基因工程綜合實驗開題報告格式(1)

1、 基因工程綜合實驗開題報告項目名稱： 基因工程菌中Taq聚合酶的提取及活性鑒定 DNA探針的標(biāo)記與Southern雜交 學(xué) 院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)年級： 12生技2班 成員及學(xué)號： 陳光煜 3125413118 任勇杰 3125313131 吳藝委 3125413128 吳少烽 3125413116 2015 年 4 月 12 日一、立題意義及國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀與存在問題實驗二TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶，最早于1976年首次從水生棲熱菌中分離得到。由于TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，Saiki等于1988年將該酶成功地用于PCR技術(shù)。Taq 酶在PCR 反應(yīng)中所

2、起的作用是利用其35聚合酶活性以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個加到3-OH末端；同時利用其53外切酶活性即能識別和消除錯配的引物末端， 與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)， 又可以從5 端水解核苷酸， 還能經(jīng)過幾個核苷酸起作用，切除錯配的核苷酸。由此在鏈延伸過程中實現(xiàn)鏈替換，并將被替換的探針切斷，故可進(jìn)行定性與定量檢測。VentTM DNA多聚酶 ： 是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔 （Vent） 中分離的超級嗜熱菌-能生長于98中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，

3、它能耐100高溫且2h以上仍有活力， 并且具有35外切酶活性的校正能力， 錯誤擴(kuò)增的機(jī)率比Taq酶降低一倍。近年， 經(jīng)過基因改造的Hot Start Taq DNA聚合酶，因其低溫時酶沒有活性， 94-95加熱后開始反應(yīng)，從而抑制了低溫條件下的非特異性擴(kuò)增， 大大提高了PCR反應(yīng)的特異性， 同時Hot Start Taq DNA 聚合酶能為PCR反應(yīng)提供更高的產(chǎn)量及靈敏度、特異性，已逐漸成為PCR 技術(shù)的主流。不過，Taq聚合酶的缺點(diǎn)之一為催化DNA合成時的相對低保真性。它缺乏3'5'核酸外切酶的即時校正機(jī)制，出錯率為1/9000。實驗三探針標(biāo)記：目前作為探針的標(biāo)記物有兩大類:

4、 一類是同位素 ,一類是非同位素PCR標(biāo)記方法是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在Taq酶的作用下, 將DIG-11 -dUTP摻入到新合成的DNA鏈中,適用于100bp10kb的DNA探針的標(biāo)記：PCR標(biāo)記方法是目前較先進(jìn)的標(biāo)記方法, 可用于制備高比活性的 DNA 探針,較其他標(biāo)記方法而言 , 不但經(jīng)濟(jì)、快速 , 而且具有模板用量少(2 10ng),純度不高的模板也可用于標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),需要優(yōu)化的條件少, 標(biāo)記探針的靈敏度、產(chǎn)量都較高 ,因此被廣泛應(yīng)用于基因組 Southern印跡, Northern印跡 ,文庫篩選 ,斑點(diǎn) / 狹縫印跡, 原位雜交等。隨機(jī)引物標(biāo)記，即本實驗采用的同位素標(biāo)記方法，是以六聚寡

5、核苷酸為引物, 待標(biāo)記的DNA為模板 , 在DNA 聚合酶Klenow片段作用下, 將DIG -11- dUTP 摻入到新合成的DNA 鏈中 , 適用于100bp2kb的DNA 探針的標(biāo)記。隨機(jī)引物標(biāo)記法對模板純度要求很高, 而且所需模板量較大, 耗時較長,制備后的探針需純化后才可用于雜交分析, 否則會造成較高的雜交背景。隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針不具備上述 PCR標(biāo)記法的優(yōu)點(diǎn)。Southern印跡雜交又稱凝膠電泳壓印雜交技術(shù)，是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。該技術(shù)是1975年,Southern印跡雜交（Southern blot）由英國人埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin Mellor So

6、uthern）創(chuàng)建。具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交形成雙鏈。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。

7、早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性后，經(jīng)毛細(xì)管的虹吸作用，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。印跡方法如電轉(zhuǎn)法、真空轉(zhuǎn)移法；濾膜發(fā)展了尼龍膜、化學(xué)活化膜（如APT、ABM纖維素膜）等。利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。當(dāng)前，使用0. 4 mol L NaOH 溶液將瓊脂糖凝膠上的 DNA 在變性的同時轉(zhuǎn)移到尼龍膜上, 晾干膜后無需固定就可以直接用于雜交 。預(yù)雜交液和雜交液選用 Church 緩沖系統(tǒng), 該緩沖系統(tǒng)中僅需 10 g L BSA 作為封閉劑即可。 整個洗膜過程可簡化為一種溶

