高臭氧濃度下小麥根際微生物群落功能基因表達(dá)的變化 分子生物學(xué)翻譯文獻(xiàn)作業(yè)

1、Shifts of functional gene representation in wheat rhizosphere microbial communities under elevated ozone譯文：高臭氧濃度下小麥根際微生物群落功能基因表達(dá)的變化雖然臭氧（O3）在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)植物的影響力已經(jīng)得到很好的研究，鮮為人知的是高濃度O3（eO3）對(duì)土壤微生物群落功能的影響。在這里，我們使用一個(gè)綜合功能基因陣列(GeoChip 3.0)探討其功能性成分，和高濃度臭氧條件下，煙農(nóng)19（O3-敏感）、揚(yáng)麥16（O3-相對(duì)敏感）這兩個(gè)普通小麥(Triticum aestivum L.)栽培

2、品種的根際微生物群落結(jié)構(gòu)。與環(huán)境臭氧(aO3)相比，eO3會(huì)導(dǎo)致土壤的pH值和總碳（C）在小麥籽粒和秸稈的百分比增加，并降低千粒重和土壤溶解有機(jī)碳(DOC)?；?GeoChip 雜交信號(hào)強(qiáng)度，雖然根際微生物群落的總體功能結(jié)構(gòu)沒有因eO3或品種而表現(xiàn)出明顯變化，但結(jié)果表明，參與C固定和退化，氮（N）固定，和亞硫酸鹽還原特定的功能基因的豐度產(chǎn)生了顯著的變化(P<0.05)，以應(yīng)對(duì)eO3和/或小麥品種的影響。同時(shí)，煙農(nóng)19表現(xiàn)出懷有的根際微生物功能群落在響應(yīng)eO3時(shí)比揚(yáng)麥16更敏感。此外，典范對(duì)應(yīng)分析表明，微生物群落參與碳循環(huán)的功能結(jié)構(gòu)很大程度上是由土壤和植物的特性，包括pH值，DOC，微生

3、物生物量碳C， C / N比和千粒重決定形成的。這項(xiàng)研究為我們理解eO3和小麥品種對(duì)土壤微生物群落的影響提供了新的見解。引言臭氧（O3）是一種大氣氣體，由于人類活動(dòng)和工業(yè)發(fā)展，其含量一直在上升。對(duì)于農(nóng)業(yè)系統(tǒng)而言，臭氧被認(rèn)為是潛在的最嚴(yán)重的具有植物毒性的空氣污染物，可能抑制植物生長，生產(chǎn)力和產(chǎn)量，更重要的是，它可能會(huì)極大地影響地面以下功能流程，如根系生長和碳（C）分配。預(yù)計(jì)在未來如果人為活動(dòng)導(dǎo)致臭氧的形成繼續(xù)有增無減，這種影響將更加迅速并對(duì)植物生產(chǎn)力，土壤碳和氮（N）的動(dòng)態(tài)，以及生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生顯著影響(聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會(huì)，2007年)。 小麥?zhǔn)鞘澜绲诙蠹Z食作物，年產(chǎn)量46.5億噸

4、，全世界收獲面積超過2億公頃。由當(dāng)?shù)亻_頂式氣室的研究結(jié)果和監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)推測(cè)，1999年在中國的長江三角洲地區(qū)，臭氧污染導(dǎo)致小麥約10的產(chǎn)量損失。目前，中國長江三角洲的平均臭氧濃度（ 7-10月）的范圍是38到46 ppb，預(yù)計(jì)到本世紀(jì)末，平均臭氧濃度將從42增加到63 ppb，而根據(jù)Feng和Kobayashi的薈萃分析，這將會(huì)導(dǎo)致大豆、 小麥和水稻的產(chǎn)量進(jìn)一步下跌10%，菜豆產(chǎn)量進(jìn)一步下跌20%。為減少這種 O3 對(duì)小麥產(chǎn)量負(fù)面影響的策略之一就是篩選那些更適應(yīng)eO3條件的品種。最近，在中國已有一些O3-相對(duì)敏感的小麥品種的報(bào)道，這些品種可能會(huì)避免在高臭氧環(huán)境中減產(chǎn)。 由于土壤系統(tǒng)依賴于植物的養(yǎng)分

