3 取3-4支滅菌試管，分別加入9mlPH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液。加稀釋劑 后，試管塞應(yīng)立即塞上。8.4 另取1支1ML滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml ,加入裝有9mlPH7.0無菌氯化 鈉一蛋白凍緩沖液的試管中，（此時(shí)操作一般為左手執(zhí)試管并將塞打

21、開，傾斜，右手執(zhí) 10ml吸管吸量。切勿在乙醇燈焰峰的正上方操作，以免燈焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅） 混勻，即1:100;供試液。以此類推，根據(jù)供11t品污染程度，可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級(jí)（3-4）。每遞增 稀釋級(jí)，必須另換一支吸管。在作 10倍遞增稀釋時(shí)，吸管 插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm,反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管 上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁，調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面），緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液 體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。9 .計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證由于某些供試品具有抗菌活性，在建

22、立測定方法或原測定法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變 時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn) 證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn) 菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。9.3 驗(yàn)證用菌株 大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽抱桿菌，白色念珠菌，黑曲 霉接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基； 白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h,黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改 良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng) 5-7天。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含500-1000 個(gè)cfu的菌懸液。9.4 驗(yàn)證方法 驗(yàn)證試

23、驗(yàn)分四組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試 品組和對(duì)照組試驗(yàn)的菌回收率。9.4.2 試驗(yàn)組 取最低稀釋級(jí)的供試液，按每 1ml供試液加入50-100cfu試驗(yàn)菌，按 菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液分別注入平皿中，立即 傾注瓊脂培養(yǎng)基；薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液 2ml過濾，沖洗液沖洗，并在最后一次 的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。9.4.3 菌液組 取上述試驗(yàn)菌液，測定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。9.4.4 供試品對(duì)照組 取最低稀釋級(jí)的供試液1ml,按菌落計(jì)數(shù)方法測定其所含菌數(shù)。9.4.5 釋釋劑對(duì)照組為考察供試液制備過程對(duì)微生物的影響程度，可用相應(yīng)的稀釋 液替代供試液，加

24、入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50-100cfu,按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。9.4.6 試驗(yàn)組的菌回收率（）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液 組的平均菌落數(shù)X100%微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第8頁共28頁9.4.7 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（）二稀釋劑對(duì)照組白平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌 落數(shù)X 100%9.5 結(jié)果判定稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于 70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不 低于70% ,則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌或酵母菌 數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于 7

25、0%,應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌 活性，并重新驗(yàn)證。9.6 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。9.7 注意事項(xiàng)9.7.2 所用標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳彳t次數(shù)不得超過 5代。以冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種培 養(yǎng)，其培養(yǎng)物為第一代。9.7.3 黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌的抱子接種至真菌瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于 20-25CM養(yǎng)5-7大，使大量的抱子產(chǎn)生。加入 3-5ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，用無菌 玻棒或接種環(huán)輕輕將抱子洗脫。然后，用一支10ml無菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無菌棉花或紗布包扎且能過濾菌絲的裝置，吸出抱子菌液至無菌試管內(nèi)，用比濁法，將菌液 稀釋至每毫升含10-100cf

26、u。9.7.4 做試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)時(shí)，加入菌量以 50-100cfu為宜。加菌量過多，如薄膜 法，菌落擁擠，則不好計(jì)數(shù)；加菌量過少，如小于 30個(gè)，則誤差大。10檢查法10.1 平皿法10.1.1 在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該稀釋級(jí)供試液各 1ml至每個(gè)直徑90mm的滅菌平皿中，或從高稀釋級(jí)至低稀釋級(jí)吸液時(shí)可用 1支吸管吸 供試液各 至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注2-3個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi) 無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。一般取適宜的連續(xù)2-3個(gè)稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和

27、酵母菌數(shù)測定。10.1.2 陰性對(duì)照 待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取稀釋劑（PH7.0無 菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液）各1ml,分別注入4個(gè)平皿中。其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照； 另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照，如另用 ypd瓊脂測定酵母菌數(shù)時(shí)，則再增加2個(gè)平 皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)照。10.1.3 傾注培養(yǎng)基：將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌 計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌） 和瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）溶化，冷至約 45c時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml,以順時(shí)針微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：0