8、液、 2 3 次洗滌。 堿變性及轉(zhuǎn)移后的尼龍膜, 也可以用于地高辛 ( DIG) 等非放射性檢測系統(tǒng),并可耐多輪雜交和洗脫。 本方法可適用于包括高等植物基因組在內(nèi)的多種生物材料的 DNA 檢測。Southern印跡雜交最大的不足是操作程序繁瑣, 對基因組 DNA 的提取、 純化、 酶切等均有較高要求, 要獲得理想雜交結(jié)果需要反復(fù)摸索。二、本課題的主要研究內(nèi)容和方法、步驟、預(yù)期結(jié)果實驗二主要研究內(nèi)容：TaqDNA聚合酶的提取及活性鑒定方法：透析袋處理提純、SDS-PAGE檢測提取純化的TaqDNA聚合酶純度步驟：（一）活化和誘導(dǎo)（1）劃線分離，37過夜（2）挑取單菌落接種到適量LB培養(yǎng)基的試管中

9、（含6080g/mL氨芐青霉素AMP100），37振蕩培養(yǎng)過夜。（3）以 1: 100 ( v/v)的比例轉(zhuǎn)接到同樣的培養(yǎng)基中，37、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)到OD600值約為0.81.0（對數(shù)中期，大約6.57.5h）（4）加入IPTG至終濃度為2.0mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)12 h。（二）重組 Taq DNA聚合酶的提取和純化收集菌體(3500g離心 10min)每 40 mL菌液離心后加入4 mL洗脫緩沖液，重懸（加入比例10:1）3500 g離心 3 min重新收集菌體加入2mL預(yù)裂解緩沖液，重懸，室溫放置 15 min（20:1）加入2 mL裂解緩沖液（現(xiàn)配現(xiàn)用），75孵育1

10、 h（20:1）然后將裂解混合液轉(zhuǎn)移到離心管，4 15000g離心15 min20min轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，加入1.2g硫酸銨（每毫升上清液加0.3g，終濃度30%），室溫迅速混勻，4靜置過夜(有文獻(xiàn)說室溫放置更佳)15000g離心15 min20min，將蛋白沉淀物重新懸浮至 800L洗脫緩沖液（50:1）在儲存透析液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中透析（需前處理）至少12 h。透析后，用儲存緩沖液1: 1稀釋，儲存于- 20（三）Taq DNA聚合酶的活性PCR測定以提取的Taq DNA聚合酶和商品Taq DNA聚合酶分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（PCR體系和條件見實驗“目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆”），比較擴(kuò)增

11、效果，并拍照。（四）Taq DNA聚合酶的分子量及純度檢測以商品Taq DNA聚合酶為對照，用4 %濃縮膠和12 %分離膠的十二脘基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 檢測提取純化的Taq DNA聚合酶的純度，各取20L加入等量的2×上樣緩沖液，100加熱3min，冷卻后即可上樣，同時將低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。預(yù)期結(jié)果：提取的Taq DNA聚合酶和商品Taq DNA聚合酶分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效果無明顯差異。提取的Taq DNA聚合酶通過十二脘基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳跑出來的條帶與商品酶的結(jié)果無明顯差異。實驗三 主要研究內(nèi)容：DNA探針的標(biāo)記與Southern

12、雜交 方法：放射性同位素標(biāo)記DNA探針、Southern雜交 步驟：一、放射性同位素標(biāo)記DNA探針（隨機(jī)引物標(biāo)記）在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通過與單鏈的模板配對可以啟動 DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的隨機(jī)序列（如6堿基引物則有46 =4096種），可以與任意模板序列相配對在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物中有一種是用同位素標(biāo)記的，因而可產(chǎn)生均勻一致高比活放射性探針。同位素標(biāo)記的探針DNA的平均長度與引物的濃度成反比，The klenow fragment去除了E.coli DNA polymerase I的5 '3 &

13、#39;的外切酶活性，具有5 '3 '的聚合酶活性及3 '5 '外切酶活性。 二、Southern雜交（PCR-Southern雜交）（一）探針模板的制備利用PCR方法對雜交目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并回收PCR產(chǎn)物，以供探針制備和雜交。注意：PCR時應(yīng)多做幾管，以便增加PCR產(chǎn)物的回收量。（二）探針的制備（1）向一個反應(yīng)管仲中加入1g模板DNA（線性或超螺旋）和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達(dá)16L。（2）沸水浴10min以變性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全變性對于標(biāo)記的有效性是十分重要的。（3）充分混合DIG-High Prime（1號管），并取4L加