5、投入和土壤中微生物的養(yǎng)分循環(huán)，由于eO3引起的營養(yǎng)通量的變化也可以導(dǎo)致土壤微生物的生物多樣性在結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生變化。近年來，大多數(shù)對(duì)根際微生物群落受 eO3 影響的研究主要是基于開頂式氣室，結(jié)果主要側(cè)重于微生物生物量及結(jié)構(gòu)的變化，和磷脂脂肪酸分析、 變性梯度凝膠電泳法，和/或單鏈構(gòu)象多態(tài)性法等方法。這些研究表明，eO3對(duì)不同的植物/生態(tài)系統(tǒng)下的土壤微生物群落影響很少或顯著。然而，目前研究eO3對(duì)土壤微生物的功能性進(jìn)程的影響的報(bào)道很少。全面審視eO3對(duì)根際微生物群落的功能成分、結(jié)構(gòu)和代謝潛力的影響是很重要的。 功能基因芯片技術(shù)（例如，GeoChip）已成為一個(gè)分析不同的生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落功能性成

6、分、 結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)的常規(guī)的分子工具。例如，GeoChip 3.0是用于高濃度CO2是如何影響土壤微生物群落，結(jié)果表明，土壤微生物群落的功能性成分，結(jié)構(gòu)和代謝潛力被轉(zhuǎn)移，這些與土壤有機(jī)碳和氮含量及植物生產(chǎn)力顯著相關(guān)。此外，它也應(yīng)用于研究全球變暖對(duì)土壤微生物群落的影響（溫度），和描述受砷污染的土壤微生物群落和被柑桔黃龍病菌感染柑橘樹的根際微生物群落。所有結(jié)果表明， GeoChip是一個(gè)強(qiáng)大并高通量的工具來具體地，靈敏地，定量地描述微生物群落并且將它們的結(jié)構(gòu)與環(huán)境因素和生態(tài)系統(tǒng)功能鏈接起來。 在這項(xiàng)研究中，我們假設(shè)eO3帶來的植物和土壤特性的變化將改變根際微生物群落的功能多樣性、組成、結(jié)構(gòu)和代謝潛力，

7、而這種影響將因小麥品種而不同。為了檢驗(yàn)這些假設(shè)，我們的目標(biāo)是（i）檢查eO3對(duì)煙農(nóng)19（O3敏感）和揚(yáng)麥16號(hào)（O3相對(duì)敏感）兩個(gè)栽培品種根際微生物功能基因的影響；（ii）區(qū)分這兩個(gè)品種之間是否有微分響應(yīng)；及（iii）了解高濃度臭氧條件下，根際微生物群落功能結(jié)構(gòu)和土壤及植物特性之間的相關(guān)性。這項(xiàng)研究是在一個(gè)位于中國江都市郊區(qū)的自由空氣的臭氧富集？(O3-FACE)的實(shí)驗(yàn)站點(diǎn)進(jìn)行。GeoChip 3被用于從GeoChip雜交信號(hào)強(qiáng)度來確定基因豐度。雖然根際微生物群落的總體功能結(jié)構(gòu)沒有在eO3或品種間發(fā)生顯著變化，結(jié)果表明eO3確實(shí)改變了參與C循環(huán)的功能基因的結(jié)構(gòu)和參與C、N和硫(S)循環(huán)的某些關(guān)

8、鍵功能基因的豐度，這或許是品種的依賴。這項(xiàng)研究為我們理解eO3和小麥品種對(duì)根際微生物群落的影響提供了新的見解。材料和方法現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和樣品采集實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于中國江蘇省江都市城市郊區(qū)(32°35´ N，119°42´E)，土壤類型為砂姜潮土（中國土壤系統(tǒng)分類）與沙質(zhì)壤土質(zhì)地，總碳量15 g kg1，總氮量1.5 9 g kg1，pH 6.8，并且含有 25.1% 的粘土(<0.001mm)，015厘米深度處的體積密度為 1.2 g cm3?；诘钧溳喿髦贫扔?007年成立了一個(gè)O3- FACE的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，其中水稻在六月中旬移栽，在十月中下旬收獲，冬小麥在1

