沙棘果粉體外抗氧化研究

1、沙棘果粉體外抗氧化活性的研究馬寧安 耿春峰 何茂軍 魯平原（青海圣烽生物技術(shù)開發(fā)有限公司，青海 西寧 810016）摘要：采用不同方法測定沙棘果粉的抗氧化能力活性。實(shí)驗(yàn)條件下，沙棘果粉對DPPH自由基、超氧陰離子O2-、羥基自由基（·OH）、過氧化氫H2O2有較強(qiáng)的清除或抑制作用，且顯示較好的量效關(guān)系。所以沙棘果粉有效成分具有較好的抗氧化作用。關(guān)鍵詞：沙棘果粉；抗氧化；FRAP還原力；DPPH自由基；超氧陰離子；羥基自由基Study of antioxidant activity in sea-buckthorn powder（Qinghai Shengfeng biotechnol

2、ogy development co., LTD， Xining，810016）Adopting different determination methods, the activity of antioxidant capacity of sea buckthorn fruit powder was studied. Under experimental conditions, sea-buckthorn fruit powder has antioxidant capacity to DPPH, superoxide anion free radical O2 -, hydroxyl r

3、adicals ( OH), hydrogen peroxide H2O2, and shows good concentration relationship with activity of antioxidant capacity. Results show that sea-buckthorn fruit powder has good anti-oxidation active.氧在生物體內(nèi)通過單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)稱為活性氧，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等，它們可以與多元不飽和脂肪酸作用，造成脂質(zhì)過氧化，從而誘發(fā)多種慢性疾病?？寡趸瘎┠苡行宄杂苫?，延緩衰

4、老和預(yù)防疾病。目前人們把抗氧化研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了天然、高效的天然植物提取物上，因此抗氧化活性評價(jià)方法對天然抗氧化劑的研究開發(fā)至關(guān)重要。沙棘，是胡頹子科植物沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的成熟果實(shí)，又名沙棗、醋柳、黑刺。沙棘果中富含豐富的維生素、黃酮、酸酚、超氧化物歧化酶及-6多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，沙棘果具有抗衰老、清除自由基、抗輻射、提高免疫力、抗腫瘤等作用。通過噴霧干燥技術(shù)加工的沙棘果粉中含有維生素、黃酮、多糖、兒茶素等大量天然抗氧化活性成分，這些活性物質(zhì)能與鉛發(fā)生絡(luò)合作用形成低毒或無毒絡(luò)合物排出體外，對骨和肝組織有明顯促排鉛作用，能抗氧化

5、和消除細(xì)胞膜上自由基，可以減少機(jī)體的氧化損傷，是天然的抗氧化劑。本試驗(yàn)以沙棘果粉為原料，測定其主要功效成分的含量并以化學(xué)測定方法評價(jià)沙棘果粉抗氧化活性評價(jià)體系，從FRAP（Ferric reducing antioxidant potential Assay）總的抗氧化能力、清除DPPH自由基、清除O2-、抑制·OH等研究沙棘果粉的抗氧化效果，為沙棘果粉活性成分的綜合利用提供依據(jù)。材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)原料 沙棘粉1.1.2試驗(yàn)試劑 DPPH（1，1二苯基三硝基苯肼）、沒食子酸丙酯（PG）、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵

6、氰化鉀、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、無水乙醇等1.1.3試驗(yàn)儀器 分光光度計(jì)，PHS-25數(shù)顯pH計(jì)，TDD5M型低速離心機(jī)。1.2試驗(yàn)方法1.2.1活性成分提取稱取2.00沙棘果粉蒸餾水浸泡30min（料液比1:16（m/v）超聲提取30min，室溫提取2次4000r/min離心5min合并上清液蒸餾水補(bǔ)重低溫避光，待用。1.2.2總抗氧化活性的測定磷鉬絡(luò)合物法配制濃度分別為 1、2、3、4、5mg/mL 的樣品溶液、PG 溶液。在 10mL 比色管中，分別加入 4.0mL 磷鉬試劑液、0.4mL 樣品液，95水浴中恒溫 90min，用紫外可見分光光度計(jì)在 695nm 波長下測吸光度 A。所有測

