細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實(shí)驗(yàn)論文 年級(jí)：2012級(jí)師范2班 姓名：田金梅 學(xué)號(hào)：222012317011114 指導(dǎo)老師：魏玲人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與染色體核型分析（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 重慶400715）摘要：細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學(xué)中發(fā)展十分迅速的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有利于我們掌握一種非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。本次實(shí)驗(yàn)通過用人體外周血淋巴細(xì)胞為材料，進(jìn)行PHA處理然后再37下培養(yǎng)72小時(shí)，并在離培養(yǎng)終止34小時(shí)添加秋水仙素處理，然后經(jīng)過低滲離心固定的反復(fù)操作，將細(xì)胞收集以及處理成合適的裝片，然后通過冰片滴片的方式，再由Gemesa染液染色，再鏡檢，找到含46條染色體合適的細(xì)胞，再用顯微拍

2、照技術(shù)拍照，得到的圖片經(jīng)過簡(jiǎn)單處理，剪切，并測(cè)量數(shù)據(jù)，最后得到核型分析圖譜。關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；PHA；人體外周血淋巴細(xì)胞；染色體裝片制備; 核型分析綜述：細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學(xué)中發(fā)展十分迅速的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實(shí)驗(yàn), 它為細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)的研究和應(yīng)用做出了重要貢獻(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使期生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。近年來發(fā)展起來的核移植、細(xì)胞雜交、DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以及一些物理圖譜的建立，也都需要與細(xì)胞

3、培養(yǎng)緊密結(jié)合【12】。人的1ml外周血約含有1×10*63×10*6個(gè)小淋巴細(xì)胞，它們幾乎都處于G0或G1期，一般情況下不分裂，但但采用人工離體培養(yǎng)的方法，經(jīng)PHA（植物血球凝集素）刺激后，能轉(zhuǎn)變成可分裂的淋巴母細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂。所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細(xì)胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細(xì)胞。用低滲鹽溶液（一般是0.075mol/L的KCl）處理，使其中的紅細(xì)胞及分裂相細(xì)胞膜和一部分細(xì)胞質(zhì)除去然后用Carnoy固定液固定，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體標(biāo)本。 核型（karyotype）指一個(gè)細(xì)胞中的整套染

4、色體，按其大小、形態(tài)特征順序排列所構(gòu)成的圖像。通常是將顯微攝影得到的染色體照片剪貼而成。在完全正常的情況下，一個(gè)體細(xì)胞的核型一般可代表該個(gè)體的核型。組型（idiogram)是以模式圖的方式表示，它是通過許多細(xì)胞染色體的測(cè)量取其平均值繪制成的，是理想的，模式化的染色體組成，代表一物種染色體組型的特征。將待測(cè)細(xì)胞的核型進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)特性的分析，確定其是否與正常核型完全一致，稱為核型分析（karyotype analysis）。這對(duì)于探索人類遺傳病的發(fā)病機(jī)理，探討動(dòng)物和植物的起源，以及物種間的親緣關(guān)系等都具有重要意義。1. 材料與方法1.1材料1.1.1材料：人的靜脈外周血（男女各2ml，在校

5、醫(yī)院添加肝素鈉抽取血樣）1.1.2實(shí)驗(yàn)工具：恒溫培養(yǎng)箱（1）、電冰箱（1）、高壓滅菌鍋（1）、離心機(jī)（1）、普通光學(xué)顯微鏡（7）、顯微攝影的照相機(jī)（1）、培養(yǎng)瓶（4）、離心管(4)、移液槍(2)、膠頭(4)、滴管(4)、燒杯(4)、試管架、插管(5)、試劑瓶(4),載玻片（10）。1.1.3試劑：肝素、完全RPMI1640培養(yǎng)粉、秋水仙素、0.075mol/lKCl、植物血球凝集素（PHA）、青霉素、鏈霉素、小牛血清、秋水仙素、無水酒精、冰醋酸、Giemsa粉末、甘油、甲醇、1/15 mol/L的PH為6.8的磷酸緩沖液。1.2方法1.2.1人體外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)接種和培養(yǎng)：在無菌工作臺(tái)上，

6、打開培養(yǎng)瓶的瓶塞，加入3ml培養(yǎng)基，然后再加入母液為5mg/mL PHA男1女1各加45ul使其終濃度為75ug/ml，男2女2各加50ul使其終末濃度處于83ug/ml,再向每瓶加入0.3mL血液，輕輕搖勻 ，置37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 。培養(yǎng)細(xì)胞的秋水仙堿處理：培養(yǎng)終止前3h4h將新鮮配制的50gmL秋水仙素工作液注入培養(yǎng)瓶中，每瓶40ul使其終濃度為0.6ug/ml，輕輕搖勻，放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)至72h。1.2.2制片及染色體標(biāo)本制備低滲及離心：小心從培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)后的血細(xì)胞混勻，并移至離心管內(nèi)，以1000rmin離心10min，吸棄上清液，加入8mL37 預(yù)熱的0.

