土壤中反硝化菌的分離與其反硝化能力的分析研究

1、的分析研究匕海交通大學(xué)附屬中學(xué) 高二(9)班姜北辰201209232011-2冃錄1、緒論2、實驗材料及方法3、結(jié)果與數(shù)據(jù)分析4、分析總結(jié)與討論5、參考文獻摘要:通過對土壤樣本進行初篩和復(fù)篩，以限制氮源的方法分離出8株具有反硝化 能力的微生物，對5株微生物的反硝化能力進行測定，其二周吋間硝酸鹽降解率 最高為100%,最低為66.76%o對此8株菌株的dna進行pcr擴增，引物為已 知的nirs和nosz反硝化基因的相應(yīng)引物，發(fā)現(xiàn)有三株菌株含有nosz基因。再 對此8株菌株中的7株的16s rdna進行pcr擴增，鑒定菌種。關(guān)鍵詞：反硝化微生物，菌種鑒定，反硝化菌篩選1> 緒論：反硝化作用

2、（denitrification）也稱脫氮作用。反硝化細菌在缺氧 條件下，還原硝酸鹽，釋放出分子態(tài)氮（n?）或一氧化二氮（n2o） 的過程。大部分反硝化細菌是異養(yǎng)菌，例如脫氮小球菌、反硝化假單 胞菌等，它們以有機物為氮源和能源，進行無氧呼吸，其生化過程可 用下式表示：c6h12o64-12no3 j 6h2o+6co2+12noi+能量ch3cooh+8no3j6h2o+ioco2+4n2+8oh+ 能量反硝化作用使硝酸鹽還原成氮氣，從而降低了土壤屮氮索營養(yǎng)的 含量，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不利。農(nóng)業(yè)上常進行中耕松土，使土壤與氧氣充分 接觸以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循環(huán)中不可缺少的環(huán)節(jié)， 可使土壤中

3、因淋溶而流入河流、海洋中的no?減少，消除因硝酸積累對生物的毒害作用。所以我們應(yīng) 盡量發(fā)揮其有利的一面，為人類所 利用。current opinion in microbiology反硝化微生物對于硝酸根離 子的還原步驟如右圖，若要從微生 物代謝角度驗證菌株是否為反硝 化菌最簡單有效的方法便是測定 nirs和nosz基因是否存在。由于 n20和no都是溫室氣體，是否含 有nosz基因?qū)τ诰N的用途有著 實際且重要的意義，即可以使土壤 屮微生物代謝產(chǎn)生的n2o和no還原成氮氣。本實驗的目的便是通 過篩選土壤中的反硝化菌，測定反硝化能力，鑒定其是否含有nirs 和nosz基因，對此進行綜合分析，找

4、出反硝化能力較強的菌株，最 終制備純培養(yǎng)的反硝化菌菌株。實驗完成后，此菌株將有十分廣大的 應(yīng)用前景。例如，將對農(nóng)田等生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物產(chǎn)生的n2o和 no等溫室氣體還原，減少溫室氣體的排放，為維持環(huán)境的穩(wěn)定起到積極作用。2、 實驗材料與方法(1) lb液體培養(yǎng)基(每1000ml)10g蛋口腺5g酵母提取物10g nacl若加入15g瓊脂粉則為lb固態(tài)培養(yǎng)基成分。(2) tsa培養(yǎng)基：胰蛋口月東0.75g/l大豆豚0.25g/lnacl 0.25g/l(3) giltay培養(yǎng)基a溶液：kno3 l.ogo天冬酰胺l.og, 1%btb酒精溶液5ml, 蒸啊水500mlb 溶液：檸檬酸鈉 8.5

5、g, mgso4-7h2o l.og, fecl3-6h2o 0.05g, kh2po41.0g, cacl2-2h2o 0.2g,蒸館水 500ml混合a、b溶液，加入l%mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph為7.1, 滅菌備用。(4) 瓊脂糖凝膠電泳 全基因組電泳：tae buffer 30ml瓊脂糖 0.8% (0.24g) pcr產(chǎn)物電泳：tae buffer 50ml瓊脂糖 1.2% (0.6g)均加入熒光劑eb 1微升(5) bead-beater法所用試劑 bufferz : 10mm tris-hcl, 150mm nacl, ph 8.0(1.21g tris 堿,8.755g