14、入到變性DNA中，混合并簡單離心，37孵育1小時或者過夜。注意：較長的孵育時間（最高達(dá)20h）能夠提高地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量。（4）加入2L 0.2M EDTA（pH8.0）和/或65加熱10min終止反應(yīng)。（三）轉(zhuǎn)膜和固定（1）選取有代表性的植物基因，進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上，在3V/cm的電壓下電泳1h。（2）電泳完畢后，將凝膠用ddH2O漂洗兩次，用鋒利刀片切去凝膠多余的部分，并在凝膠左上角切去一角作為標(biāo)記。（3）將凝膠轉(zhuǎn)入數(shù)倍體積的變性液中，溫和搖動45min，使DNA變性。（4）將凝膠轉(zhuǎn)入去離子水中漂洗片刻，轉(zhuǎn)入中和液室溫溫和振蕩5min

15、使之中和，更換中和液再浸泡15min。（5）浸泡的同時，準(zhǔn)備一塊長和寬均大于凝膠的玻璃板，上面用濾紙覆蓋，充當(dāng)吸液燈芯。將蓋有濾紙的玻璃置于一塑料盒上（寬于玻璃板），內(nèi)注入足量2×SSC溶液，液面略低于玻璃板，待濾紙充分浸濕后用玻棒趕盡氣泡。（6）用刀片裁一張硝酸纖維素濾膜，長和寬分別比凝膠大1mm。隨后將裁好的濾膜用去離子水徹底浸濕，剪去一角后在2×SSC溶液中浸泡1520min。（7）從中和液中取出凝膠，翻轉(zhuǎn)以使其背面向上，后放于玻璃板上濾紙的中央位置，趕盡氣泡，并用parafilm膜封住凝膠邊緣，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至凝膠上方的紙層中。（8）在凝膠上方放

16、置濕潤的硝酸纖維素濾膜，并使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應(yīng)剛好超過凝膠上部加樣孔一線的邊緣，用玻棒趕盡濾膜與凝膠間的氣泡。（9）用2×SSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的濾紙，放于硝酸纖維素濾膜上方，用玻棒趕盡氣泡。（10）切一疊（58cm高）略小于濾紙的上方，上部放置玻璃板和重物。轉(zhuǎn)移824h，其間及時更換濾紙并補(bǔ)充2×SSC溶液。（11）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，去除濾紙，翻轉(zhuǎn)凝膠和濾膜，經(jīng)凝膠的一面朝上，置于一張干的濾紙上，用鉛筆輕輕地在濾膜上標(biāo)記加樣孔的位置。然后將濾膜在6×SSC溶液中于室溫浸泡5min，然后將其置于一濾紙上于室溫晾干30min以上，隨后在80烘烤3

17、0min2h，然后將濾膜用兩層濾紙包好放于28下備用。（四）分子雜交（1）配制預(yù)雜交液，每平方厘米硝酸纖維素膜約需預(yù)交液0.2ml。（2）將含有靶DNA的硝酸纖維素膜漂浮于6×SSC液面上使由上而下完全濕潤后，使濾膜在液體內(nèi)浸泡2min。（3）將濾膜封入雜交袋，留一小口，按照每平方厘米硝酸纖維素膜加入0.2ml預(yù)交液，趕盡氣泡后，嚴(yán)密封口，外面再套一個雜交袋后放入恒溫水浴搖床中，42輕輕搖動，預(yù)雜交30min或過夜。（4）預(yù)雜交的同時，68預(yù)熱雜交液，并按2025ng/ml取出5ul探針于沸水浴中變性5min，然后迅速置于冰上冷卻3min，加入到預(yù)熱好的雜交液中。（5）將預(yù)雜交液倒掉

18、，迅速向袋中加入預(yù)熱的雜交液（含標(biāo)記探針），趕盡氣泡后封好，再套一個雜交袋并封口后于42雜交過夜。（6）取出濾膜，于濾膜漂洗緩沖液中漂洗2×5min。（7）取出濾膜，于經(jīng)6568預(yù)熱的濾膜漂洗緩沖液中漂洗2×15min同時于6568不斷攪動。（五）免疫檢測雜交和嚴(yán)謹(jǐn)洗滌后，將膜簡單的用洗滌緩沖液沖洗1-5min；在100mL 封阻液中孵育30min；在20mL 抗體溶液中孵育30min；用100mL洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15min；在20mL檢測緩沖液中平衡2-5min；將膜上帶有DNA的一面朝上，放在一個折疊夾上（或者雜交袋），向膜上加入2mL的新鮮配制的底物顯色液。均