9、1月初播種，在明年五月底或六月初收獲。這項(xiàng)研究是在2010年的小麥生長季節(jié)(例如，2009年11月至2010年6月)的后三個(gè)生長季節(jié)進(jìn)行的，O3熏蒸在三個(gè)時(shí)期:2007年4月14日到5月22日，2008年3月5日到5月26日和2009年3月1日至24日，他們的平均O3的濃度是環(huán)境臭氧42 ppb，高濃度臭氧53.4 ppb。 該O3-FACE系統(tǒng)有三圈和三個(gè)類似環(huán)境圈。三個(gè)O3-FACE復(fù)制圈，每個(gè)直徑為14.5m，被任意地設(shè)定，在2010年3月3日到5月 31期間，不斷提供60 ppb的高濃度臭氧0900小時(shí)到1800個(gè)小時(shí)，同時(shí)三個(gè)環(huán)境（40 ppb）復(fù)制圈，每個(gè)具有相同的大小，在同一區(qū)域

10、內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)設(shè)置。所有的圈都足夠遠(yuǎn)，以防止臭氧從一個(gè)環(huán)溢出到另一個(gè)，避免來自周圍環(huán)境區(qū)域的o3-face圈的臭氧的影響。在每個(gè)O3-FACE或周圍環(huán)境圈，十一月時(shí)兩個(gè)冬小麥品種（煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16）在每個(gè)次級(jí)圈內(nèi)播種。以往的研究表明，煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16 對(duì)高濃度臭氧有不同的反應(yīng)，煙農(nóng)19（Y19）被稱為臭氧敏感小麥品種，而揚(yáng)麥16（Y16）則是臭氧相對(duì)敏感品種。在2010年6月10日，從6環(huán)內(nèi)的2個(gè)成熟期的栽培品種中，共選取了12個(gè)根和12個(gè)的相應(yīng)體積的樣品。對(duì)于其進(jìn)行GeoChip分析，則是在將植物從土壤中移出并甩動(dòng)后，依附在植物根系的根際土壤被收集，并且每個(gè)樣本組合是來自五個(gè)隨機(jī)選擇的植物的

11、根，然后將其儲(chǔ)存在20 的條件下直到進(jìn)行DNA提取。對(duì)于土壤性質(zhì)分析，從根際土壤被收集的植物的相應(yīng)部位收集土樣（015厘米深，直徑2.5厘米），每個(gè)土壤樣品由五個(gè)土樣混合，并存儲(chǔ)在20 或4 以待進(jìn)一步的分析。植物和土壤特性分析 用TruSpec CN元素分析儀（LECO公司，圣若瑟，密歇根州，美國）測(cè)定植物或土壤的總碳量（TC）和總氮量（TN）。而溶解有機(jī)碳（DOC）是由綜合N / C3100分析儀（耶拿分析儀器股份公司，德國耶拿）測(cè)定。土壤pH值是用玻璃電極測(cè)定1:2.5（土：水）的混合溶液（重量/體積）。將每個(gè)細(xì)班的十五個(gè)冬小麥品種收獲，并劃分為糧食和廢棄物。二者樣本在65干燥直至獲得恒

12、重，然后稱重得到千粒重（千粒重）和個(gè)體植株的重量（植物重量）。核酸提取，純化，擴(kuò)增和標(biāo)記通過冷凍粉碎法提取12個(gè)根際土壤樣本的DNA。提取的DNA被存儲(chǔ)在-80待用。通過ND -1000分光光度計(jì)（Nano-Drop Technologies Inc.，威爾明頓，DE，美國）評(píng)估純化過的DNA的質(zhì)量，DNA的濃度使用數(shù)量PicoGreen試劑盒（Invitrogen，卡爾斯巴德，CA，USA）和遠(yuǎn)艦的FLUOstar（BMG LABTECH，耶拿，德國）來測(cè)定。對(duì)來自每個(gè)樣品的100ngDNA的等分試樣，使用TempliPhi試劑盒（Amersham Biosciences公司，皮斯卡塔韋，新