6、nacl,加 hc1 調(diào)至 ph 8.0,配成 il 溶液) 10%sds(ci2h250s03na)100g 溶于 il 水 ph 5.3 氯仿異戊醇(24： 1) 苯酚(ph 8.0) 無水乙醇 eirconium beads screw tube(6) pcr反應(yīng)體系(25 u 1)10 x buffer2.5 ultaq酶0.25 u 1mgc122p1dntp2ulprimerl0.5ulprimer 20.5 ul水16.25 ul模板lulnosznirsprimer 1nosz fr3cdprimer2nosz rcd3af(7) 修正pcr反應(yīng)體系(50u l)10 x bu

7、ffer5ultaq酶1 u ldntp7ulprimer 11 ulprimer21 ii l模板1-2 uldmso1 ulddh2o33 ul(8) pcr反應(yīng)引物序列及條件目的基因引物引物序列(5v)反應(yīng)條件nirsl2cd3afr3cdgts aac gts aaggar acs gggas ttc ggr tgsgtc ttg a94°c for 2min,30x(94°c for 30s,51 °c for lmin,72°c for lmin),72°cfor lominnosz nosz fnosz rcgy tgt tcm

8、tcgaca gcc agcat gtg cag ngcrtg gca gaa94°c for 2min,3x(94°c for 30s,65 °c for 1 min,72 °c for 40s),4 x (94 °c for 30s,60 °c for 1 min,72 °c for lmin),18x(94°c for 30s,55 °c for1 min,72°c for 1 min),72°c lomin(9) 化學(xué)轉(zhuǎn)化體系:pmd18-t 載體 0.5uldna4.5 ul

9、solution i5ul載體與solution i為takara公司產(chǎn)品（10）儀器、試劑：普通離心機、冷凍離心機、超凈臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、紫外分光光度儀、pcr儀、凝膠電泳 槽、水浴鍋、冰浴、金屬浴儀、紫外照膠儀、快檢器，實驗所 用化學(xué)藥品均為分析純。（11）初篩：先將土壤樣本稀釋100倍作為樣本。提取樣本,稀釋為10"、10 10_ 10 ios 10"六個梯度，各500微升。其中,10 10 w7三個濃度各涂兩個平板，其余各涂一個平板。再加上10一2濃度在平板上進行劃線，總計10個平板。平板上培養(yǎng)基為tsa培養(yǎng)基。然后將平板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱

10、中18°c培養(yǎng)一個星 期。（12）菌落集中培養(yǎng)：另取一平板，在其背面貼上50格的方格紙，然后從io6 和1（/7的平板上挑取菌體分別接種在每個格子的左上（記為a） 和右下方（記為b）。（其上菌落的編號方法：方格號+位置，例:10a、44b）o共計100個菌落。將此平板與先前各平板一道放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)一周。此平板記作“平板a”（13）復(fù)篩:使用移液槍頭挑取平板a上較明顯且較有代表性的10個菌落接種進預(yù)先加好giltay培養(yǎng)基與btb的大試管內(nèi)，記下編 號，培養(yǎng)一周。接種到大試管中的細菌編號：17a、17b、19a、19b、23a、23b、38b、41a、42a、43a。btb變藍

11、的試管編號：17a、17b、19a、19b、23a、38b、41a、43ao將所有平板密封放入冰箱保存，將大試管放入振蕩培養(yǎng)箱 繼續(xù)培養(yǎng)。一周后，提取大試管中的培養(yǎng)液，開始測量硝酸鹽 的降解程度。此時，菌已在大試管中培養(yǎng)三周（28°c）。使用儀 器為紫外分光光度儀，波長為220nm與275nmo記錄實驗數(shù)據(jù), 將結(jié)果進行數(shù)學(xué)模型擬合，推算出硝酸鹽降解程度。（14）dna提取與pcr擴增： 配制lb液體培養(yǎng)基100ml,取16個試管，將有反硝化能力的 8株菌株接種到試管中，進行好氧培養(yǎng)，16小時后放4°c保存。 使用煮菌法從平板a上提取dna,把已知的反硝化基因nirs 和n

12、osz基因為目的基因，使用相應(yīng)引物，進行pcr擴增，電 泳后比對。通過研究比對看具有反硝化能力的菌是否含有這兩 種基因。 取4°c保存的菌液使用bead-beater法提取高純度dna。 用此dna作為擴增16s rdna的模板，引物為16s rdna全程 引物（27f、1492）o同時使用此dna對目的基因pcr作復(fù)核, 重復(fù)三次實驗。（15）瓊脂糖凝膠電泳（8個菌株的dna樣品+陽性對照+陰性對昭)八、丿 使用30ml規(guī)格0.8%的瓊脂糖tae buffer溶液，取全基因組dna樣品3h1,無菌水2m1,緩沖液1u1在塑料膜上點樣混 勻后注入凝膠的孔內(nèi)，電壓80v。使用50ml規(guī)