19、勻的鋪平底物，且膜上不能有氣泡。保持膜靜止，避光。15-25中孵育到有顏色出現(xiàn)為止；三、研究工作時間安排及具體進(jìn)度周一（5.4）：進(jìn)行實驗二前的各項準(zhǔn)備工作，配制LB培養(yǎng)基、洗脫緩沖液（4）、裂解緩沖液、儲存緩沖液、儲存透析液；將Tris-HCl(pH7.9) 0.5mol/L、EDTA 0.5mol/L、KCl 1mol/L、甘油、無菌水高壓滅菌；將IPTG 100mmol/L；DTT 0.648mol/L；AMP 100mmol/L；過濾除菌，-20保存；并進(jìn)行透析袋使用前處理；活化和誘導(dǎo)：（1）劃線分離，37過夜（2）挑取單菌落接種到適量LB培養(yǎng)基的試管中（含6080g/mL氨芐青霉素A

20、MP100），37振蕩培養(yǎng)過夜。（3）以 1: 100 ( v/v)的比例轉(zhuǎn)接到同樣的培養(yǎng)基中，37、200r/min繼續(xù)培養(yǎng)到OD600值約為0.81.0（對數(shù)中期，大約6.57.5h）（4）加入IPTG至終濃度為2.0mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)12 h。周二（5.5）：進(jìn)行重組 Taq DNA聚合酶的提取和純化：收集菌體(3500g離心 10min) 每 40 mL菌液離心后加入4 mL洗脫緩沖液，重懸（加入比例10:1）3500 g離心 3 min重新收集菌體加入2mL預(yù)裂解緩沖液，重懸，室溫放置 15 min（20:1）加入2 mL裂解緩沖液（現(xiàn)配現(xiàn)用），75孵育1 h（20:1

21、）然后將裂解混合液轉(zhuǎn)移到離心管，4 15000g離心15 min20min轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，加入1.2g硫酸銨（每毫升上清液加0.3g，終濃度30%），室溫迅速混勻，4靜置過夜15000g離心15 min20min，將蛋白沉淀物重新懸浮至 800L洗脫緩沖液（50:1）在儲存透析液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中透析（需前處理）至少12 h。透析后，用儲存緩沖液1: 1稀釋，儲存于- 20周三（5.6）下午：進(jìn)行Taq DNA聚合酶的活性PCR測定：以提取的Taq DNA聚合酶和商品Taq DNA聚合酶分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較擴(kuò)增效果，并拍照。同時進(jìn)行Taq DNA聚合酶的分子量及純度檢測：以商品Taq

22、DNA聚合酶為對照，用4 %濃縮膠和12 %分離膠的十二脘基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 檢測提取純化的Taq DNA聚合酶的純度，各取20L加入等量的2×上樣緩沖液，100加熱3min，冷卻后即可上樣，同時將低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。周六（5.9）上午：配制實驗所需溶液，有母液、轉(zhuǎn)膜和固定所需工作液、雜交工作溶液、免疫檢測工作液。周六（5.9）下午：進(jìn)行探針模板的制備（利用PCR方法）、探針的制備（過夜孵育）周日（5.10）：進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移8h）以及固定（烘烤30min），以及部分的分子雜交（預(yù)雜交30min，雜交過夜。周一（5.11）：進(jìn)行分子雜交剩余步驟，

23、以及進(jìn)行免疫檢測（顯色）。四、預(yù)期所需藥品和儀器名稱及數(shù)量清單 實驗二旋渦混合器，移液槍，槍頭，1.5ml 微量離心管，40或50ml離心管，雙面離心管架，臺式冷凍離心機(jī)，紫外分光光度劑，水浴鍋，制冰機(jī)，PH計，恒溫?fù)u床，磁力攪拌器，電泳儀，梳子等，搖菌試管，三角燒瓶，燒杯，針筒，濾頭，培養(yǎng)皿，試劑瓶。實驗材料（1）菌種：含Taq DNA聚合酶基因的E.coli工程菌（2）酵母提取物，蛋白胨，NaCl，瓊脂粉，AMP（氨芐青霉素），葡萄糖，EDTA（乙二胺四乙酸），Tris（三羥甲基氨基甲烷），溶菌酶，鹽酸，氯化鉀，PMSF（苯甲基磺酰氟），吐溫20，NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，DTT(二

24、硫蘇糖醇)，甘油，IPTG，無水酒精。 實驗三 尼龍膜，DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I實驗材料1.雜交母液的配制（1）5M NaCl：稱取292.2g NaCl溶于800ml ddH2O中，定容至1L，高壓滅菌。（2）10M NaOH：稱取80g NaOH溶于140ml ddH2O中，定容于200ml。（3）20×SSC：稱取175.3gNaCl、88.2g檸檬酸鈉溶于800ml ddH2O中，用10M的NaOH調(diào)pH7.0，定容至1L。（4）1M Tris-HCl：稱取121.1g Tris加入800ml ddH2O中，邊攪拌邊加入40ml濃HCl，最后用稀HCl調(diào)pH8.