基因克隆與表達finalZJJ課件

1、業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話基因的克隆與表達 張靜靜 2011-09-24業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話因克隆基因克隆(gene cloning)RACE技術(shù)服務(wù)技術(shù)服務(wù)基因表達基因表達(gene expression) -原核基因表達原核基因表達 -真核基因表達真核基因表達業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 因 克 隆 Gene Cloning業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話述概述克隆載體克隆載體受

2、體細胞受體細胞體外重組的策略體外重組的策略基因克隆工作流程基因克隆工作流程業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、概述 確定了遺傳信息的攜帶者確定了遺傳信息的攜帶者 揭示了揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機理保留復(fù)制機理 提出了中心法則和操縱子學(xué)說，破譯了提出了中心法則和操縱子學(xué)說，破譯了遺傳密碼遺傳密碼概述概述業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-587176361973年年Cohen完成第一個基因工程實驗完成第一個基因工程實驗經(jīng)經(jīng)體外重組體外重組獲得雜合獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌雜

3、合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌所需元件：所需元件： 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 連接酶連接酶 載體載體 受體細胞受體細胞業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話通過體外重組技術(shù)通過體外重組技術(shù),將一段目的將一段目的DNA經(jīng)經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導(dǎo)入受體細切割、連接插入適當載體，并導(dǎo)入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。胞，擴增形成大量子代分子的過程。基因克?。ǚ肿涌寺』蚩寺。ǚ肿涌寺olecular cloning）業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話因克隆的核心基因克隆的核心-體外重組體外重組(Recombin

4、ation) : 人工將一段目的人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。插入一個載體的過程。 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話因克隆的技術(shù)路線基因克隆的技術(shù)路線 目的基因目的基因 載體載體體外重組體外重組重組子（雜合重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化受體細胞受體細胞篩選陽性克隆篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代大量擴增，獲得子代DNA業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、克隆載體二、克隆載體復(fù)制基因復(fù)制基因(replicator)選擇性

5、記號選擇性記號克隆位點克隆位點業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、受體細胞三、受體細胞1 1、定義：外源、定義：外源DNADNA導(dǎo)入的細胞，是重導(dǎo)入的細胞，是重組體擴增的場所。組體擴增的場所。2 2、要求：易于接納外源、要求：易于接納外源DNADNA 無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶無特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 載體復(fù)制、擴增不受阻載體復(fù)制、擴增不受阻 與載體有互補性與載體有互補性業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、體外重組的策略四、體外重組的策略粘粘-粘連接：最有效、最快捷粘連接：最有效、最快捷業(yè)務(wù)員 QQ 80

6、7475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-587176364 4、T-AT-A克隆克隆 T-vectorT-vector兩條鏈的兩條鏈的55端含有一個游離的端含有一個游離的T T PCRPCR過程中，普通的過程中，普通的TaqTaq酶可在產(chǎn)物的酶可在產(chǎn)物的33端多端多加一個加一個A A業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、基因克隆的工作流程五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的獲得（一）目的基因的獲得（二）體外重組（二）體外重組（三）轉(zhuǎn)化（三）轉(zhuǎn)化Cacl2法、電擊法法、電擊法（四）重組子的篩選及鑒定（四）重組子的篩選及鑒定 1、篩選：平板法（抗生

7、素、藍白斑）、篩選：平板法（抗生素、藍白斑） 2、鑒定：長度鑒定：酶切、鑒定：長度鑒定：酶切、PCR（五五）測序）測序業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話品的要求 目標基因序列（最好附原始測序報告）；目標基因序列（最好附原始測序報告）； 克隆模板（包括：菌液、質(zhì)粒、克隆模板（包括：菌液、質(zhì)粒、PCR擴增產(chǎn)物、擴增產(chǎn)物、RT-PCR擴增產(chǎn)物、從其他質(zhì)粒上酶切得到的擴增產(chǎn)物、從其他質(zhì)粒上酶切得到的DNA片段等）及檢測片段等）及檢測結(jié)果和背景資料；結(jié)果和背景資料； 載體及其圖譜（常用載體可由我方免費提供）；載體及其圖譜（常用載體可由我方免費提供）； 注明克

8、隆要求，克隆使用的酶切位點。注明克隆要求，克隆使用的酶切位點。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話務(wù)流程 載體構(gòu)建流程為：酶切、凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測序。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話成時間 2周內(nèi)完成。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話終產(chǎn)品 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，不少于1g； 含有重組質(zhì)粒的菌株； 電泳圖譜，測序圖譜，酶切圖。 快速擴增cDNA末端 RACE業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話技術(shù)背景技術(shù)

