細(xì)胞生物學(xué)研究方法()

1、第二章.細(xì)胞生物學(xué)研究方法 顯微鏡技術(shù) 細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù) 細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù) 細(xì)胞功能基因組學(xué)研究技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 r=0.61/na 其中其中為入射光線波長(zhǎng)；為入射光線波長(zhǎng)；na為鏡口率為鏡口率 sin/2，n=介質(zhì)折射率；介質(zhì)折射率；=鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角）鏡口角（樣品對(duì)物鏡鏡口的張角） 。 思考：思考：如何提高顯微鏡

2、的分辨能力？如何提高顯微鏡的分辨能力？ 1. 構(gòu)成：構(gòu)成： 照明系統(tǒng)照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置機(jī)械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成像。像。（一）普通光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡（二）熒光顯微鏡二）熒光顯微鏡 fluorescence microscope特點(diǎn)：光源為紫外線，波特點(diǎn)：光源為紫外線，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片；有兩個(gè)特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。照明方式通常為落射式。把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而把透過標(biāo)本的可見光的光程差變

3、成振幅差，從而提高了各提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。1.環(huán)形光闌（環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。）：位于光源與聚光器之間。2. 相位板（相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。（四）相差顯微鏡（四）相差顯微鏡倒置顯微鏡倒置顯微鏡 inverse mi

4、croscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，載物臺(tái)之上， 用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差物鏡，有的通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。還具有熒光裝置。 fluorescence image of epithelial cell, dna in blue and microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。觀察、基因定位、疾病診斷。熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）（三）激光

5、共聚焦掃描顯微境（三）激光共聚焦掃描顯微境 laser confocal scanning microscope, lcsm 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像立體圖像。激光共聚焦掃描顯微鏡二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, tem透射電子顯微鏡透

6、射電子顯微鏡transmission electron microscope，tem 20世紀(jì)世紀(jì)60年代問世，年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 分辨力為分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為光屏上距離最近兩個(gè)光點(diǎn)的能力）為0.2mm，掃，掃描電鏡的有效放大倍率為描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000x。（二）掃描電子顯微鏡（二）掃描電子顯微鏡人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞酵母酵母人類精子人類精子low speedhigh speeddifferential centrifugation差速離心的原理差速

7、離心的原理原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primary culture)(primary culture) 直接從機(jī)體直接從機(jī)體取下細(xì)胞、取下細(xì)胞、組織和器官組織和器官后立即進(jìn)行后立即進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：即：直接來自動(dòng)物機(jī)體的首次培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（passage）：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培傳代培養(yǎng)養(yǎng)。細(xì)胞融合細(xì)胞融合 單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù) 1975年英國(guó)科學(xué)家milstein和kohler發(fā)明了單克隆抗體技術(shù)，獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)基因克隆基因克隆(gene cloning)(gene cloning) 這項(xiàng)技術(shù)這項(xiàng)技術(shù)可概括可概括為為分、分、切、連、切、連、轉(zhuǎn)、選轉(zhuǎn)、選 動(dòng)物細(xì)胞核移植克隆技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞核移植克隆技術(shù) 1997年，英國(guó)蘇格蘭羅斯林研究所細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得轉(zhuǎn)基因敲除小鼠的獲得 利用同源重組利用同源重組( (基因打靶基因打靶) )使使基因失活的方基因失活的方法法 基因敲除是一基因敲除是一套組合技術(shù)，套組合技術(shù)，包括基因重組、包括基因重組、細(xì)胞分離、轉(zhuǎn)細(xì)胞分離、轉(zhuǎn)基因等基因等 兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù): :體外重組與轉(zhuǎn)體外重組與轉(zhuǎn)基因鼠基因鼠 基因敲進(jìn)基因敲進(jìn)(knockin(knockin) ) 將外源有功能的基因?qū)⑼庠从泄δ艿幕? (基因組中原先不