13、澤西州，美國）在一個(gè)修改過的含有用于提高擴(kuò)增的靈敏度的單鏈結(jié)合蛋白(200 ng l1)和亞精胺 (0.04mM)的緩沖區(qū)，在30以一式三份擴(kuò)增3小時(shí)。擴(kuò)增的DNA（3.0毫克）與20毫升2.5×隨機(jī)引物（Invitrogen）中，加熱至99 并保持5分鐘，然后立即置于冰上，接下來熒光標(biāo)記在含有50 M的dATP，dCTP ，三磷酸， 20 M的dTTP（USB公司，克利夫蘭，OH，USA ），1mM的Cy5標(biāo)記的dUTP（ Pharmacia公司，新澤西州Piscataway，USA）和Klenow片段40U（Invitrogen公司），在37培養(yǎng)3小時(shí)。該標(biāo)簽的產(chǎn)品均用QIAqu

14、ick PCR純化試劑盒（Qiagen ，瓦倫西亞，CA，USA）純化，然后在SpeedVac（賽默飛世爾科技公司，米爾福德， MA，USA）45 溫度條件下干燥45分鐘。基因芯片雜交，掃描和陣列數(shù)據(jù)處理熒光標(biāo)記的DNA懸浮在雜交組合（50甲酰胺，3×SSC，0.3SDS，0.7mgml-1鯡魚精子DNA），和0.86mM DTT在95孵育5分鐘，然后溫度保持在60至雜交。樣品通過GeoChip3.0在MAUI雜交系統(tǒng)（BioMicro系統(tǒng)，鹽湖城，UT，USA）進(jìn)行雜交，保持在4212小時(shí)。用一個(gè)Pro ScanArray微陣列掃描儀（Perkin-Elmer公司，波士頓，MA，U

15、SA）對(duì)微陣列進(jìn)行掃描，用ImaGene6.0（生物發(fā)現(xiàn)，埃爾塞貢多，CA，USA）對(duì)每個(gè)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量?？沼嗪捅憩F(xiàn)差的點(diǎn)在信號(hào)強(qiáng)度被下滑的信號(hào)歸一化之前被移除，信號(hào)噪聲比（SNR=（信號(hào)均值的背景均值）/背景的標(biāo)準(zhǔn)偏差）>2.0的點(diǎn)被用作積極截止點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。如果一個(gè)基因是在至少2個(gè)12個(gè)樣品被檢測(cè)出則被認(rèn)為是積極的。統(tǒng)計(jì)分析所有的數(shù)據(jù)都通過對(duì)裂區(qū)設(shè)計(jì)的一般線性模型分析來確定O3濃度（環(huán)境濃度與高濃度水平）、不同的小麥品種（Y19與Y16）的影響和它們之間的相互作用。如前所述，分別計(jì)算其多樣性指數(shù)。置換多元方差分析（Adonis）是基于歐幾里德距離矩陣，通過排列（999倍）

16、區(qū)分處理間差異的不同，這一有意義的測(cè)試是基于偽-F的比率。曼特爾和部分曼特爾分析被用來關(guān)聯(lián)微生物群落的功能結(jié)構(gòu)和植物及土壤變量。所有的統(tǒng)計(jì)分析采用the Veganpackage in R？。趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA）和典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）使用適于Windows 4.5版本的CANOCO。結(jié)果eO3對(duì)土壤和植物特性的影響為了解eO3是否會(huì)影響土壤和小麥特性，對(duì)5個(gè)土壤變量和10個(gè)植物變量進(jìn)行了測(cè)量（補(bǔ)充表S1）。方差分析結(jié)果表明，在高濃度臭氧條件下，土壤pH值、谷物(TC-grain)和秸稈(TC-straw)的總碳量均顯著（ P<0.05 ）增加，而DOC和千粒重均顯著（ P<0.