9、背景 RACE的基本概念的基本概念 不同廠家不同廠家RACE試劑盒的介紹試劑盒的介紹 RACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 存存在的問題及解決辦法在的問題及解決辦法 最終產(chǎn)品最終產(chǎn)品的要求的要求業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話到某基因的片段、全長或近全長得到某基因的片段、全長或近全長cDNA的方法：的方法：u建立和篩選建立和篩選cDNA 和和DNA 文庫。文庫。u利用利用GenBank 數(shù)據(jù)庫中的表達序列標簽數(shù)據(jù)庫中的表達序列標簽(express sequence tags , ESTs) 拼接出全長或近全長拼接出全長或近全長cDNA 。u是多聚

10、酶鏈式反應(yīng)即是多聚酶鏈式反應(yīng)即PCR。ucDNA 末端快速擴增末端快速擴增(RACE) 技術(shù)技術(shù)。用用RNase 保護、保護、S1 核酸酶譜和引物延核酸酶譜和引物延伸等方法來保證伸等方法來保證mRMA 5末端的獲取，末端的獲取，但又需要大量的但又需要大量的mRNA。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話ACE的優(yōu)點 此方法是通過此方法是通過PCR實現(xiàn)的，無需建立實現(xiàn)的，無需建立cDNA文庫，文庫，可以在很短的時間內(nèi)獲得有利用價值的信息；可以在很短的時間內(nèi)獲得有利用價值的信息； 節(jié)約了實驗所花費的經(jīng)費和時間；節(jié)約了實驗所花費的經(jīng)費和時間； 只要引物設(shè)計正

11、確，在初級產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲只要引物設(shè)計正確，在初級產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可以獲得大量的感興趣基因的全長；得大量的感興趣基因的全長；業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話ACE的基本概念 cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法，為Frohman在1985年首次報道。 3RACE 和5RACE 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話本原理和方法基本原理和方法利用利用Oligo (dT)

12、對對mRNA 進行反轉(zhuǎn)錄的同進行反轉(zhuǎn)錄的同時在兩頭加上通用接頭時在兩頭加上通用接頭(引物引物) ，從而可利，從而可利用基因特異的引物用基因特異的引物(gene specific primer，GSP)通過通過PCR 反應(yīng)快速獲得目的序列的反應(yīng)快速獲得目的序列的5端和端和3 端。端。? T重復(fù)寡核苷酸 只有胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-587176363RACE原理示意圖業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話ACE 產(chǎn)物的鑒定和全長產(chǎn)物的鑒定和全長 cDNA 的獲得的獲得3或或5雙鏈雙鏈cDNA限制性

13、內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切克隆克隆3和和5重疊序列的重疊序列的連接連接RACE 產(chǎn)物的產(chǎn)物的3和和5末端序列的分析末端序列的分析合成相應(yīng)引物合成相應(yīng)引物PCR獲得全長獲得全長cDNA業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話品種類樣品種類樣品要求樣品要求動物、植物、微生物組動物、植物、微生物組織織提取提取Total RNA的材料要新鮮，請您采樣后的材料要新鮮，請您采樣后立即存于液氮或立即存于液氮或-80后保存不超后保存不超過一個星期過一個星期，或加入防止，或加入防止RNA降解的樣品穩(wěn)定劑，降解的樣品穩(wěn)定劑，。 RNA如要提供如要提供RNA，要求總，要求總R

14、NA50g，濃度，濃度0.50.5g/l；mRNA100n100ng，濃度濃度1010ng/l；OD260/OD280值：值：1.91.9至至2.0，以我方電泳膠圖、紫外分析儀，以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準。定量為準。如果基因的含量較低或者未知序列較長，樣品量需相應(yīng)增加。如果基因的含量較低或者未知序列較長，樣品量需相應(yīng)增加。注意：注意： a) 建議由我方提取建議由我方提取RNA；b) 對于客戶提供的對于客戶提供的RNA，由于樣品原因可能，由于樣品原因可能沒有結(jié)果或結(jié)果不好，其損失和責(zé)任全部由樣品提供方承擔(dān)；沒有結(jié)果或結(jié)果不好，其損失和責(zé)任全部由樣品提供方承擔(dān)；c)由樣品質(zhì)量產(chǎn)由樣品質(zhì)量產(chǎn)