28、0第11頁共28頁或逆時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，置操作平臺(tái)上待凝。在 旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。10.1.4 培養(yǎng)：一般細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于 30-35 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。霉菌、酵母菌 計(jì)數(shù)平板倒置于20-25C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120ho10.1.5 菌落計(jì)數(shù)10.1.5.1 一股將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯 以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細(xì)菌菌落、 霉菌菌落和酵母菌菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的鑒別。必要時(shí)用 放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。10.1

29、.5.2 供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌、霉 菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形 態(tài)。10.1.5.3 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物， 經(jīng)過培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多的有形物，且難與菌落相鑒別。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可 在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)的供試液多增加注皿（1-2個(gè)平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照?；蛴?0.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后 該培養(yǎng)基生長的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落和區(qū)分其他有形物。有 些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂

30、注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認(rèn)和 點(diǎn)計(jì)，為防止這種情況，也可用 錯(cuò)誤！未找到引用源。 營養(yǎng)瓊脂注皿。10.1.5.4 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以 2個(gè)或2個(gè)以上 菌落計(jì)數(shù)；若平板生長有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無明顯界線時(shí)，一條鏈、片 作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈（片）狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分 別計(jì)數(shù)，若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌 落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。10.1.5.5 若各稀釋級(jí)2個(gè)平板菌落的平均數(shù)在15以上，同稀釋級(jí)二平板菌落數(shù)相差 1倍時(shí)，該稀釋級(jí)菌落數(shù)不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)；當(dāng)2個(gè)平板菌落均數(shù)在

31、15（含15）以下時(shí)， 兩個(gè)平板菌落數(shù)的差值允許范圍為0-4,1-7,2-9,3-10,4-12,5-14,6-15,7-17,8-18,9-19,10-20.超出以上范圍即視為操作誤差，不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)。10.1.5.6 菌落生長呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌，霉菌需逐日作初步點(diǎn)計(jì)，在點(diǎn)計(jì)霉菌菌落 時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的抱子散落在平板的其他部位，又萌 生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。10.1.5.7 在48h點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，120h點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌落極小，不易辨認(rèn)，可延長培養(yǎng)微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第10頁共28頁時(shí)間至7天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。1

32、0.1.5.8 對(duì)有疑議的供試品以YDP培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌 落數(shù)。10.1.5.9 含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YDP瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)酵母菌數(shù)。兩者計(jì)數(shù)值合并報(bào)告。10.1.5.10 在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長有霉菌和酵母菌其數(shù)量多于玫瑰 紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長的霉菌和酵母菌，或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌數(shù)多于營 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌數(shù)，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)報(bào)告結(jié)果。10.1.5菌數(shù)報(bào)告規(guī)則宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)在 30-300之間、霉菌平均菌落數(shù)在30-100之間的 稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。10.1.6.1 當(dāng)僅有

33、1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。10.1.6.2 當(dāng)有2個(gè)相鄰稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值（比值二（高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)）/（低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)）而定。若比值小于或等 于2,以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過5時(shí),以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)出現(xiàn)比值大于5,甚至高稀釋級(jí)的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行 方法的重新驗(yàn)證10.1.6.3 當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于 30,以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù).10

34、.1.6.4 如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長，但 平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以小于10報(bào)告菌數(shù)。10.2 薄膜過濾法10.2.1 取濾膜孔徑不大于0.45 pm,直徑不小于50mm可拆卸的濾器。根據(jù)供試品 及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。 使用時(shí)， 必須保證濾膜在過濾前后的完整性。10.2.2 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，具濾 膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液 及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾 膜每次沖洗量為10

35、0ml,沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過 濾量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第11頁共28頁10.2.3 每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液直接過濾，或加至適量稀釋劑 中，混勻，過濾。若供試品1g或1ml含菌較多，可選適宜稀釋級(jí)的供試液 ，過濾。用 PH7.0無菌氯化鈉一蛋白陳緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊膽培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基或酵母浸出粉豚葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 濾膜貼