7、定平行進(jìn)行 3 次，取平均值。1.2.3沙棘粉乙醇提取物還原力測定取不同濃度乙醇提取液2.5，其中加入pH為6.6、濃度為0.2mol/L的磷酸緩沖液2.5mL、的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻后在50水浴加熱20min，取出迅速冷卻至室溫后添加10三氯乙酸2.5 mL，以4000/min離心5min，吸取上清液5.0滴加1.0 mL 0.1三氯化鐵、4.0 mL蒸餾水，振蕩混勻，15min后于700nm測其吸光度值，重復(fù)試驗(yàn)3次。1.2.4對羥自由基的清除率測定1.2.4.1 水楊酸法 鑒于Fe氧化HO產(chǎn)生的·OH氧化水楊酸生成的有色體系在510nm處有最大吸收，當(dāng)加入清除

8、3;OH的物質(zhì)時(shí)，會(huì)與水楊酸競爭·OH，減少有色物質(zhì)生成，降低吸光度值。利用此原理，本試驗(yàn)操作為：吸取不同濃度乙醇提取液2.0mL，其中加9.0mmol/L的FeSO2.0 mL、9.0mmol/L水 楊 酸乙 醇 液2.0 mL、8.8 mmol/L的HO2.0 mL、蒸 餾 水2.0 mL，37水浴30min后在510nm波長測吸光度值；用蒸餾水代替HO，得本底吸收值0，蒸餾水代替乙醇提取液，得空白值0；該試驗(yàn)以蒸餾水做參比，重復(fù)試驗(yàn)次。羥自由基清除率計(jì)算公式：清除率（）0（0）/0×1001.2.4.2結(jié)晶紫法結(jié)晶紫分光光度法測·OH基本原理是：H2O2和F

9、e2+發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。·OH容易進(jìn)攻高電子云密度點(diǎn)，會(huì)與結(jié)晶紫中具有高電子云密度的C=C基團(tuán)發(fā)生親電加成反應(yīng)，而使結(jié)晶紫褪色。通過測定結(jié)晶紫吸光度值的變化可間接測定出·OH的生成量。由樣品儲(chǔ)備液配制濃度為 1mg/mL 的樣品溶液。在 10mL 比色管中分別加入 0.3mL 結(jié)晶紫、1.2mL FeSO4溶液和 0.6mLH2O2溶液。用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(pH4.0)定容到 10mL 并搖勻，放置 30min 后，在 580nm處測其吸光度 Ab(不加 H2O2時(shí) 580nm 處的吸光度為 A0)。則羥自由基的產(chǎn)生量可以用 A=Ao-Ab

10、來表征。表觀抗羥自由基氧化率的測定：在上體系中加 H2O2之前加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL 的樣品溶液，測定其吸光度 As，則表觀抗羥自由基氧化率 S 可以根據(jù)下述公式計(jì)算。S(%)=(ASAb)/(A0Ab)×1001.2.5對超氧陰離子的清除率測定。本試驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法：吸取p8.34、濃度為50mmol/L的Tris-HCL溶液4.5mL，不同濃度乙醇提取液1.0mL，混勻，37水浴10min，然后分別加入0.5mL 6mmol/L鄰苯三酚溶液反應(yīng)5min，最后加入濃度為0.1mol/L鹽酸溶液1.0mL終止反應(yīng)經(jīng)波長掃描，試液在326nm波長處有最大

11、吸收，測得其吸光度值；用重蒸水代替乙醇提取液，得空白值；用重蒸水代替鄰苯三酚溶液得本底吸收值；重復(fù)試驗(yàn)次。超氧陰離子清除率計(jì)算公式：清除率（）（）/×1.2.6對自由基的清除率測定是一種穩(wěn)定的人工合成自由基，具有典型紫色，在517處有最大吸收，當(dāng)它與提供個(gè)電子的自由基清除劑作用時(shí)生成無色產(chǎn)物，紫色變淺。試驗(yàn)操作過程如下：吸取濃度為0.1mg/mL儲(chǔ)備液4.0mL，不同質(zhì)量濃度乙醇提取液1.0mL混 勻，于 室 溫 避 光 顯 色30min，在517nm處測得吸光度值；用50的乙醇代替提取液，測得吸光度值；吸取4.0mL乙醇提取液，50乙醇1.0mL，測得吸光度值；重復(fù)試驗(yàn)次。自由基清

