-Varian系列LCMS現(xiàn)場培訓資料——方法開發(fā)

1、Varian 300 系列系列LC/MS 現(xiàn)場培訓資料現(xiàn)場培訓資料方法開發(fā)方法開發(fā)美國瓦里安技術中國有限公司南區(qū)市場部電話真：021-637568482使用液質需要特別注意的事項：使用液質需要特別注意的事項：1. 不要使用不揮發(fā)性緩沖鹽（如磷酸鹽等）2. 用有機緩沖鹽的濃度不能太高，小于10mM3. 盡量避免含無機鹽的樣品進樣分析4. 進樣濃度不要太高，幾個ppm以下5. 不要使用塑料容器裝有機溶劑6. 不要使用洗滌劑清洗玻璃容器7. 未知樣品不要輕易進樣分析31、背景信息：、背景信息：1.1 樣品基本信息樣品基本信息 樣品名稱 可能含有的雜質 是否含鹽 溶解性 保

2、存狀態(tài)41、背景信息：、背景信息：1.2 樣品來源處或查詢文獻獲得以下信息樣品來源處或查詢文獻獲得以下信息 LC/MS進行化合物分析時，需要的流動相和添加劑 離子源 （ESI 或 APCI） 離子化模式（正或負） 分析條件 （溫度和電壓等） 色譜條件非常好的一個資源： “LC/MS Methods: An Essential Tool to Accelerate Methods Development”網(wǎng)址： 52、準備工作、準備工作2.1 樣品溶劑樣品溶劑 原來溶解樣品的溶劑，若不合適LC/MS，N2吹干，再用流動相定量溶解。 溶解樣品的溶劑一定要和流動相一致，否則得到的譜圖不純，峰形不好，

3、變寬，出怪峰，甚至均為溶劑峰。 由于液質分析時，流動相流速較?。ㄓ绕涫荅SI源時），因此需要注意樣品溶劑的強度不要高于流動相 某些固體直接用流動相不溶，可以先加一滴DMSO，再加甲醇或乙腈等稀釋。62、準備工作、準備工作2.2 樣品濃度樣品濃度 進樣順序要先稀后濃，定量溶解，濃度控制在幾個ppM以下，不然容易污染系統(tǒng)，造成本底太高影響分析結果。 濃度非常低的樣品不能保存太長時間，容器吸附、分解等原因使樣品濃度降低，標準工作液現(xiàn)配現(xiàn)做。 鈉鹽和鉀鹽會產(chǎn)生鈉/鉀加合物，這些加合物比較難打碎，可稀釋溶液減少加合概率。72、準備工作、準備工作2.3 色譜柱和管路的沖洗色譜柱和管路的沖洗 新的色譜柱以及

4、分析過大量樣品的系統(tǒng)，可能要先沖洗很長時間才能干凈， 某些樣品非常容易吸附在進樣閥和管路中 尤其是采用針泵進樣時，先用空白溶劑充分清洗管路。82、準備工作、準備工作2.4 流動相條件流動相條件 如果在液相上摸好的條件，注意尤其是流動相的組成要轉化成合適LCMS分析的。 磷酸鹽及其他不揮發(fā)緩沖鹽在離子源會沉淀并堵塞毛細管等，要更換成可揮發(fā)的有機緩沖鹽。 緩沖鹽會導致離子抑制，因此要控制緩沖液的強度，10mM。 去污劑、表面活性劑會有離子抑制現(xiàn)象發(fā)生， 表面活性劑產(chǎn)生的加合物和離子簇會干擾質譜數(shù)據(jù)，因此作液質聯(lián)用儀時，不要使用洗滌劑清洗玻璃器皿等容器92、準備工作、準備工作2.5 色譜柱的選擇色譜

5、柱的選擇 根據(jù)文獻及待分析物的性質選擇色譜柱 建議使用細徑色譜柱，尤其是ESI離子源時 色譜柱的長度可以不需要很長，由于二級質譜的特點，不一定要求色譜上基線分離102、準備工作、準備工作2.6 離子源選擇離子源選擇化合物性質化合物性質ESIAPCI水溶性水溶性離子化合物離子化合物可電離可電離極性極性極性非離子化極性非離子化非極性非極性難揮發(fā)性難揮發(fā)性熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定熱不穩(wěn)定熱不穩(wěn)定高流速高流速(1 mL min=1)低流速低流速(100-250 L min-1)注：另一種離子化方式不合適112、準備工作、準備工作2.7 離子化模式：離子化模式： 堿性化合物宜用正離子方式； 酸性化合物宜用負離子方式