36、于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長。10.2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋劑1ML同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照 不得有菌生長。10.2.5 培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不多于 100個(gè)。如菌落數(shù)超過100個(gè)，不便計(jì)數(shù)時(shí)，可取高稀釋級(jí)的供試液同法操作，點(diǎn)計(jì)濾 膜上的菌落數(shù)。10.2.6 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告；若濾膜上無菌落生 長，以 1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或 1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告 菌數(shù)。10.3 培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級(jí)供試液（原液或1:10供試液）2份，每份各1ml,分別注入5個(gè)或5個(gè)

37、 以上平皿中（每皿0.2ml或 0.2ml）,每1個(gè)平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約 15ml,混勻， 凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液等量分注5個(gè)或5個(gè)以上平板點(diǎn)計(jì)的菌落數(shù) 之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均數(shù)乘 以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。10.4 結(jié)果報(bào)告10.4.1 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。10.4.2 菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。10.5 復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨 機(jī)重新取2倍包裝量的供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩次，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的均值報(bào)告。若 3次結(jié)果的

38、平均值不超過該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；否則，判供試品不符 合規(guī)定。11.注意事項(xiàng)11.1 供試品檢驗(yàn)全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時(shí)，不能接觸可能污 染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。11.2 供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過小時(shí)。否則，可能導(dǎo)致微生物微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第12頁共28頁繁殖或死亡而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。11.3 供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)振搖后取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。11.4 為避免細(xì)菌菌落蔓延生長，宜采取下列方法處理：11.4.1 開蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化工作臺(tái)上，開機(jī)后合蓋

39、， 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。11.4.2 換陶瓦蓋 將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。11.4.3 加TTC于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml （最終濃度為0.001%）,混勻后傾注平皿。12檢驗(yàn)報(bào)告書寫本品按中國藥典微生物限度檢查法檢驗(yàn)，結(jié)果符合或不符合規(guī)定。第二部分：控制菌檢查1 .方法驗(yàn)證在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果 的準(zhǔn)確性時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按各供試品 微生物限度項(xiàng)下的規(guī)定（給藥途徑）選擇相應(yīng)的菌株，并按供試液的制備和控制菌檢查 法所規(guī)定的方法進(jìn)行。2 .儀器、設(shè)備

40、及用具見各控制菌檢查項(xiàng)下。3 .試液、指示液見各控制菌檢查項(xiàng)下。4 .培養(yǎng)基見各控制菌檢查項(xiàng)下。5 .驗(yàn)證用菌株及菌液制備5.1 菌種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生抱梭菌。5.2 菌液制備分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單 胞菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，各接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36c ±1C培養(yǎng)18-24h,取均勻培養(yǎng)物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10-100cfu的菌 懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試驗(yàn)的同時(shí)用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。生 抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)

41、18-24小時(shí)。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含10-100cfu的菌液。6 .供試液的制備見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) 77 .驗(yàn)證方法7.1 試驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及10-100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第19頁共28頁檢查法進(jìn)行檢查。驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌。當(dāng)采用薄膜 過濾法時(shí)，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，沖洗后，取出濾膜接種到增菌培養(yǎng)基中。7.2 陰性對(duì)照組設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌

42、采用金黃色葡萄球 菌：驗(yàn)證銅綠單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì) 照菌不得檢出。8結(jié)果判定 陰性對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制 備法和控制菌檢查法作該供試品的控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)參照細(xì)菌、 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.8具抑菌活性的供試品項(xiàng)下操作，以消除供試品的抑菌活性。建立 新的方法，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。第三部分：大腸埃希菌檢查1簡述大腸埃希菌即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌個(gè)種。大腸埃希菌 是人和溫血?jiǎng)游锬c屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫竣埃希菌等道內(nèi)的棲居菌，隨糞 便排出體外。

