第2章6蛋白質(zhì)分離純化

1、2.6 2.6 蛋白質(zhì)的分離、純化蛋白質(zhì)的分離、純化l研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。l(1)(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；細(xì)胞和植物細(xì)胞；l(2)(2)隨時(shí)測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白隨時(shí)測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)含量。質(zhì)含量。l(3)(3)分離和純化過程都必須在溫和的分離和純化過程都必須在溫和的條件下進(jìn)行。條件下進(jìn)行。一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則一、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則l(1)(1)生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨法、超生物組織的機(jī)械破碎。常用的方法有研磨

2、法、超聲波法、凍融法和酶解法等。聲波法、凍融法和酶解法等。l(2)(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。l水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。l(3)(3)粗提粗提: : 離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。l(4)(4)精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。精制：可用層析法、電泳法等進(jìn)行精制。l(5

3、)(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。蛋白質(zhì)的分離步驟蛋白質(zhì)的分離步驟四、蛋白質(zhì)的純化方法四、蛋白質(zhì)的純化方法l根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用(precipitation)。l因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子量大小不同、表面所代因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離出來。出來。l沉淀法具有部分純化、濃縮特點(diǎn)。沉淀法具有部分純化、

4、濃縮特點(diǎn)。 蛋白質(zhì)的純化方法 蛋白質(zhì)的純化方法l蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀沉淀l陰離子化合物的效果是：陰離子化合物的效果是：nhnh4 4+ +kk+ +nana+ +l陽離子化合物的效果是：陽離子化合物的效果是：popo4 43-3-soso4 42-2-clcl- -l常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需的帶的電荷和水化程度不同，鹽析時(shí)所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋鹽的濃度也不相同，因而可

5、以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。白質(zhì)加以分離。 蛋白質(zhì)的純化方法l在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力的有機(jī)溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強(qiáng)，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)強(qiáng)，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。的溶解度降低而沉淀。l常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，有機(jī)溶劑濃度不能太高有機(jī)溶劑濃度不能太高(30%-50%)(30%-50%)，而且，而且需要在低溫條件下進(jìn)行。需要在低溫條件下進(jìn)行。l5

6、5，2525乙醇沉淀卵清蛋白。乙醇沉淀卵清蛋白。 蛋白質(zhì)的純化方法l蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。形成沉淀。l當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的ph ph 被調(diào)到某一成分被調(diào)到某一成分的等電點(diǎn)時(shí)，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉的等電點(diǎn)時(shí)，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉淀出來。而那些等電點(diǎn)高于或低于該淀出來。而那些等電點(diǎn)高于或低于該ph ph 的的蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。l該法適用于在等電點(diǎn)該法適用于在等電點(diǎn)phph穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)的純化方

7、法ldialysisdialysis此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機(jī)鹽、膜，而使它與其它小分子化合物，如無機(jī)鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。分離。l常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。止分子量一般為一萬。 透析法透析法 蛋白質(zhì)的純化方法l透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩

8、沖液）中進(jìn)行透析。是蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行透析。l通透動(dòng)力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。通透動(dòng)力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。 透析法透析法 蛋白質(zhì)的純化方法l超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾膜。膜。l其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器板式超濾器。超濾器板式超濾器。 蛋白質(zhì)的純化方法離子交換層析法離子交換層析法 蛋白質(zhì)的純化方法l此法又稱為分子篩層析（此法又稱為分子篩層析（gel-filtration gel-filtration chromatography

9、chromatography） 。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。lsephadex-sephadex-葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠g10-g200g10-g200lsepharose-sepharose-瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2b,4b,6b2b,4b,6blsephacryl-sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠丙烯酰胺葡聚糖凝膠s100,s200,s300,s400s100,s200,s300,s400分子篩層析（gel-filtrat

10、ion chromatography）原理原理基質(zhì)基質(zhì) 葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（sephadex） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（sepharose）應(yīng)用應(yīng)用 測定分子量測定分子量 : lgmr=a-bve 脫鹽和濃縮脫鹽和濃縮 分離提純生物大分子分離提純生物大分子 l這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的特殊不同的蛋白質(zhì)分子對(duì)于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力。配基具有不同的識(shí)別和結(jié)合能力。l選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作用選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識(shí)別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與