6、； 如未知，可能正負都要做； 有些化合物正負都出峰，選擇靈敏度高的方式； 不明確的優(yōu)先用正離子方式試123、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.1 準備待分析物準備待分析物1 g/mL的標準溶液的標準溶液 盡量使用初始洗脫流動相作為樣品溶劑 如果該信息無法獲得，嘗試50:50的A:B133、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.2 初始質譜條件初始質譜條件ESI：APCI：a)將注射泵的流速設為20 L/mina)將注射泵的流速設為100 L/minb)干燥氣的溫度設為200Cb)輔助氣的溫度設為350Cc)干燥氣的壓力設為 19 psic)輔助氣的壓力設為

7、40 psid)噴霧氣的壓力設為50 psid)噴霧氣的壓力設為50 psie)干燥氣的壓力設為 19 psif)干燥氣的溫度設為200Cg)電暈針的電流設為5uA143、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.3 尋找母離子尋找母離子 全掃描， m/z 50-2000（盡量縮小這個范圍） 尋找正、負模式下母離子的準確質量數(shù) 在預計的母離子質量范圍將質量窗縮小至 20 m/z 注意：當樣品溶液內含有離子抑制物質時，直接進樣可能看不到分子峰，此時需要經(jīng)色譜柱分離或重新處理樣品 通常ESI(+)形成：M+，M+H+， M+Na+ ， M+K+ ， M+NH4+等； ESI(-)形成，

8、M-， M-H-等153、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.3尋找母離子（續(xù)）尋找母離子（續(xù)） 如果有幾個峰無法判斷分子離子峰是哪個，此時可加入NH4+，觀察增加18的離子峰 可通過Flush注射泵，觀察某個或某些離子的強度明顯增大來確定該離子為樣品中帶有的而不是溶劑污染物 若看不到分子離子峰，可嘗試改變毛細管的電壓，觀察離子豐度的變化 注意同位素的分布，如含Cl的化合物，有兩個母離子峰確定母離子后，在Q1中輸入該質量數(shù)，注意輸入母離子質荷比小數(shù)點后的位數(shù)，輸入要準，靈敏度才高，而且不容易出錯，得到的譜圖相對干凈。163、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：

9、3.4 優(yōu)化一級質譜的條件優(yōu)化一級質譜的條件 噴霧針電壓， 毛細管電壓， Q0和L4 點擊上述各按鈕，輸入需要優(yōu)化的母離子，點擊優(yōu)化173、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.4 優(yōu)化二級質譜的條件優(yōu)化二級質譜的條件 打開CID氣體至 1.5 mTorr 點擊“Tools”菜單，選擇“MSMS Breakdown”， 后點擊 “Q2 collision cell” 輸入希望查找的子離子碎片的合適質量數(shù)范圍，例如，母離子為 m/z 540， 選擇子離子范圍100-550 注意選擇最大強度的子離子碎片1819203、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.4 優(yōu)化二

10、級質譜的條件（續(xù)）優(yōu)化二級質譜的條件（續(xù)） 對每一種待分析物標樣重復以上步驟， 尤其注意存在質量數(shù)一樣的多組分的分析 母、子離子輸入的質量數(shù)值要選準，要根據(jù)Q1 SCAN及PRODUCTIONSCAN得到的結果輸入，不能只是整數(shù)。 當不能確定精確質量數(shù)時，可選待測質量數(shù)上下各0.1AMU，同時數(shù)對離子優(yōu)化，最終找出靈敏度最佳的一對離子。例如540-192.0，540.1-192.0，539.9-191.9。213、優(yōu)化、優(yōu)化MS條件條件用注射泵進樣：用注射泵進樣：3.4 優(yōu)化二級質譜的條件（續(xù)）優(yōu)化二級質譜的條件（續(xù)） 若樣品較雜，同一化合物要選擇幾對母、子離子，經(jīng)進樣實驗找出哪對有干擾，去掉

