實(shí)驗(yàn)一蔗糖酶活力測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)一 蔗糖酶活力測(cè)定一、目的要求 了解蔗糖酶的性質(zhì)及3,5二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖酶活力的實(shí)驗(yàn)原理，熟練掌握其測(cè)定方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理 蔗糖酶（sucrase, ec 3.2.1.26）又稱轉(zhuǎn)化酶，蔗糖在其作用下，水解為d葡萄糖與d果糖。酵母細(xì)胞含豐富的蔗糖酶（胞內(nèi)酶），細(xì)胞破壁后釋放出來的蔗糖酶可以從果糖末端切開蔗糖的果糖糖苷鍵，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是還原糖，其含量可通過3,5二硝基水楊酸比色法測(cè)定，從而度量酶活力的大小。蔗糖酶活力定義為：在35實(shí)驗(yàn)緩沖液條件下，每3min釋放1mg還原糖的酶量為1酶活單位。由于蔗糖酶在堿性條件下極易失活，所以可用堿終止酶解反應(yīng)。3,

2、5二硝基水楊酸定糖法實(shí)驗(yàn)原理：利用3,5二硝基水楊酸溶液和還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在520nm波長處有最大吸收峰，在一定范圍內(nèi)其吸光度與還原糖含量呈線性關(guān)系，可用于還原糖含量測(cè)定。三、試劑和儀器（一） 試劑 1、3,5二硝基水楊酸試劑（dns）。 甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml 10%naoh，并用水稀釋至69 ml，在此溶液中加6.9 g nahso3。 乙液：稱取255 g酒石酸鉀鈉置于300 ml 10%naoh中，再加入880 ml 1%3,5二硝基水楊酸溶液。將甲、乙兩溶液混合即得到顏色呈黃色的使用液，貯于棕色瓶中，室溫下放置710天后使用。 1、葡萄糖標(biāo)

3、準(zhǔn)使用液（1mg/ml）：稱取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 ml。2、5%蔗糖溶液：稱取5.00 g蔗糖用ph5.5 0.1mol/l 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配置成100 ml。 3、1mol/l naoh。(二)儀器 1、電熱恒溫水浴鍋。 2、721分光光度計(jì)。1、 秒表或手表。四、操作方法 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備試管號(hào)012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)00.150.30.450.600.75葡萄糖含量（mg）00.150.30.450.600.75 水 (ml)1.00.850.700.550.400.25dns試劑（ml)1.51.51.51.51.51.5 搖勻，于沸水浴

4、中加熱5min，迅速冷卻，加水定容至25mla520nm使用1cm比色皿，在520nm波長條件下，以試劑空白條零，測(cè)定各管吸光值。用坐標(biāo)紙繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；或用回歸法計(jì)算求出以a520nm值為自變量，葡萄糖含量(mg)為因變量的直線方程。 2、蔗糖酶活力測(cè)定吸取稀釋的供試酶液2.0ml于試管1中，再加1ml 1mol/l naoh滅酶，作為對(duì)照管。另取稀釋酶液2.0ml于試管2中，然后將1、2號(hào)試管及5%蔗糖試劑放入35水浴中預(yù)熱10min。然后分別吸2.0 ml經(jīng)預(yù)熱的5%蔗糖溶液加入試管1，2中，立即記時(shí)，酶促反應(yīng)3 min，再向試管2加入1mol/l naoh 1ml滅酶，搖勻。取適量的酶促

5、反應(yīng)液，用測(cè)定葡萄糖含量的dns試劑定糖法，以0號(hào)管調(diào)零，測(cè)定酶促反應(yīng)液a520nm值，與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，求出酶促反應(yīng)液中還原糖含量。作2次平行試驗(yàn)。五、 結(jié)果計(jì)算蔗糖酶活力（u/ml）= 式中：v測(cè)定時(shí)樣品的體積（ml） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：實(shí)驗(yàn)序列0號(hào)管1號(hào)測(cè)定管2號(hào)測(cè)定管對(duì)照管酶液(ml)/酶促反應(yīng)液(ml)/水(ml)dns試劑（ml)1.51.51.5搖勻，于沸水浴中加熱5min，迅速冷卻，加水定容至25mla520nm/蔗糖酶活力（u/ml）0六、問題討論定糖實(shí)驗(yàn)，不當(dāng)?shù)牟僮饕滓疠^大的誤差，所以dns試劑加入時(shí),應(yīng)盡量準(zhǔn)確無損地加至試管底部,控制沸水浴加熱反應(yīng)時(shí)間。七、思考題1、蔗糖酶活力測(cè)定時(shí)，1號(hào)對(duì)照管并無進(jìn)行酶促反應(yīng)，