現(xiàn)代分子生物研究方法PPT課件

1、分子生物學(xué)從20世紀(jì)中葉開始高速發(fā)展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技術(shù)的進步?；虿僮鳎篋NA的切割和連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析、基因的人工合成、定點突變和PCR擴增。這是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。基因工程：在體外將核酸分子插入載體分子中，使之進入寄主細(xì)胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。第1頁/共73頁跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其他技術(shù)的根本特征。本章將在回顧重組DNA技術(shù)史上主要事件的基礎(chǔ)上，討論DNA操作技術(shù)、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等3個環(huán)節(jié)。第2頁/共73頁5

2、1 重組DNA技術(shù)史上的重大事件 半個世紀(jì)以來，分子生物學(xué)研究取得了前所未有的進步，主要有3大成就: 第一，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題基因的分子載體是DNA; 第二，DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題; 第三，“中心法則”和操縱子學(xué)說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。第3頁/共73頁 DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進步直接推動了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展。 重組DNA的核心是用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶對DNA分子進行體外切割和連接。這些酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。限制性核酸內(nèi)切酶能從

3、特定堿基序列位點切開DNA。1972，Boyer實驗室發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶EcoRI能特異識別GAAUC序列，將DNA在這個位點切開產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。第4頁/共73頁他們還發(fā)現(xiàn)，EcoRl酶切產(chǎn)生的任何不同來源的DNA片段能通過粘性末端之間堿基互補作用而彼此“粘合”起來。此后，大量類似于EroRl但具有獨特識別序列的核酸內(nèi)切酶被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電冰技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。第5頁/共73頁第6頁/共73頁第7頁/共73頁52 DNA操作技術(shù)521 核酸的凝膠電泳 1基本原理 生物大

4、分子在一定pH條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構(gòu)型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。第8頁/共73頁 在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場當(dāng)中，會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方

5、向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。第9頁/共73頁2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉末加熱到熔點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)。經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點瓊脂糖，在較低的溫度下便會熔化，常用于DNA片段的制備電泳。第10頁/共73頁 瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間;聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為11000bp之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。例如，20%的聚丙烯酰胺凝膠可分離1-6bp的DNA小片段，而若要分離1000bp

6、的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝膠。再如，2%的瓊脂糖凝膠可分離300bp的雙鏈DNA分子，而分離大片段DNA就要用低濃度(0.3%1.0%)的瓊脂糖凝膠。第11頁/共73頁第12頁/共73頁 在凝膠電泳中，加入適量嗅化乙錠(ethidium bromide，簡稱EB)染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快捷，DNA帶中含0.05g的微量DNA，可以清晰地檢測出來。EB能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間(圖5-4)，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。把EB直接加到凝膠介質(zhì)中，染料便會與DNA分子結(jié)合，卻不能與凝膠相結(jié)合。這樣就只有DNA分子能吸

7、收EB并發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與DNA片段的數(shù)量成正比。第13頁/共73頁5.2.2 核酸的分子雜交 將特定的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的同源區(qū)段（互補）就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子，其親緣關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此，DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關(guān)系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。第14頁/共73頁 在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或R

8、NA分子，都必須通過毛細(xì)管或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地吸印上去的，因此，核酸雜交也被稱為DNA印跡雜交。由于該方法是EMSouthern于1975年首先設(shè)計出來的，所以又叫做Southern blotting。雜交中常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜和二乙氨基乙基纖維素濾膜(DEAE)等。第15頁/共73頁 核酸分子雜交包括兩個步驟：第一，將樣品轉(zhuǎn)移到濾膜（印跡轉(zhuǎn)移）;第二，將濾膜與DNA或RNA探針進行雜交。具體步驟：1、轉(zhuǎn)移。2、在80下烘烤12h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上。3、放入探針溶液中進行核酸雜交。一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交