7、075mmolL氯化鉀低滲液，用吸管上下吹打約10次，使細(xì)胞懸浮于低滲液中，置37 水浴箱中，溫育20min，使低滲充分。固定：低滲終止后，加入新鮮配制的卡諾固定液（甲醇：冰醋酸3:1）1mL，預(yù)固定2min ，打勻，放入離心機(jī)內(nèi)，以1000 rmin離心 8分鐘min，倒掉上清液，繼續(xù)加入固定液5mL，用吸管將沉淀的細(xì)胞輕輕吹打混合細(xì)胞懸液。室溫下靜置20min，以 1000rmin離心 8min，倒掉上清液。重復(fù)固定：再加入固定液mL，用吸管將沉淀的細(xì)胞輕輕吹打成混合細(xì)胞懸液，室溫下靜置20min ，以1000rmin離心8min，倒掉上清液 。制片：向離心管中加入固定液0.5mL，用吸管

8、輕輕吹打成混合細(xì)胞懸液。滴片時(shí)，先用吸管吸取少量細(xì)胞懸液以1.8m高的距離滴至事先冰凍的潔凈載玻片上，每片23滴，隨即對(duì)準(zhǔn)玻片吹一口氣，以協(xié)助細(xì)胞的分散，然后在乙醇燈火焰上方過火5秒，最后在烘箱中烘干。染色：將晾干的玻片標(biāo)本用Giemsa染液染色20min（用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸緩沖液），自來水緩緩沖洗玻片，并烘干，鏡檢。結(jié)果觀察：取制備好的健康人體染色體標(biāo)本，先用低倍鏡觀察，選擇染色體分散良好、無重疊的分裂中期細(xì)胞，轉(zhuǎn)換油鏡下仔細(xì)觀察分析。1.2.3染色體組型分析找好的染色體：在顯微鏡下找出染色體分散良好、長(zhǎng)度適中、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進(jìn)行顯微拍攝并確定數(shù)目：n

9、拍照分剪：將顯微拍攝放大的照片上的一個(gè)細(xì)胞的全部染色體分別一條一條剪下。 測(cè)量與計(jì)算: 將照片上的染色體進(jìn)行編號(hào), 用直尺測(cè)量每一染色體的長(zhǎng)度, 此長(zhǎng)度為其絕對(duì)長(zhǎng)度。計(jì)算每一染色體的相對(duì)長(zhǎng)度, 即每條染色體的長(zhǎng)度除以全部染色體的總長(zhǎng)度。測(cè)量染色體短臂和長(zhǎng)臂的長(zhǎng)度, 并求出其臂比, 即長(zhǎng)臂長(zhǎng)/ 短臂長(zhǎng)。將測(cè)量的數(shù)據(jù)記入表相應(yīng)欄內(nèi)配對(duì): 根據(jù)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比、次縊痕的有無和位置、形狀大小, 隨體有無, 著絲點(diǎn)位置, 將其相同表型的染色體從照片上剪下來, 將其同源染色體配成對(duì)。排列：染色體的排列通常是從大到小, 按長(zhǎng)度順序編號(hào), 等長(zhǎng)的染色體, 把短臂長(zhǎng)的放在前面, 具有特殊標(biāo)記的如具隨體的染

10、色體, 一般排在最后, 性染色體要單獨(dú)列出。分類: 以臂比數(shù)值確定著絲點(diǎn)位置, 據(jù)此可將染色體分成五種類型, 即正中部著絲點(diǎn)染色體(M ) 臂比( 長(zhǎng)/ 短) 1.0。中部著絲點(diǎn)染色體( m ) 臂比( 長(zhǎng)/短) 1.0-1.7近中著絲點(diǎn)染色體s( m )臂比( 長(zhǎng)/ 短) 1.7-3.0近端著絲點(diǎn)染色體( st ) 臂長(zhǎng)( 長(zhǎng)/短) 3.0-7.0端部著絲點(diǎn)染色體(t )臂比( 長(zhǎng)/短) 7.0 以上將所得的各項(xiàng)數(shù)據(jù)填入下列表中 組號(hào)染色體號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度形態(tài)大小長(zhǎng)臂短臂臂比類型 粘貼拍照：將配對(duì)排列好的染色體組型, 貼在白卡片紙上, 進(jìn)行拍照, 制成染色體組型圖。 注：對(duì)于任何一個(gè)染色體的基本形