11、，保留不易受干擾的1-2對離子。 每對離子各參數(shù)分別設置，如毛細管電壓，碰撞能量，Dwell Time等，對較弱離子對，采樣時間可適當長些。 在質譜掃描方法表中輸入母離子，子離子，毛細管電壓，噴霧針電壓，碰撞能量等。224、離子源優(yōu)化、離子源優(yōu)化氣體溫度和流量氣體溫度和流量 4.1 初始條件設置初始條件設置 連接色譜管路使之成流動注射模式 設置一個等度程序，流速為 200 L/min（ESI）或 1 mL/min（APCI） （采用方法中的流動相比例） 設置干燥氣的溫度為 300C 設置干燥氣的壓力為 20 psi 設置噴霧氣的壓力為 50 psi 若為APCI， 設置輔助氣的溫度為 350C

12、，壓力為60 psi點擊數(shù)據(jù)采集按鈕開始數(shù)據(jù)采集23244、離子源優(yōu)化、離子源優(yōu)化氣體溫度和流量氣體溫度和流量 4.2 優(yōu)化干燥氣溫度優(yōu)化干燥氣溫度 進樣5 L，觀察子離子信號 干燥氣的溫度按 50C的步進從 150增加到400C 每種溫度進樣2到 3次，以獲得準確的信號4.3 優(yōu)化干燥氣壓力優(yōu)化干燥氣壓力 以5 psi 步進從10增加至40 psi254、離子源優(yōu)化、離子源優(yōu)化氣體溫度和流量氣體溫度和流量 4.4 優(yōu)化噴霧氣壓力優(yōu)化噴霧氣壓力 以5 psi 步進從25增加至60 psi264、離子源優(yōu)化、離子源優(yōu)化氣體溫度和流量氣體溫度和流量 4.5 僅僅APCI離子源時離子源時 ， 優(yōu)化輔

13、助氣的溫度優(yōu)化輔助氣的溫度 以 50C的步進從 300增加到550C4.6 僅僅APCI離子源時離子源時 ， 優(yōu)化輔助氣的壓力優(yōu)化輔助氣的壓力 以10 psi 步進從18增加至60 psi全部優(yōu)化好后，按照優(yōu)化條件進樣，查看信號全部優(yōu)化好后，按照優(yōu)化條件進樣，查看信號275、優(yōu)化色譜條件、優(yōu)化色譜條件 選擇一個合適的色譜柱開始色譜條件的優(yōu)化 不一定需要良好的色譜分離度 梯度變化太快對離子化效率影響很大，相應源參數(shù)也應該變化，所以恒定比例流動相能滿足分離分析要求時，盡量不要用梯度，尤其是定量分析時 流動相：通常正離子甲醇好，負離子乙腈好些， 使用揮發(fā)性緩沖溶液 不揮發(fā)性鹽的影響-大量累積使儀器靈

14、敏度下降285、優(yōu)化色譜條件（續(xù)）、優(yōu)化色譜條件（續(xù)） 流動相中加入甲酸、乙酸胺等可提高正離子化效率 是否加酸不是絕對，具體應根據(jù)LC的分離情況、樣品在酸性條件下的穩(wěn)定性等決定 通常pH值低時，M+H+比率高； pH值高時，M+Na + ，M+K+，或M+NH4+比率高 三重四極桿串聯(lián)質譜在單個色譜片斷中，可以通過多通道MRM，達到較短的分析時間的目的 但要注意MRM分析時，最后無信號并不代表已無化合物流出 因此進行下一個樣品分析前要保證前一個樣品的組分已全部沖提出，防止影響下一個樣品的測定296、清洗、清洗 做完含生物體液樣品后，LC需多沖些時間，使吸附在色譜柱上的干擾物完全洗脫下來 每天用

15、無塵紙沾甲醇清洗噴霧腔和Shiel板 若本底高，噴霧針可拆下超聲清洗。 并用注射針抽滿甲醇，緩慢注射入毛細管（切記，不要經(jīng)常這樣清洗毛細管，否則會造成真空泵負壓過大）306、清洗（續(xù)）、清洗（續(xù)） 清洗管路，可從源上拆下PEEK，或將源從儀器上取下，用SYRINGE PUMP洗，換不同溶劑，極性、非極性、酸等輪番沖洗，最后甲醇/水 清洗自動進樣器 用過含酸的流動相后，色譜柱、離子源都要用甲醇/水沖，延長儀器壽命 做完實驗后，手動使儀器處于Q1 Scan，降溫，停LC流動相，最后關氣317、常見污染離子、常見污染離子m/z污染源污染源15-150（H2O）nH+102三乙胺 (TEA)113三氟