9、之后，就很難再解鏈。4、用漂洗法去掉沒有雜交上的探針分子。放射性同位素標(biāo)記的探針可檢測2ng ；為了安全，我們用DIG（地高辛）標(biāo)記探針，熒光法檢測雜交信號 。第16頁/共73頁第17頁/共73頁 基因組DNA被限制性內(nèi)切酶酶切為DNA片段；各片段經(jīng)電泳后在凝膠分為條帶；（c）中由下到上是：玻璃板、一層濾紙、凝膠、濾膜、很多層濾紙、玻璃板、重物。通過毛細(xì)管作用將凝膠上的DNA條帶原封不動地吸印到濾膜上去。（d）在80下烘烤12h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上并形成單鏈。(e) 濾膜放入帶標(biāo)記的DNA或RNA核酸探針溶液中進行核酸雜交。第18頁/共73頁523 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 細(xì)菌轉(zhuǎn)

10、化：一種細(xì)菌菌株由于捕獲了外源DNA導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。 大腸桿菌是分子生物學(xué)家常用的實驗材料，也是基因工程重要的實驗菌株。將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫(0)預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細(xì)胞膨脹(形成原生質(zhì)球)，并與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細(xì)胞表面的復(fù)合物。立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會被細(xì)胞所吸收。發(fā)生了遺傳改變的菌株帶著變異而遺傳。第19頁/共73頁524 核苷酸序列分析 儀器分析發(fā)展很快。 如果將來做測序工作，有了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，就可以做。 如果將來工作中需要測序，一般送到公司去測。 下面介紹測序的基本原理。第20頁/共73頁第21

11、頁/共73頁525 基因擴增 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應(yīng)，經(jīng)數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。第22頁/共73頁PCR技術(shù)的原理 首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動(引導(dǎo))新鏈的合成，所以，新合成的DNA鏈的起點，由加入到反應(yīng)混合物中的一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。第23頁/共73頁PCR反

12、應(yīng)的全過程 DNA解鏈(變性)、引物與模板DNA相結(jié)合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不斷重復(fù)。多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA數(shù)，即兩條引物位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值是2n。第24頁/共73頁53 基因克隆的主要載體系統(tǒng)531 質(zhì)粒DNA及其分離純化 細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨立于染色體并能自主復(fù)制的遺傳成分，質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子（有少量線性質(zhì)粒、RNA質(zhì)粒報道）。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。 第25頁/共73頁 質(zhì)

13、粒用作基因克隆的載體分子，獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子很重要。 寄主細(xì)胞的裂解是分離質(zhì)粒DNA的關(guān)鍵步驟，加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉(SDS)來促使大腸桿菌細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解反應(yīng)需要相當(dāng)溫和，同時實驗操作又十分謹(jǐn)慎仔細(xì)，這樣，絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，可以用高速離心的方法使之與細(xì)胞碎片一起被沉淀除去，得到高純度的質(zhì)粒DNA。 第26頁/共73頁5311氯化鉛密度梯度離心法 質(zhì)粒DNA一般僅占細(xì)胞總DNA的l%2%左右，而且其化學(xué)結(jié)構(gòu)與寄主染色體DNA之間并沒有什么差別，所以，質(zhì)粒DNA的純化須從兩者高級結(jié)構(gòu)上的差異尋找依據(jù)。在細(xì)胞裂解及DNA分離的過程中，大分子質(zhì)

14、量的細(xì)菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應(yīng)的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，大部分仍能保持完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第27頁/共73頁 方法：將含有EtBr的CsCl溶液加到大腸桿菌裂解液中，EtBr分子便會通過嵌入作用而結(jié)合到DNA鏈上，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋反應(yīng)。大腸桿菌染色體DNA片段具有游離的末端而易于解旋，會結(jié)合大量的EtBr分子。共價閉合環(huán)狀的DNA分子質(zhì)粒，只能發(fā)生有限的解旋反應(yīng)，限制了EtBr分子的結(jié)合數(shù)量，染色體DNA片段比質(zhì)粒DNA結(jié)合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr復(fù)合物中，結(jié)合的EtBr分子數(shù)量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr達到飽和濃度的條件下，質(zhì)