17、05 ）降低。此外，DOC和粒重的下降在煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16號(hào)品種之間存在顯著（ P<0.05 ）的差異，其中揚(yáng)麥16號(hào)品種平均減少17.4%，而煙農(nóng)19則平均減少15.4%（圖1）。然而，在高濃度臭氧條件下，微生物生物量碳（MBC），總碳量，總氮量，C / N比（CNR），谷物（TN-grain）和秸稈（TN秸稈）總氮，谷物和秸稈碳氮比（CNR-grain，CNR-straw），穗長，單株重和根-秸稈的重量沒有明顯變化（補(bǔ)充表S1）。此外，沒有觀察到臭氧與品種的相互作用的顯著影響（補(bǔ)充表S1；圖1）。土壤和植物特性的這些變化可能會(huì)影響根際微生物群落功能性成分及結(jié)構(gòu)，本研究將通過GeoCh

18、ip 3對(duì)其進(jìn)一步探討。全面評(píng)價(jià)eO3條件下土壤微生物功能結(jié)構(gòu)GeoChip 3.0在12個(gè)樣本中的至少2個(gè)樣本中，共檢測(cè)到3691個(gè)基因，其中244個(gè)基因來自真菌，131個(gè)來自古菌。所檢測(cè)單個(gè)樣本基因的數(shù)目有1485到2858個(gè)，但在aO3和eO3樣本或兩品種之間沒有觀察到檢測(cè)基因數(shù)量的顯著差異。同樣，香農(nóng)指數(shù)(H´)和辛普森的互惠指數(shù)(1 / D)在aO3和eO3樣本或兩品種之間沒有顯著差異。然而，在環(huán)境臭氧濃度條件下，兩個(gè)栽培種的辛普森均勻度都品種高于在高臭氧濃度條件下的，揚(yáng)麥16品種的這個(gè)指數(shù)也高煙農(nóng)19號(hào)品種(補(bǔ)充表S2)。對(duì)所有檢測(cè)到基因的豐度進(jìn)行阿多尼斯分析的結(jié)果表明，

19、臭氧、作物品種及其組合對(duì)根際微生物群落的整體功能結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響(表1)。此外，所有檢測(cè)到的基因或真菌亞群或細(xì)菌基因的DCA（趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析）表明aO3和eO3條件下樣本或煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16號(hào)樣本可能沒有很好地分隔，雖然eO3樣本似乎比aO3樣本更緊密地聚集在一起(圖2)。此外，只有高臭氧濃度下的煙農(nóng)19號(hào)小麥品種，其真菌與細(xì)菌，細(xì)菌和古細(xì)菌的比值分別地明顯減少和增加，而揚(yáng)麥16號(hào)品種沒有表現(xiàn)顯著的變化（補(bǔ)充圖S1）。因此，這些結(jié)果表明，根際微生物群落的總體功能多樣性和結(jié)構(gòu)似乎沒有被eO3顯著改變。功能結(jié)構(gòu)和環(huán)境變量之間的關(guān)系為了探索根際微生物群落的功能結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素，包括pH值， MBC（微生

20、物生物量碳）， DOC（土壤溶解有機(jī)碳）， TC（總碳量） ， TN （總氮量），CNR（碳氮比）， TC-grain（谷物總碳量）， TN-grain（谷物總氮量），CNR-grain（谷物碳氮比）， TC-straw（莖稈總碳量） ， TN-straw（莖稈總氮量）， CNR-straw（莖稈碳氮比），穗長，千粒重，單株重和莖稈-根重（補(bǔ)充表S1）之間可能存在的聯(lián)系， 我們利用曼特爾或部分曼特爾測(cè)試和CCA（典范對(duì)應(yīng)分析）的方法分析了GeoChip數(shù)據(jù)和那些環(huán)境變量。首先，對(duì)所有的環(huán)境因素的曼特爾分析和所有檢測(cè)到的基因的信號(hào)強(qiáng)度表明，11個(gè)獨(dú)立功能基因（例如， ACEA ， ACEB ，