16、乙酸(TFA)114N2氣管路116洗滌劑149279391413增塑劑：鄰苯二甲酸酯鄰苯二甲酸二丁酯鄰苯二甲酸二辛酯鄰苯二甲酸二辛酯+鈉2883162mm離心管產(chǎn)生的特征離子384瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子256284尼龍過濾器311352640柱流失331乙丙橡膠122123.9132134145147258315水 (更換過濾系統(tǒng)的過濾器)328、日常維護、日常維護8.1 每天每天 清潔離子化室 清洗自動進樣器 Prime LC泵 檢查LC溶劑是否有臟東西或細菌滋生 更換水相8.2 每周每周 用水和甲醇沖洗毛細管2-3次 檢測自動進樣器的洗瓶中的溶劑量 檢查機械泵的油量 338、日常維護、日

17、常維護8.3 每月每月 檢查LC流速 卸真空清洗API接口（根據(jù)具體的樣品分析次數(shù)及離子源的污染程度） 檢查API噴霧針是否堵塞8.4 每三個月每三個月 更換機械泵泵油 系統(tǒng)Autotune 運行electronic diagnostics 更換氮氣發(fā)生器過濾器348、日常維護、日常維護8.5 每年每年 更換API噴霧針 更換毛細管 測試系統(tǒng)的靈敏度液質用溶劑及樣品盡量不要使用塑料瓶裝；容器不要使用帶表面活性劑的清洗液洗滌359、影響分子量測定的因素、影響分子量測定的因素 PH的影響-正離子方式PH要低些，負離子方式PH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形 干燥氣流量和溫度，當流動相水

18、含量高及流量大時要相應增加，可利用SelecTemp功能對不同時間片斷設置不同的干燥氣溫度和流量 溶劑和緩沖液的類型， 通常正離子甲醇好，負離子乙腈好些，不揮發(fā)性鹽的影響-大量累積使儀器靈敏度下降 根據(jù)樣品結構和性質，選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、C4、C18369、影響分子量測定的因素（續(xù)）、影響分子量測定的因素（續(xù)） 合適的電壓：樣品在源內分解或碎裂，毛細管高電壓多電荷離子比例低，多聚體也少，但是分子離子峰比例下降，因此毛細管電壓要適當 雜質的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好 樣品濃度不夠：有時需要濃縮3710、常見

19、問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.1 溶劑純度溶劑純度 必須是色譜純的 不純或臟的溶劑會引起 較高基線 低靈敏度 梯度洗脫時，基線漂移 梯度洗脫時，鬼峰 改變色譜柱的分離效率 LCMS時會引起離子抑制3810、常見問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.2 水水 去離子水蒸餾（18兆歐） 溶劑必須保存在玻璃器皿中3910、常見問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.3 緩沖液緩沖液 絕對不要用磷酸鹽緩沖液 緩沖液的離子強度小于10mM 使用揮發(fā)性緩沖鹽如乙酸胺或甲酸胺 每天重新配置，或冰箱冷藏 制備好后一定要過濾，若為冷卻保存，使用時需過濾 色譜柱適用的PH值4010、常見問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.4 泵系統(tǒng)泵系統(tǒng) 流路中有氣泡未Prime 進出口閥泄漏溶劑中的顆粒物 泵密封圈需要更換緩沖鹽 進口過濾器堵塞溶劑中的顆粒物 管路泄漏接頭未擰緊4110、常見問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.5 手動進樣器手動進樣器 可能的問題 泄漏 堵塞 顆粒物劃傷馬達 采用全環(huán)進樣，進樣量要大于定量環(huán)的2-3倍；采用部分環(huán)進樣時，進樣體積要小于定量環(huán)的一半4210、常見問題及解決辦法、常見問題及解決辦法10.6 色譜柱色譜柱 避免不純物