15、粒DNA就要比線性的染色體DNA片段具有更高的密度。通過氯化銫密度梯度離心之后，它們就會被平衡在不同的位置，從而達到純化質(zhì)粒DNA的目的。第28頁/共73頁第29頁/共73頁5312 堿變性法 在pH值介于12.012.5的條件下加熱DNA溶液，線性DNA會被變性，而閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA則不會被變性，盡管在這樣的條件下連接DNA互補鏈之間的氫鍵也會斷開，但由于閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補的兩條鏈仍然會緊密地結(jié)合在一起。與此相反，線性DNA的兩條鏈則會完全分開。若用制冷或恢復(fù)中性的方法處理DNA混合物，質(zhì)粒DNA能迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，但隨機斷裂產(chǎn)生的線性染色體DNA分子，彼

16、此已經(jīng)分離的互補鏈之間的復(fù)性作用就不會那么迅速而準(zhǔn)確，往往聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道被離心沉淀下來?？梢杂镁凭恋矸ㄊ占匀粶粼谏锨逡褐械馁|(zhì)粒DNA。這目前最流行的方法。第30頁/共73頁532 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體5321pSC101質(zhì)粒載體 pSC101是低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細(xì)胞僅有12個拷貝。其分子大小為9.09 kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因(tetr)。該質(zhì)粒具有EcoRI、Hin d、Bam H I、Sal I、Xho I、Pvu 以及Sma I等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單切割位點，在Hin d、Bam H I和 Sal I 等3個位點克隆外

17、源DNA，都會導(dǎo)致tetr基因失活。第31頁/共73頁pSClO1質(zhì)粒具有可插人外源DNA的多個限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點，還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，便于篩選。因此，它第一個被選為真核基因的克隆載體。這個質(zhì)粒載體有其明顯的缺點，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSClOl DNA，其產(chǎn)量就要比其他質(zhì)粒載體低得多。第32頁/共73頁5322 pBR322質(zhì)粒載體 為改進轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，有必要用人工的方法構(gòu)建一種既帶有多種抗藥性的強選擇記號，又具有低分子質(zhì)量、高拷貝以及外源DNA插入不影響復(fù)制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點等優(yōu)點的新的質(zhì)粒載體。目前，在基

18、因克隆中廣泛使用的pBR322質(zhì)粒，就是按這種設(shè)想構(gòu)建的一種大腸桿菌質(zhì)粒載體。第33頁/共73頁 pBR322質(zhì)粒是由3個不同來源的部分組成的:含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四環(huán)素抗性基因(tetr)和DNA復(fù)制起點(ori)(圖5-22)。 pBR322質(zhì)粒載體較小,其長度為4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段較大（6-8kb）的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。第34頁/共73頁 pBR322質(zhì)粒載體具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，方便選擇。例如，將外源DNA克隆在Bam H I位點上，將這樣的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌細(xì)胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的選擇

19、性培養(yǎng)基平板上，那么存活下來的菌落都將具有Ampr的表型，它們也必定是獲得了編碼有這種抗性基因的轉(zhuǎn)化子。第三個優(yōu)點是具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細(xì)胞中可累積10003000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。第35頁/共73頁533 噬菌體載體 噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名叫作bacteriophage，來源于希臘文“phagos”，系指吞噬之意。如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴增特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細(xì)菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細(xì)胞，就既不能生長也不能復(fù)制，這是因為大多數(shù)的噬菌體

20、只能利用寄主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進行生長和增殖。第36頁/共73頁噬菌體有兩種類型：1、溶菌周期（烈性噬菌體）：噬菌體將其感染的寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠”，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。2、溶源生長周期（溫和噬菌體）：在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA被整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。第37頁/共73頁以噬菌體DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，只要不導(dǎo)致重要的噬菌體基因失活，這種重組的噬菌體DNA感染了寄主細(xì)胞之后，插入的外源DNA片段便會隨著噬菌體DNA分子一道增殖?？砂凑疹愃朴谥苽滟|(zhì)粒DNA的方法，分