12、除率計(jì)算公式：清除率（）（）/×1.2.7過氧化體系中抗氧化活性(AOA)的測定配制濃度分別為 1、2、3、4、5mg/mL 的樣品溶液、PG 溶液。選用 1:25 的卵黃懸液并吸取 0.2mL，加入樣品液 0.6mL，加入 FeSO4溶液，用 PB 補(bǔ)充至 2.0mL，37培養(yǎng) 12h，取出后加三氯乙酸(TCA)，靜置離心后吸取 2.0mL 上清液加入 TBA(硫代巴比妥酸)，加塞，放入沸水浴中 15min，冷卻后，于 532nm 處比色測定吸光值(A)，對照管除不加提取液外，其它試劑同前，所測吸光值為 A0，空白管調(diào)零，樣品及 PG 對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率（AOA）可以根

13、據(jù)下述公式計(jì)算。AOA(%)=(AOA)/A0×1002.結(jié)果討論與分析2.1總抗氧化活性的測定沙棘果粉總抗氧化活性測定結(jié)果見圖1。樣品水溶液的抗氧化活性大于PE溶液的抗氧化活性（p0.05），樣品乙醇溶液的抗氧化活性大于PE溶液的抗氧化活性（p0.01）。由樣品在水溶液中的抗氧化性優(yōu)于在乙醇溶液中（p0.05），樣品抗氧化能力隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)。圖1 沙棘總抗氧化活性測定結(jié)果2.2還原力的測定沙棘粉還原力的測定結(jié)果見下圖，由圖可見，沙棘粉的還原力隨著濃度的增加還原力增加。圖2 沙棘粉還原力測定結(jié)果2.3對羥自由基的清除率測定2.3.1水楊酸法采用水楊酸法測定沙棘粉自由基清除率

14、的結(jié)果見圖3, 沙棘果粉對羥基自由基具有較強(qiáng)的清除作用，濃度在1mg/mL5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率從15.43%增加到59.29%，呈現(xiàn)濃度依賴性。圖3 水楊酸法測定沙棘粉自由基清除率的結(jié)果2.3.2結(jié)晶紫法 采用結(jié)晶紫法測定的沙棘粉自由基清除結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，沙棘果粉濃度在0.05mg/L時(shí)，清除率最大為27.10%。圖4 結(jié)晶紫法測定的沙棘粉自由基清除結(jié)果2.4對超氧陰離子的清除率測定沙棘粉清除超氧陰離子的試驗(yàn)結(jié)果見圖5，由圖5可見，沙棘果粉對超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除作用，在1mg/mL5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率從13.91%增加到70.43%，呈現(xiàn)濃度依賴性。圖5沙棘粉

15、清除超氧陰離子的試驗(yàn)結(jié)果2.5對DPPH自由基的清除率測定沙棘粉對DPPH自由基清除率的試驗(yàn)結(jié)果見圖6，由圖6可見沙棘果粉對DPPH有較強(qiáng)的清除作用，在濃度3mg/mL時(shí)清除率最高為69.95%，隨后隨濃度增加，清除率沒有明顯的增加趨勢。圖6沙棘粉清DPPH自由基的試驗(yàn)結(jié)果2.6過氧化體系中抗氧化活性的測定沙棘粉在過氧化體系中的抗氧化活性測定結(jié)果見圖7，由圖7可見，沙棘粉對對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化物的抑制率可達(dá)到43%，隨濃度的增加，抑制率沒有明顯改變。圖7沙棘粉對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化物的抑制率3. 結(jié)論采用不同方法測定沙棘果粉的抗氧化能力活性。實(shí)驗(yàn)條件下，沙棘果粉對DPPH自由基、超氧陰離子O2-、羥基自由基（·OH）、過氧化氫H2O2有較強(qiáng)的清除或抑制作用，整體