15、生的任何問題，其損失和責(zé)任應(yīng)全部由樣品提供方承擔(dān)。生的任何問題，其損失和責(zé)任應(yīng)全部由樣品提供方承擔(dān)。樣品要求樣品要求業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話同廠家RACE試劑盒的介紹 clontech SMART RACE Invitrogen GeneRacerTM Kit BD SMARTTM RACE(Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript )業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話ACE技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)RACE 技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有2個：1. 3個連續(xù)

16、的酶促反應(yīng) （逆轉(zhuǎn)錄、TdT加尾、PCR擴增）TdT加尾反應(yīng)是用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3端 2. RACE的引物 即使3個酶促反應(yīng)均平穩(wěn)順利進行，但結(jié)果也通常會出現(xiàn)一些非特異性產(chǎn)物或非全長的產(chǎn)物背景。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話在的問題及解決辦法反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄nRNA的質(zhì)量的質(zhì)量 有高質(zhì)量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至關(guān)重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作沒有結(jié)果既浪費時間又浪費試劑，給試驗帶來麻煩。 n反轉(zhuǎn)錄提前終止反轉(zhuǎn)錄提前終止 模板中有特殊的二級結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄提前終止。通

17、過提高反轉(zhuǎn)錄的溫度，加大反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄過程中一直保持已變性的RNA模板處于50以上，避免以解開二級結(jié)構(gòu)的RNA再恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，以達到5末端。 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話ACE引物的設(shè)計引物的設(shè)計 在實驗過程中總結(jié)如下經(jīng)驗：n引物不能設(shè)計在保守區(qū)簡并引物區(qū)。n各引物之間盡量不要重疊，由于引物的重疊，會引起很嚴重的引物多聯(lián)體現(xiàn)象，不能準確地擴增。1.盡量多設(shè)計引物，以減少PCR擴增的非特異性。也可以考慮在PCR鑒定陽性克隆的時候另設(shè)計一對引物，便于鑒定的正確性。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-5871

18、7636 PCR擴增及產(chǎn)物的克隆擴增及產(chǎn)物的克隆 PCR擴增存在的問題一方面可能未找到最佳擴增條件而導(dǎo)致產(chǎn)生許多不確定的、不需要的產(chǎn)物，有時甚至沒有目的產(chǎn)物；另一方面，可能根本就沒有擴增到任何產(chǎn)物。 增加PCR擴增效率，提高擴增產(chǎn)物的特異性解決方法：n 熱啟動PCR(hotstartPCR)，長距離PCR(long distance PCR)和降落PCR(touchdown PCR)以及加大反應(yīng)體系中Mg2+的濃度提高擴增效率。1. 單引物的線性擴增問題：堅持做單引物對照，并減少引物的濃度。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話B M 1 2M 3 4

19、 M 5 6 CA：The first PCR；BC：Nest PCRM：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：5GSP332+AUAP；4,6：AUAP；5：5GSP333+AUAP圖圖 多輪多輪PCR擴增的電泳結(jié)果擴增的電泳結(jié)果Fig. Results of PCR amplified業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話圖 5RACE、3RACE克隆的片段與克隆的片段與GsAP2序列拼接序列拼接的結(jié)果的結(jié)果Fig. The contig result of 5RACE 、3RACE and GsAP2 by softwa

20、re 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話成時間完成時間 完成時間完成時間3-6周內(nèi)完成。對于有些周內(nèi)完成。對于有些RNA難以難以抽提的材料或樣品材料本身質(zhì)量問題，時抽提的材料或樣品材料本身質(zhì)量問題，時間較長，會在間較長，會在1周內(nèi)和客戶協(xié)商約定時間。周內(nèi)和客戶協(xié)商約定時間。 特殊樣品除外。特殊樣品除外。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話終產(chǎn)品最終產(chǎn)品 擴增全片段測序報告一份擴增全片段測序報告一份 擴增片段的電泳圖擴增片段的電泳圖 含未知末端片段的質(zhì)粒載體及細菌一份含未知末端片段的質(zhì)粒載體及細菌一份RAC