21、離到大量的重組體噬菌體DNA，實現(xiàn)克隆基因的擴增。第38頁/共73頁噬菌體的分子為48.5kb，是一種中等大小的溫和噬菌體。迄今已經(jīng)定位的噬菌體基因至少有61個，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的調(diào)控（必需基因）;另一部分基因則被稱為非必需基因；當(dāng)它們被外源基因取代之后，不影響噬菌體的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重組噬菌體DNA，可以隨寄主細(xì)胞一起被復(fù)制和增殖。第39頁/共73頁 在噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補的5單鏈突出序列（粘性末端）。當(dāng)噬菌體的線性DNA分子注入到被感染寄主細(xì)胞內(nèi)時，會通過粘性末端之間的互補作用，形成環(huán)形雙鏈DN

22、A分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5- P和3-OH基團封閉起來。這種粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點cohesive-end site，粘性末端位點)。第40頁/共73頁 野生型的噬菌體DNA具有太多的常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位點（5個Eco R I酶切位點和7個Hin d 酶切位點）。這使它不適于用作基因克隆的載體，想辦法從野生型噬菌體基因組DNA上消去一些多余的酶切位點并切除非必要區(qū)段，將它改造成適用于基因克隆的載體。介紹改造后的兩種類型： 1插入型載體 外源DNA克隆到插入型載體分子上，就會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性

23、，可分為以下兩種亞型。第41頁/共73頁(1)免疫功能失活插入型載體：載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種限制性內(nèi)切酶的單切割位點。當(dāng)外源DNA片段插入到這種位點上時，阻礙其進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插人的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)學(xué)上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標(biāo)志。第42頁/共73頁 (2) -半乳糖苷酶失活插入型載體：這種載體的基因組中含有大腸桿菌的lacZ區(qū)段，編碼-半乳糖苷酶。由這種載體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑，但在克隆過程

24、中，如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，那么由這種重組體感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑。第43頁/共73頁2替換型載體又叫作取代型載體（substitution vector)，是在噬菌體基礎(chǔ)上改建的，在其中央部分有一個可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段。當(dāng)外源DNA插人此類載體時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。第44頁/共73頁在NM781替換型載體中，可取代的Eco R I片段，編碼有一個supE基因，這種NM781噬菌體感染細(xì)胞后，其lacZ基因的

25、突變琥珀被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。但是，如果這個具有supE基因的Eco R I片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。第45頁/共73頁534 柯斯質(zhì)粒載體 “Cosmid”一詞是由英文“cos site-carring plasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質(zhì)粒?？滤官|(zhì)粒是一類由人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。 柯斯質(zhì)粒載體pHC79質(zhì)粒兼具了噬菌體載體和pBR322質(zhì)粒載體兩方面的優(yōu)點，其克隆能力為3145kb，而且能夠被包裝成為具有感染能力的噬菌體顆粒

26、。第46頁/共73頁柯斯質(zhì)粒載體的特點 第一，具有噬菌體的特性。在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效轉(zhuǎn)染對噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。進入寄主細(xì)胞之后的柯斯質(zhì)粒DNA分子，能按照噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化。 第二，具有質(zhì)粒載體的特性?？滤官|(zhì)粒載體具有質(zhì)粒復(fù)制子，因此能像質(zhì)粒DNA一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制，并且能在氯霉素作用下，獲得進一步擴增。第47頁/共73頁第三，具有抗菌素抗性基因，可供重組體分子選擇。第四，具有高容量的克隆能力?？滤官|(zhì)粒載體的分子僅具有一個復(fù)制起點，一兩個選擇記號和cos位點等三個組成部分，其分子較小，一般只有57kb左右。因此，可以插入

27、到載體上并能被包裝成噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，克隆極限可達45kb左右。第48頁/共73頁54 基因的分離與鑒定 生命科學(xué)各個研究，“克隆”（clone) 被廣泛使用。通?？寺∈菬o性繁殖。在不同層面的含義： 在多細(xì)胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體；從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子屬于同一克隆。 在細(xì)胞水平上，克隆是指由同一個祖細(xì)胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。 在分子生物學(xué)上，將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過程稱為克隆。第49頁/共73頁 基因克隆包含待研究的目的基因的分離和鑒定兩個主要內(nèi)