13、格的瓊脂糖tae buffer溶液，取pcr擴增dna樣品3ul,無菌水2叮，緩沖 液1卩1在塑料膜上點樣混勻后注入凝膠的孔內(nèi)，電壓120vo 結(jié)束后放入喑箱內(nèi)拍照，比對。(16) 16s rdna電泳產(chǎn)物的割膠回收制備回收膠，紫外燈下割取明亮條帶于1.5ml ep管中。使用omega公司的dna回收試劑盒回收16s rdnao(17) 使用omega公司的dna回收試劑盒回收16s rdna 稱膠重 加適量binding buffer(xp2)放入60°c水浴lomin使膠融化。 組裝dna column和2ml收集管 加入7001h樣品，loooxg離心lmin 倒去液體加700

14、 u 1 binding buffer(xp2)重復(fù)一次loooxg離心 lmin 最大轉(zhuǎn)速空轉(zhuǎn)2min,放65 °c烘箱5min 加dna洗脫緩沖液50ul, loooxg離心lmin(18) 化學(xué)轉(zhuǎn)化 取感受態(tài)大腸桿菌細胞(dh10b),放冰上融化。 配制10卩1體系(t載體0.5u1, solution i 5 u 1,樣品4.5ul) 加入轉(zhuǎn)化體系后，冰上放置30min 42°c熱激90s放冰上23min 加入lml lb, 37°c 1小時培養(yǎng) 涂布在加amp的固態(tài)lb上，培養(yǎng)16小時。 amp 固態(tài) lb 成分:amp 250 u 1, iptg 80

15、 u 1, xgel 320 u 1（19）質(zhì)?？鞕z 挑取平板上的白色菌落另取平板培養(yǎng)。 在1.5ml ep管中各加入40u 1快檢液i（50ul 1 ommol/edtaph8.0） 用槍頭刮取菌體于ep管中，充分震蕩 各加入20ml快檢液ii 65°c烘箱15min 加入10»1快檢液iii （酸酚）充分震蕩，12000rpm5min 取上清5ul點樣電泳3、結(jié)果與數(shù)據(jù)分析（1）初篩方法所得出結(jié)論：在反硝化微生物的厭氧培養(yǎng)涂布平板中，樣本稀釋倍數(shù)以10'與10刁濃度最為合適，此時菌落數(shù)從10個 到50個不等。一周后長出菌落直徑12mm,兩周后長出的菌 落直徑為3

16、4mm,菌落形態(tài)十分容易辨別。（2）復(fù)篩結(jié)果：共挑取有代表性的十株菌株接種至加giltay培養(yǎng)基 與btb的大試管中，一星期后，十個試管中有八個變色，記錄 其編號。在平板a上觀察變色的八個菌落形態(tài)，得出以下數(shù)據(jù):表一：菌落形態(tài)編號大小形狀邊緣厚度顏色透明度17a大不規(guī)則光滑較薄黃半透明17b小圓形光滑較厚黃半透明19a大不規(guī)則光滑較厚黃半透明19b大不規(guī)則光滑較厚黃半透明23a大不規(guī)則粗糙較薄白半透明38b大不規(guī)則光滑較厚黃半透明41a小不規(guī)則粗糙較薄白不透明43a大不規(guī)則粗糙較厚白不透明（3）使用紫外分光光度儀進行硝酸鹽降解程度的測定，紫外光波長 為220nm和275nm，此時已培養(yǎng)兩周時間

17、。以菌落形態(tài)有代表 性為標(biāo)準(zhǔn)，測定了 8個菌株中的5個，得出以下數(shù)據(jù)：表二：8個菌株中5株的吸光度實測值吸光度實測值a220a275a 校正(a220-2a275)原液0.3870.0080.37117a0.3530.0910.17117b0.3300.1640.00219a0.4190.1220.17519b0.4900.1210.24823a0.3520.1460.060對獲得的吸光度數(shù)據(jù)進行處理，得到表三:表三：5株菌株的降解率編號原濃度(mg/1)降解率原液167.2817a38.0577.25%17b-0.48100.28%19a38.9676.71%19b55.6066.76%23