43、在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即 可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢 查大腸埃希菌。用4一甲基傘形酮葡糖甘酸(MUG)和靛基質(zhì)試驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一 項(xiàng)新技術(shù)，具檢驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG一蛋白陳培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如 MUG、試驗(yàn)為陽性或陰性即可報(bào)告結(jié)果。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系 統(tǒng)來鑒定目標(biāo)菌。2儀器、設(shè)備及用具2.1 無菌室參照細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) 2.1.12.2 凈化工作

44、臺(tái)。2.3 培養(yǎng)箱(36c ± 1C)。2.4 高壓蒸汽滅菌器。2.5 顯微鏡(1500X)。2.6 微波爐。2.7 恒溫水浴(45 C ± 1C )。2.8 離心機(jī)(500-4000r/min)。微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第14頁共28頁2.9 0.45卜m ± 0.02卜m薄膜及過濾器。2.10 電冰箱。2.11 勻漿儀。2.12 365nm 紫外燈。2.13玻璃器皿、器具參照細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.2.2。3試液、指示液參見中國藥典二部附錄。4培養(yǎng)基參見中國藥典二部附錄。5對(duì)照用菌液，參見控制菌檢查5.2.6準(zhǔn)備

45、1.1.1 液的制備1.1.2 液體供試品見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) 7.11.1.3 固體、半固體或黏稠液供試品見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.2。1.1.4 非水溶性供試品見細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.31.1.5 含抑菌成分供試品 供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌，不能檢出時(shí)， 表明供試品有抑菌活性。該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法 檢查。同時(shí)做陽性和陰性對(duì)照。1.1.5.1 稀釋法取規(guī)定量的供試液接種到較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至 不具抑菌作用的濃度。1.1.5.2 離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管中，3000r/min離心30min,移去上清

46、液，留底部集菌液約2ml,并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣，可先以500r/min離心5min,取全部上層液，再按上述方法集菌處理。1.1.5.3 薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入 裝有直徑約47mm、孔徑不大于0.45仙m± 0.02仙m微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi)，過濾， 用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml,將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng) 基中。1.1.5.4 中和法 取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于 100ml增菌液（含1%對(duì)氨基苯甲 酸約1-5ml）中；含神、汞類的供試品，于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中；含洗必泰供試品，于含適

47、量聚山梨酯80等表面活性劑的100ml增菌液中（表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試， 用量過大有抑菌作用）。1.1.5.5 沉降法 取規(guī)定量供試液，自然沉降5min,取上層液于100ml增菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。7 .操作步驟7.1 檢驗(yàn)程序陽性對(duì)照試驗(yàn)各供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽性對(duì)照試驗(yàn)。陽性對(duì)照試驗(yàn)的 加菌量為10-100cfu,供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的各控制菌檢查。陽性 對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在該供試品檢查時(shí)不必再做陽 性對(duì)照。陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋劑10ml加入100ml （或200ml）相應(yīng)控制菌檢查用的增 菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長

48、。7.2 增菌培養(yǎng) 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基2份，每份各100ml。1份加入10ml供試液（相當(dāng) 于供試品1g、1ml、10cm2 ），另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。 培養(yǎng)18-24 小時(shí)，必要時(shí)可延至48小時(shí)。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長。取上述培養(yǎng)物0.2ml,接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在 365nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的 培養(yǎng)基作本底對(duì)照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物 呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，MUG為陽性；不呈現(xiàn)熒光，為 MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管 壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。 本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰性。

49、如 MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出 大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.3 分離培養(yǎng) 如呈現(xiàn)MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時(shí)，應(yīng)將 上述供試品 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊 脂平板上，培養(yǎng)18-24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與中國藥典二部所列的菌 落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.4 純培養(yǎng)如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與中國藥典二部所列特征相符 或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選 2-3個(gè)以 上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng) 18-

50、24h,作以下檢查。如平板上無單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤） ，應(yīng)沾取可疑 菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于 EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18-24h, 再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。7.5 革蘭染色、鏡檢7.5.1 以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培 養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰2-3次（載玻片不燙手）固定。7.5.2 滴加結(jié)晶紫染液，染色1min,水洗。7.5.3 滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第16頁共28頁7