11、態(tài)特征來說，重要的參數(shù)有以下3個(gè)： 相對(duì)長(zhǎng)度=單條染色體的長(zhǎng)度/(單倍體常染色體+X或Y染色體)的總長(zhǎng)度×100% 臂指數(shù)=長(zhǎng)臂/短臂（反映著絲粒位置的指數(shù)） 著絲粒指數(shù)=短臂/整個(gè)染色體長(zhǎng)度×100%（反映著絲粒位置的指數(shù)）人類體細(xì)胞的正常核型是含有23對(duì)染色體，共46條。其中22對(duì)是男女共有的染色體，一對(duì)為男女所不同的性染色體，男XY，女XX。人類染色體組型群組號(hào)染色體號(hào)形態(tài)大小著絲粒位置隨體次縊痕鑒別程度A13最大m無常見1號(hào)可鑒定B45次大sm無不易C612+X中等sm無常見9號(hào)難鑒定D1315中等st有偶見13號(hào)難鑒定E1618較小16m,17m,和18m無常見1

12、6號(hào)可鑒定F1920小m無不易G2122+Y最小st有，Y無難鑒定2. 結(jié)果分析21-22 G19-20 F16-18 E13-15 D6-12 X C13 4-5 A B 用第二組的女生圖片做的核型分析 我們組在油鏡下用相機(jī)拍的男生圖片和用它做的核型分析 女生染色體核型分析數(shù)據(jù)群組號(hào)染色體號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度形態(tài)大小臂指數(shù)著絲粒指數(shù)著絲粒位置A17.84%最大1.1247.10%MA26.65%最大0.8842.20%MA35.60%最大1.2444.70%MB45.90%次大2.3330.00%SmB54.55%次大1.5838.70%MC65.60%中等1.2444.70%MC74.70%中等1.

13、4840.60%MC84.85%中等2.330.30%SmC94.25%中等1.934.50%SmC104.10%中等1.1646.40%MC114.40%中等1.540.00%MC123.80%中等1.9234.10%SmCX5.60%中等1.5738.90%MD134.40%中等1.540.20%MD143.60%中等2.529.10%SmD153.40%中等7.512.80%StE163.70%中等tE173.05%中等1.3542.70%ME183.25%中等1.4540.80%MF192.90%小1.540.00%MF202.65%小tG212.40%最小1.3343.70%MG22

14、2.10%最小t 男生染色體核型分析數(shù)據(jù)群組號(hào)染色體號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度形態(tài)大小臂指數(shù)著絲粒指數(shù)著絲粒位置A14.20%最大1.270.442MA23.80%最大1.290.436MA33.00%最大1.140.167MB43.30%次大1.420.412MB53.30%次大2.40.294SmC62.40%中等20.033SmC72.40%中等1.40.417MCX2.10%中等1.120.455MC82.10%中等1.750.364SmC92.40%中等20.333SmC102.40%中等20.333SmC112.10%中等2.670.273SmC122.40%中等1.40.417MD131.70%

15、中等3.50.222StD142.40%中等40.2StD151.70%中等3.50.222StE161.60%中等1.660.375ME171.60%中等1.660.375ME181.40%中等1.330.429MF191.20%小20.333SmF201.40%小2.50.286SmG211.10%最小30.266SmG221.00%最小1.50.4mGY0.80%最小30.25Sm結(jié)果分析：人體正常細(xì)胞核型含46條染色體，相互配對(duì)成23對(duì)。其中22對(duì)為男女共有的常染色體。另一對(duì)男生為XY，女生為XX是男女所獨(dú)有的決定性別的性染色體。第一次我們班集體失敗的原因可能是在醫(yī)院采學(xué)的時(shí)候加的是E

16、DTA而不是肝素使得PHA的作用沒能表現(xiàn)出來，也可能是第一次老師給的PHA效價(jià)本來就不高。而第二次實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過程中每個(gè)培養(yǎng)瓶中均出現(xiàn)血細(xì)胞凝集現(xiàn)象，定期的搖動(dòng)可以將其分散。但制片后效果不是很好，我們組男生裝片的細(xì)胞數(shù)量比較少，這可能是我們組有一個(gè)同學(xué)在收集細(xì)胞第一次離心后倒上清液時(shí)把底層細(xì)胞也給倒掉了。而我們女生組有一張裝片是制得很好，細(xì)胞和分裂相也比較多的，但最后片子找不到了，所以以后有什么實(shí)驗(yàn)大家一定要注意保管好自己的材料。而另外兩三張不好的片子中有的沒有細(xì)胞只有一些藍(lán)色斑塊，可能是大家在滴液的時(shí)候沒有滴到了較邊緣位置，然后同學(xué)吹的時(shí)候又沒注意力度和方向使得上面存在的細(xì)胞不多然后洗的