18、a12.7592.38%分析比較實驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)17b, 17a, 23a三株菌株的反硝化能力最 強。同時發(fā)現(xiàn)17b的實驗數(shù)據(jù)存在負值，說明實驗存在誤差。(4) 關(guān)于以16s rdna基因pcr反應(yīng)條件的改進：在實驗過程中，為了找到擴增菌株樣品16s rdna的最適條件，使用 溫差梯度 pcr 儀，設(shè)置 51°c、53°c、55°c、5丁c、59°c、61°c六個 梯度為退火溫度，電泳后得出以下結(jié)果：marker 57°c 55°c 61°c 59°c 57°c 55°c 53°

19、;c 51°c發(fā)現(xiàn)當(dāng)退火溫度為55°c到57°c時pcr效果最好,因為此時條帶較亮, 說明dna濃度較高，而61°c明顯太高。最終確定16s rdna的pcr 反應(yīng)條件為：94°c for 2min, 30 x (94°c for 30s, 55 °c for lmin, 72°c for lmin) ,72°c for 10 min, 15 °c fore ver o(5) 凝膠電泳結(jié)果說明：為了簡便標(biāo)記，將原有菌株重新編號，17a、17b、19a、19b、23a、38b、41a和應(yīng)更改為1、

20、2、3、4、5、6、7號菌株nirs與nosz基因鑒定結(jié)果該實驗重復(fù)四次，第一次pcr擴增失敗，第二次出現(xiàn)較多非特異條帶。分析實驗過程屮可能出現(xiàn)的問題，對pcr的反應(yīng)體系作出修改，見“實驗材料和方法(7)修止pcr體系”。第三次與第四 次結(jié)果和同如圖所示。nosz 陽性 7654321 nirs 陽性 7654321圖片中marker左邊為以nosz基因為0的基因的pcr產(chǎn)物的電泳情 況，marker右邊為以nirs基因為冃的基因的pcr產(chǎn)物的電泳情況， 與相應(yīng)陽性對照比較得出結(jié)論：第1、3、4號菌株含有nosz基因， 但沒有菌株含有nirs基因。16s rdna的電泳結(jié)果，如圖：marker

21、 7654321.5kb 16s rdna的pcr擴增完成后，進行割膠回收，為了為化學(xué)轉(zhuǎn) 化做準(zhǔn)備，對割膠回收產(chǎn)物dna進行電泳，觀察其濃度是否 足夠。如圖所示，5、6、7號菌株回收dn a濃度較低，在化 學(xué)轉(zhuǎn)化時用上全部dna冋收產(chǎn)物。marker 1234567 marker 化學(xué)轉(zhuǎn)化完成后，在培養(yǎng)16小時的amp的lb平板上挑取白色菌落每個菌株各6個菌落，接種到新的amp的lb平板上繼續(xù)培養(yǎng)，12小時候挑取菌落做快檢，同時把菌液加40%甘油放入菌種管中-40°c保存。快檢結(jié)果顯示仍有少量空質(zhì)粒存在，丟 棄相應(yīng)菌種管。此圖顯示，左起第5、7、9列為空質(zhì)粒。因為空質(zhì)粒為極個別 現(xiàn)象

22、，在此僅顯示全部快檢結(jié)果的一部分。(6) 菌種鑒定結(jié)果每株菌株送3管菌液至公司測序，公司為上海英俊生物技術(shù)有 限公司。對7株菌株樣品的16s rdna測序結(jié)果與基因庫相比對，得到表四:表四：菌種鑒定結(jié)果菌株編號最相似菌種相似度1-17aaeromonas hydrophila99%217baeromonas hydrophila99%3 ->19aaeromonas media98%4->19baeromonas media99%5-23aserratia fonticola99%acinetobacter sp.99%6-38baeromonas media99%7 ->41aserratia fonticola99%其中，共分離得到三種細菌，嗜水氣單胞菌(aeromonas hydrophila )、中間氣單胞菌(aeromonas media )、居泉沙雷氏菌 (serratia fonticola)o值得注意的是，5號菌株2個克隆鑒定為居泉 沙雷氏菌，但另一個克隆鑒定為不動桿菌屬的某種jacbietobacter ¥.),由于此屬細菌在自然環(huán)境中分布極廣，且粘附性強，疑似為菌 種管被外源菌污染所致。4、分析總結(jié)與討論本課題較成功地分離出8株反硝化菌株。分析比較實驗數(shù)據(jù)，菌 株17b, 17a, 23a的反硝化能力最強。屯泳的結(jié)果顯示，菌株17