21、nirK基因， PPK和DSRA ）和那些土壤變量之間的相關(guān)性顯著（ P<0.05 ），但沒有基因與植物變量（表2）的表現(xiàn)出顯著相關(guān)。其次， CCA被用來進(jìn)一步探討哪些環(huán)境因素在很大程度上影響根際微生物群落功能結(jié)構(gòu)的形成。雖然所有檢測(cè)到的功能基因的信號(hào)強(qiáng)度和選擇的環(huán)境變量之間無顯著相關(guān)性，但檢測(cè)到的碳循環(huán)基因被發(fā)現(xiàn)與所選擇的環(huán)境變量，包括土壤pH值，MBC（微生物生物量碳），DOC（土壤溶解有機(jī)碳），CNR（碳氮比），千粒重和臭氧濃度（在小麥生長季節(jié)每塊樣地的平均濃度）（圖3 ）呈顯著（ P<0.05 ）的相關(guān)關(guān)系?；谠撃Ｐ?，總共有60.7的方差可以由前兩個(gè)約束軸進(jìn)行解釋，第一軸

22、線解釋了48.4，第二軸線解釋了12.3。第一典型軸（F = 4.692，P = 0.022 ）和所有規(guī)范軸的總和（F= 2.694，P = 0.010）均由Monte Carlo模擬測(cè)試顯著。碳循環(huán)基因的結(jié)構(gòu)在aO3和eO3 表現(xiàn)出很大不同，其被第一典型軸很好的分開，并與DOC（土壤溶解有機(jī)碳）呈正相關(guān)，與臭氧濃度、pH值、MBC呈負(fù)相關(guān)。第二軸與土壤C / N呈正相關(guān)，與粒重呈負(fù)相關(guān)。第一軸表明，暴露在高臭氧濃度下的兩個(gè)小麥品種的DOC降低，pH值和MBC增加，而且揚(yáng)麥16品種的MBC比煙農(nóng)19品種較高。第二軸表明，和aO3（環(huán)境臭氧濃度）（圖3）相比，在高臭氧濃度下的兩個(gè)品種，千粒重均下

23、降和土壤的C / N上升。結(jié)果表明，參與碳循環(huán)的微生物群落的功能多樣性和結(jié)構(gòu)與土壤和植物特性密切相關(guān)，很大程度上被臭氧濃度、土壤pH值、DOC、 MBC、碳氮比以及粒重所影響。高臭氧濃度下參與碳、氮、硫、磷循環(huán)的功能基因的響應(yīng)雖然高臭氧濃度并沒有對(duì)微生物整體功能結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著效果，但所有檢測(cè)到基因的方差分析結(jié)果表明，在高臭氧濃度下的基因家系水平發(fā)生了顯著的變化。17基因家系的豐度受到eO3（fhs和corC）、品種（limEH，aclB，chrA，copA，nifH，pimF，pobA，dsrA和一氧化碳脫氫酶（CODH），外切葡聚糖酶，脂肪族腈和微效基因）或它們的相互作用（lip，alkH和c

24、hnB）（附表三）的影響顯著（P<0.05）。重點(diǎn)是，的反應(yīng)eO3的一些進(jìn)行了詳細(xì)的說明。下面將側(cè)重參與C，N，P和S循環(huán)的功能基因，詳細(xì)說明微生物群落對(duì)高臭氧濃度和栽培品種響應(yīng)的總體趨勢(shì)。C循環(huán)基因。碳四循環(huán)基因的豐度被eO3（fhs）、品種（CODH和外切葡聚糖酶基因），或eO3和品種（lip）顯著（P<0.05）改變。兩個(gè)品種在aO3條件下的fhs豐度比eO3下的較低（圖4b）；揚(yáng)麥16的CODH和外切葡聚糖酶基因的豐度均高于煙農(nóng)19（圖4A和C）；在eO3條件下，煙農(nóng)19的lip是明顯增加，而揚(yáng)麥16明顯降低（圖4D）。另外，eO3條件下參與C循環(huán)基因的豐度普遍降低，但一些