51、.5.4 滴加95%乙醇，脫色，水洗。7.5.5 滴加沙黃染液，復(fù)染，待干后，鏡檢。7.5.6 染色結(jié)果7.5.6.1 革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。7.5.6.2 大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7.5.7 注意事項(xiàng)7.5.7.1 玻片必須潔凈，無劃痕。涂片的菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或 連成片。不利菌細(xì)胞染色反應(yīng)判斷及形態(tài)觀察。7.5.7.2 培養(yǎng)物的菌齡以16-24h為宜。培養(yǎng)時(shí)間過長，革蘭陽性菌易染成紅色。7.5.7.3 脫色是關(guān)鍵。脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽性；脫色時(shí)間過長，菌細(xì)胞易 染成陰性。7.5.7.4 可用已知革蘭染色為陽性、陰性的菌種

52、做染色的質(zhì)量控制。8 .生化試驗(yàn)8.1 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)18-24h,觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為澳麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。?。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于出現(xiàn)陽性?；蜻m當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間。8.2 靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白陳水培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24-48h, 沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰 性。98%的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性，一般 24h即可出現(xiàn)陽性結(jié)果。常以無菌操作 先從管中取出1ml或2ml培

53、養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)陰性，余下的蛋白陳水培養(yǎng)物再培 養(yǎng)24h,作靛基質(zhì)試驗(yàn)。8.3 甲基紅試驗(yàn)（M）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)48±2h,于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液 2-3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕 微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。8.4 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V P）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖陳水 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h,于2ml培養(yǎng)液中加入。a蔡酚乙醇試液1ml,混勻，再加40% 氫氧化鉀試液0.4ml,充分振搖，在4h （通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽性，無紅色 反應(yīng)為陰性。8.5 枸

54、檬酸鹽利用試驗(yàn)（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基斜面培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基 顏色無改變、無菌苔生長為陰性。微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第17頁共28頁9 .結(jié)果判定9.1 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽性、靛基質(zhì)陽性，供試品MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陰性， 報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。9.2 MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為-+-、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供 試品檢出大腸埃希菌；MUG陰

55、性、靛基質(zhì)陽性、IMViC試驗(yàn)為+-、革蘭陰性桿菌， 報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。9.3 供試品培養(yǎng)物檢查不符合9.2中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃 希菌09.4 當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長或陽性對(duì)照未生長或生長但非大腸埃希菌，不能做出檢驗(yàn) 報(bào)告。10 .注意事項(xiàng)10.1 MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、 沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽抱菌，其 MUG為陽性。因此，在 MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽性菌的干擾。至于志賀菌、 沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長，即使有生長，本法能檢出亦判為不合格。10.2

56、 配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正PH值，滅菌后PH不得過7.4,否則PH值偏 高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝 MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白陳不得 顯熒光。10.3 培養(yǎng)時(shí)間 供試品培養(yǎng)液接種于 MUG培養(yǎng)基中，一般培養(yǎng)5h和24h要觀察是 否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長培養(yǎng)至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對(duì)底物濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇 因子的影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；PH值的改變；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾 等，對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。10.4 結(jié)果觀察 取供試品的MUG試驗(yàn)管、陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)在 366nm 紫外

57、燈下觀察，陽性對(duì)照管應(yīng)有較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光，陰性對(duì)照管無熒光。供試品 MUG 管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當(dāng)傾斜試管。如陽性對(duì)照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對(duì)照管的觀察時(shí)，亦可移去陽性對(duì)照管。10.5 藥品中污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或 麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時(shí)有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大， 務(wù)必挑選個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)鑒別，挑選菌落越多，檢出陽性菌的機(jī)率越高， 如僅挑選一個(gè)菌落做IMViC試驗(yàn)鑒別，則易漏檢。微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第18頁共28頁10.6 在IMViC試驗(yàn)中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸檬酸鹽瓊脂斜面上， 然后接種于蛋白陳水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸檬酸鹽 瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。枸檬酸鹽利