17、時(shí)候片子又沒洗干凈。而對(duì)于最后的對(duì)于染色體的分布配對(duì)的數(shù)據(jù)可以看出，有的我們分析得到的數(shù)據(jù)跟理論值是有偏差的，這主要是因?yàn)樵谂鋵?duì)時(shí)由于染色體并不都以比較直的形態(tài)正對(duì)我們，而出現(xiàn)我們測(cè)量時(shí)的長(zhǎng)度不夠準(zhǔn)確，還有就是染色體不夠清晰，其著絲粒不是太容易找準(zhǔn)確包括染色體的長(zhǎng)度測(cè)量也都比較模糊，本次實(shí)驗(yàn)的隨體等更是不容易觀察，而本來有的染色體就不易區(qū)分，這就造成了我們結(jié)果的不準(zhǔn)確性。3. 討論 人體血液中的淋巴細(xì)胞是一種分化細(xì)胞，它的細(xì)胞質(zhì)很少，RNA和蛋白質(zhì)的合成速度也很慢，以致很難進(jìn)行分裂，通常情況下它們都處于間期的Gl期Go或期，故在未經(jīng)培養(yǎng)的外周血中很難見到正在分裂的淋巴細(xì)胞，但是在 PHA的刺激

18、下處于Go期的淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，重新進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行有絲分裂。培養(yǎng)基中 PHA使用量的過多或過少，將直接影響實(shí)驗(yàn)中收獲的有絲分裂期的細(xì)胞量。在使用前應(yīng)進(jìn)行進(jìn)行定量測(cè)試，僅憑經(jīng)驗(yàn)按常規(guī)量加入PHA，將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，分裂相多少相差很大，直接影響實(shí)驗(yàn)課效果【3】。 導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗的原因很多，但在培養(yǎng)條件相對(duì)恒定的環(huán)境中主要因素是抗生素類藥物的干擾其可能對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制作用。培養(yǎng)中出現(xiàn)凝血和溶血與培養(yǎng)液的PH值PHA和血中的肝素等的抗凝劑有關(guān)，凝血和溶血對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有一定影響但也有培養(yǎng)成功的所以不要放棄培養(yǎng)?？鼓?jiǎng)┑倪x擇也很重要，應(yīng)選能被直接用于人體靜脈注射的最好，比如肝素或

19、者肝素鈉，而EDTA為金屬離子螯合劑對(duì)淋巴細(xì)胞有一定毒性對(duì)溫度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)也是很重要的。秋水仙素是紡錘體的抑制劑，如果秋水仙素的使用濃度過高或使用時(shí)間過長(zhǎng)，雖然得到的細(xì)胞分裂相很多但是染色體過于的濃縮，若溶度過低或者處理時(shí)間過少則分裂相少。離心時(shí)收集細(xì)胞般離心速度是1000rmin低滲后細(xì)胞膨脹若離心速度過大會(huì)提前破裂，染色體丟失嚴(yán)重影響細(xì)胞計(jì)數(shù)和染色體核型分析【4】。 用于顯微分離的染色體標(biāo)本制備方法與常規(guī)制片基本相同, 只是固定液中酸的比率要適當(dāng)降低, 以減少酸對(duì) DNA 的破壞, 宋文芹在制片中用70%酒精取代了傳統(tǒng)的固定液。為使細(xì)胞質(zhì)背景清楚, 崔麗華等采用去壁低滲法, 提高了染色體分離

20、的效率。但無論用什么方法, 都要使染色體盡量散開, 易于識(shí)別目標(biāo)染色體【6】。 核型是根據(jù)細(xì)胞分裂中期濃縮的染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)建立的, 核型模式圖通常是將顯微拍攝的染色體照片剪貼、整理、繪制而成。不同的物種具有不同的核型, 因此核型是區(qū)別物種的基本遺傳學(xué)依據(jù),也對(duì)分子生物學(xué)的研究具有指導(dǎo)意義。對(duì)于核型分析現(xiàn)在并不停留在染色體形態(tài)分析時(shí)期，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了顯帶技術(shù)。顯帶技術(shù)主要包括熒光顯帶技術(shù)和Gimesa顯帶技術(shù)。1968年T.Q.Casperson發(fā)明了Q-帶技術(shù)。1971年，Arrighi發(fā)明了Gimesa顯帶技術(shù)。在對(duì)染色體測(cè)量和分析上也有一些新技術(shù)出現(xiàn)，如有的學(xué)者開始使用Photoshop等軟件對(duì)染色體圖片進(jìn)行處理，利用計(jì)算機(jī)的軟件大大減少了工作難度，并且提高了精確率。近年來，人類染色體的熒光顯帶技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，