21、E技術(shù)應(yīng)用RACE技術(shù)主要是應(yīng)用于對全長技術(shù)主要是應(yīng)用于對全長cDNA序列的獲得，但對該技術(shù)進行一定的修改后，也可在其它方序列的獲得，但對該技術(shù)進行一定的修改后，也可在其它方面顯示出極高的應(yīng)用價值。面顯示出極高的應(yīng)用價值。RACE技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué),例如例如EST庫相結(jié)合庫相結(jié)合,具有快速具有快速,高效克隆新基因的特點高效克隆新基因的特點,為快速釣取基因家族為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路候選新成員提供新思路,如果一個基因是多基因家族的一個成員如果一個基因是多基因家族的一個成員,用基因特異引物用基因特異引物(GSP)可能同時擴可能同時擴增幾個高度同源的增幾個高度同源的Cdn

22、a.李紅等利用一條李紅等利用一條cDNA作為探針作為探針,通過通過BLASTN從從GenBank中整合出了中整合出了7條條更長的更長的EST,通過設(shè)計引物通過設(shè)計引物,利用利用RACE擴增擴增,得到了得到了7條新基因條新基因.相比單純尋找新基因的全長相比單純尋找新基因的全長,此種方法此種方法的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫,得到了更多的信息得到了更多的信息,獲得新基因速度更快獲得新基因速度更快*效果更高效果更高,屬一屬一種頗具規(guī)?；姆椒ǚN頗具規(guī)?；姆椒?很有應(yīng)用前景。很有應(yīng)用前景。 隨著隨著RACE技術(shù)的不斷改進和完善技術(shù)的不斷改進和完善,優(yōu)化優(yōu)化P

23、CR擴增的條件以提高擴增的效率和忠實性，擴增的條件以提高擴增的效率和忠實性，RACE技術(shù)必技術(shù)必將在基因克隆以及基因家族和基因表達變化等研究中發(fā)揮極大的作用將在基因克隆以及基因家族和基因表達變化等研究中發(fā)揮極大的作用。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話因的表達基因的表達 Gene Expression業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話表達系統(tǒng)：一表達系統(tǒng)： 基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白基因工程中用來獲得有功能的異源蛋白質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載體及質(zhì)的體系，包括克隆載體，表達載體及受體細胞。受

24、體細胞。 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話受體細胞的不同可分為：據(jù)受體細胞的不同可分為：1原核表達系統(tǒng)：原核表達系統(tǒng)： 將外源基因引入原核細胞，并使其在原將外源基因引入原核細胞，并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物的體系。合成基因產(chǎn)物的體系。2真核表達系統(tǒng)：使外源基因在真核細真核表達系統(tǒng)：使外源基因在真核細胞中表達的體系。胞中表達的體系。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話

25、原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點二原核生物基因結(jié)構(gòu)和表達特點業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話核生物染色體原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)是裸露的環(huán)形形DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進行。連續(xù)進行。 原核生物形成多順反子原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個核糖體在合成過程中和多個核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-587176363、一般不含內(nèi)含子（、一般不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)錄及翻譯后加工系

26、統(tǒng) 4、原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。一起，形成操縱子。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話原核表達載體：五原核表達載體： 適用于在原核細胞適用于在原核細胞中表達外源基因的載體。中表達外源基因的載體。主要元件：強啟動子主要元件：強啟動子 SD順序順序 篩選標志篩選標志 其它調(diào)控基因其它調(diào)控基因 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話術(shù)關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因插入原核序列：克隆基因插入原核序列33端而維持正確閱讀框架端而維持正確閱讀框架。 選擇合適酶切位點選擇合適酶

27、切位點 加人工合成的加人工合成的DNA接頭接頭 構(gòu)建位相載體構(gòu)建位相載體業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話點：優(yōu)點：表達效率高表達效率高產(chǎn)物穩(wěn)定產(chǎn)物穩(wěn)定 易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易鑒定：融合蛋白分子量大，電泳可鑒定易純化：利用融合原核多肽的特性易純化：利用融合原核多肽的特性業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話tac：IPTG誘導(dǎo)誘導(dǎo)GST融合蛋白融合蛋白直接純化直接純化產(chǎn)物切割方便：產(chǎn)物切割方便： pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因子位相載體位

28、相載體融合型載體融合型載體-pGEX系列系列業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話務(wù)概述 目前本實驗室主要采用原核表達體系為pET載體系列與pGEX載體系列，表達菌株為BL21(DE3)系列菌株和Rosseta系列菌株，如有特殊需要，我們還單獨可以提供特殊菌株與載體。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話品要求 待測基因序列信息；待測基因序列信息； 基因片段；基因片段； 待測組織材料或待測組織材料或RNA； 待表達基因已嘗試表達的方法與結(jié)果；待表達基因已嘗試表達的方法與結(jié)果； 表達基因的特殊要求（帶何種標簽及標