11、載體共的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱價(jià)連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中。中。l當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，該當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時(shí)，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。洗脫液洗脫。親和層析（affinity chromatography）應(yīng)用應(yīng)用 分離純化酶、分離純化酶、 抗原、抗體抗原、抗體 分離

12、純化核酸分離純化核酸 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能研究酶的結(jié)構(gòu)與功能+待純化分子待純化分子配體配體a. 待純化分子和配體間具有親和性待純化分子和配體間具有親和性+基質(zhì)基質(zhì)b. 活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑活性基質(zhì)與配體結(jié)合產(chǎn)生親和吸附劑+雜質(zhì)雜質(zhì)c. 待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離待純化分子與親和吸附劑結(jié)合，與雜質(zhì)分離+d. 偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子偶聯(lián)復(fù)合物經(jīng)解離后，得到純的待純化分子原理：原理：基質(zhì)基質(zhì) 纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、 sepharose、sephadex 蛋白質(zhì)的純化方法l在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性在外電場的作用下，帶電顆粒

13、將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)溶液的溶液的phph值不等于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒均帶值不等于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不同，因而在電場中移動(dòng)的速度也所帶的電荷不同，因而在電場中移動(dòng)的速度也不相同。不相同。l在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動(dòng)的速度（中移動(dòng)的速度（v v）取決于電場強(qiáng)度）取決于電場強(qiáng)度(e)(e)，所帶，所帶的凈電荷的凈電荷(q)(q)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)(

14、f)(f)。 蛋白質(zhì)的純化方法lsdssds（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約大約1 1 2 2比例結(jié)合。比例結(jié)合。l這樣，每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的這樣，每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都因?yàn)榻Y(jié)合了許多的sdssds而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，大量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，因此，

15、e e q q值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用值接近一個(gè)常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。l用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。不同蛋白質(zhì)的分子量。離心技術(shù)離心技術(shù)1離心機(jī)類別離心機(jī)類別 普通離心機(jī)普通離心機(jī) 6000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分 高速離心機(jī)高速離心機(jī) 2-3萬轉(zhuǎn)萬轉(zhuǎn)/分分 超速離心機(jī)超速離心機(jī) 3萬轉(zhuǎn)萬轉(zhuǎn)/分分2沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（s）概念）概念沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（s） 生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)

16、。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時(shí)間。其單位用靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時(shí)間。其單位用svedbergsvedberg，即，即s s表示，表示，s=1s=11010-13-13秒。秒。沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（s s）與分子量（）與分子量（m m）的關(guān)系）的關(guān)系m =rtsd(1-)svederg方程方程:五、 蛋白質(zhì)含量的測定l定氮法：靈敏度較低定氮法：靈敏度較低l雙羧脲法：樣品量雙羧脲法：樣品量0.2-1.7mg/l0.2-1.7mg/llfolin-lowryfolin-lowry法：在堿性條件下磷鉬酸、磷

17、法：在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，將其與雙羧脲法結(jié)合起來，蛋白藍(lán)色化合物，將其與雙羧脲法結(jié)合起來，蛋白質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm650nm具具有特定的吸收。靈敏度較高有特定的吸收。靈敏度較高2525 g-250g-250 g/ml.g/ml.考馬斯亮藍(lán)法（考馬斯亮藍(lán)法（bradfordbradford法）法）考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)g250g250是一種帶有負(fù)電荷的染料，是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化合物，在形成藍(lán)色化合物，在595nm595nm具有特定吸收，反具有特定吸收，反應(yīng)簡便、快速、靈敏度高，應(yīng)簡便、快速、靈敏度高，5-50 5-50 g/mlg/ml。l紫外吸收法紫外吸收法l由于核酸在由于核酸在260nm260nm具有光吸收，對(duì)測定干擾較具有光吸收，對(duì)測定干擾較大，可采用大，可采用280nm280nm、260nm260nm同測法。