28、容，整個過程包括如下4個基本步驟: (1)用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化; (2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng); (3)將人工重組的DNA分子導(dǎo)人它們能夠進行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞; (4)重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。第50頁/共73頁54l DNA片段的產(chǎn)生與分離從實驗材料中制備包括“目的基因”在內(nèi)的DNA片段群體，必須包容整個基因組的全部序列，DNA片段的大小要適合于基因操作的要求。第51頁/共73頁 鳥槍法(shot-gun approach)：限制性內(nèi)切酶消化供體基因組DNA，直接將消化產(chǎn)物與載體分子相連接。重組體分子帶有大小不同的插入片段。 真核基

29、因組龐大，載體承受外源DNA插入為10003000bp，將產(chǎn)生幾十萬個大小不同的DNA片段，這些大小不同的DNA片段形成的重組體分子組成相應(yīng)克隆群體。要想從如此巨大的群體中選出帶有目的基因的克隆太費事。第52頁/共73頁局部雙酶消化法可以保證DNA產(chǎn)物大小在1030kb左右，通過離心或制備凝膠電泳技術(shù)，得到約為20kb的隨機群體并將其克隆到合適的載體上，克服鳥槍法的困難。第53頁/共73頁542 重組體DNA分子的構(gòu)建 1外源DNA片段定向插入載體分子： 載體分子和待克隆的DNA分子都是用同一對(NE1和NE2) 切割，二者將按一種取向退火形成重組DNA分子，保證外源DNA片段定向插入載體分子

30、。 若載體分子和外源DNA插入片段不能產(chǎn)生出互補的粘性末端，則采用附加銜接物的辦法來提高平末端之間的連接效率。 第54頁/共73頁第55頁/共73頁2最佳連接反應(yīng)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的線性載體分子的自身不允許再環(huán)化。采用堿性磷酸酯酶處理由內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的線性載體分子，除去該DNA的5-P末端，而留下一個5-OH基團。當(dāng)插入了外源DNA片段，其5為-P末端，從而能有效重組。第56頁/共73頁 在連接反應(yīng)中，使用正確的載體DNA和外源DNA的比例，是獲得高產(chǎn)重組轉(zhuǎn)化子的重要因素。 用噬菌體或柯斯質(zhì)粒作載體時，配制高比值的載體DNA/供體DNA的連接反應(yīng)體系有利于重組分子的形成。 用質(zhì)粒作為克隆載體

31、，其重組體分子由一個載體分子和一個供體DNA片段連接環(huán)化而成，當(dāng)載體DNA與供體DNA的比值為1時，有利于這類重組體分子的形成。第57頁/共73頁3重組體分子導(dǎo)人受體細(xì)胞的途徑 將外源重組體分子導(dǎo)人受體細(xì)胞的主要途徑包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類原核細(xì)胞和酵母等低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔則主要應(yīng)用于高等動物的真核細(xì)胞。在基因工程中有詳細(xì)介紹。第58頁/共73頁543 cDNA基因克隆 真核生物基因組DNA大，含有大量的重復(fù)序列和內(nèi)含子，難以直接分離到目的基因。通過RT-PCR可以部分解決。 高等生物一般具有35萬種左右不同的基因，在一定時間階段

32、的單個細(xì)胞或組織中，僅有15%左右的基因得以表達，產(chǎn)生出約500010000種不同的mRNA分子。第59頁/共73頁cDNA克隆的基本過程是通過一系列酶催作用，使總poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA基因文庫。第60頁/共73頁1高質(zhì)量mRNA的制備 可應(yīng)用Promega PolyAT tract mRNA分離系統(tǒng)分離poly(A)mRNA。將用生物素標(biāo)識的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的mRNA。第61頁/共73頁2反轉(zhuǎn)錄生成c