29、簽的位表達基因的特殊要求（帶何種標簽及標簽的位置）；置）； 純化方式；純化方式； 最終表達量等最終表達量等。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話務(wù)流程1、客戶提供的基因片段。、客戶提供的基因片段。 2、構(gòu)建重組載體質(zhì)粒：把目的基因片段與相同酶切后的表達載體連、構(gòu)建重組載體質(zhì)粒：把目的基因片段與相同酶切后的表達載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株感受態(tài)細胞，篩選轉(zhuǎn)化子，測序鑒定。接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株感受態(tài)細胞，篩選轉(zhuǎn)化子，測序鑒定。 3、把重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至、把重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)或或Rosseta系列表達菌株中，系列表達菌株中，篩選轉(zhuǎn)化

30、子。篩選轉(zhuǎn)化子。 4、重組表達質(zhì)粒在表達菌株中的誘導(dǎo)表達。、重組表達質(zhì)粒在表達菌株中的誘導(dǎo)表達。 5、表達產(chǎn)物的、表達產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。）分析。 6、表達產(chǎn)物的純化（按照柱材說明書操作）。、表達產(chǎn)物的純化（按照柱材說明書操作）。 7、純化產(chǎn)物免疫學(xué)活性的鑒定（、純化產(chǎn)物免疫學(xué)活性的鑒定（ELISA 或或WESTERN BLOTTING檢檢測）測）業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話成時間 12月。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話終產(chǎn)品 完整實驗

31、報告 含有目的基因的表達載體質(zhì)粒以及對應(yīng)的菌株。純化的目的蛋白業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話、原核表達系統(tǒng)的缺點八、原核表達系統(tǒng)的缺點1、沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、沒有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能識別、剪除內(nèi)含子剪除內(nèi)含子 2、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯、缺乏翻譯后加工系統(tǒng)，不能對翻譯的蛋白質(zhì)進一步修飾加工的蛋白質(zhì)進一步修飾加工 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢真核表達系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)3. 可實現(xiàn)

32、真正的分泌表達可實現(xiàn)真正的分泌表達4.基因治療基因治療業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點真核基因結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控特點 （一）真核基因組的復(fù)雜性（一）真核基因組的復(fù)雜性 真核基因組龐大，具大量非編碼序列真核基因組龐大，具大量非編碼序列 -mRNA豐豐度不同度不同 結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體結(jié)構(gòu)復(fù)雜：染色質(zhì)、核膜、線粒體-表達調(diào)控多表達調(diào)控多樣樣 不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子不連續(xù)性：內(nèi)含子、外顯子 沒有操縱子結(jié)構(gòu)沒有操縱子結(jié)構(gòu) 業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話二）真核表達系統(tǒng)二）真

33、核表達系統(tǒng)組成：真核表達載體組成：真核表達載體 受體細胞受體細胞 基因轉(zhuǎn)移方式基因轉(zhuǎn)移方式業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話受體細胞及表達載體的不同分為據(jù)受體細胞及表達載體的不同分為3種：種： 酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話三）轉(zhuǎn)化（三）轉(zhuǎn)化1、原生質(zhì)體法：去除厚壁、原生質(zhì)體法：去除厚壁2、電穿孔法：效率較高、電穿孔法：效率較高業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話 010-587176

34、36（四）外源基因的表達（四）外源基因的表達1、胞內(nèi)表達、胞內(nèi)表達2、分泌表達：在、分泌表達：在MCS前加入信號肽前加入信號肽序列序列業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話五）缺點（五）缺點不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能不能實現(xiàn)全部的翻譯后修飾功能業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話母真核表達 目前本實驗室主要采用酵母表達體系的載體為pPIC9k與pPIC3.5k，表達菌株為畢赤酵母GS115與KM71，如有特殊需要，我們還單獨可以提供特殊菌株與載體。 樣品要求，以及實驗報告同原核表達。業(yè)務(wù)員 QQ 807475538 公司網(wǎng)址：客服電話乳細胞真核表達 1 隨著愈來愈多的治療疾病的藥物蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，高純度活性蛋白的獲得具有更大的意義。 2 通過各種真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是目前研究的熱點領(lǐng)域，也是今后蛋白質(zhì)工程技術(shù)一個重要的研究方向。 3 它不僅可以表達