25、基因的豐度增加，包兩個(gè)品種的mcrA、甘露聚糖酶和木聚糖酶基因，揚(yáng)麥16號(hào)的amyX、nplT 和lip，和煙農(nóng)19 的pcc、 aceA/B、bacterial ara、CODH和酚氧化酶基因（表3）。此外，無論是eO3還是 aO3條件下，與煙農(nóng)19相比，揚(yáng)麥16號(hào)根際微生物群落參與C循環(huán)基因的豐度普遍較高（表3）。結(jié)果表明，煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16號(hào)兩個(gè)品種的參與碳循環(huán)過程的根際微生物群落均可能受到eO3抑制，但揚(yáng)麥16微生物群落的功能基因保持相對(duì)的高豐度，表明揚(yáng)麥16號(hào)（臭氧相對(duì)敏感）的根際微生物群落可能對(duì)eO3的耐受力更強(qiáng)。氮循環(huán)基因。在eO3條件下，揚(yáng)麥16微生物群落的大部分氮循環(huán)的基因豐

26、度普遍下降或保持不變，但煙農(nóng)19的反而增加;然而，揚(yáng)麥16的氮循環(huán)的基因豐度普遍高于煙農(nóng)19 （補(bǔ)充表S4）。例如，nifH是本研究中檢測(cè)出的唯一顯著（ P<0.05）改變的參與氮循環(huán)的基因。與aO3條件下相比，eO3條件下?lián)P麥16和煙農(nóng)19的百分比變化分別是6.1和18.6，而揚(yáng)麥16在eO3和aO3條件下的百分比變化分別超出煙農(nóng)19號(hào)2.9和30.0，說明與煙農(nóng)19相比，揚(yáng)麥16在aO3和eO3兩中條件下有較高的豐度（補(bǔ)充表S4，圖4e）。這些結(jié)果表明，eO3可能會(huì)影響微生物群落的氮循環(huán)過程（例如固氮），而且eO3條件下煙農(nóng)19（臭氧敏感）品種可能比揚(yáng)麥16（臭氧相對(duì)敏感）品種的根際

27、微生物群落更敏感。磷和硫循環(huán)的基因。大多數(shù)磷和硫循環(huán)基因的豐度變化和氮循環(huán)的基因相似，eO3條件下煙農(nóng)19普遍增加而揚(yáng)麥16號(hào)下降。dsrA是被檢測(cè)出的唯一顯著變化的參與硫循環(huán)的基因，而本研究沒有檢測(cè)出在磷循環(huán)中顯著變化的基因。與aO3條件下相比，eO3條件下?lián)P麥16和煙農(nóng)19的dsrA百分比變化分別為6.7%和25.9%，而揚(yáng)麥16在eO3與aO3條件下的變化百分比分別超出煙農(nóng)19號(hào)2.3%和38.0%（補(bǔ)充表S5；圖4F）。同氮循環(huán)基因一樣，這些結(jié)果表明eO3可能通過根際微生物在高臭氧濃度下更敏感的煙農(nóng)19（臭氧敏感），修改磷和硫循環(huán)。gyrB基因。GeoChip3.0還針對(duì)系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記g

28、yrB基因來檢查系統(tǒng)發(fā)育多樣性，組成和微生物群落的結(jié)構(gòu)?？偣灿?95 gyrB基因探針顯示陽性信號(hào)，而檢測(cè)到的基因的數(shù)量或信號(hào)強(qiáng)度在aO3和eO3之間，或者兩個(gè)品種（補(bǔ)充圖S2A）之間并沒有表現(xiàn)出顯著不同，并且所有檢測(cè)到的gyrB基因的DCA沒有顯示出由aO3和eO3，或兩品種（補(bǔ)充圖S2B）引起的明顯的分離。結(jié)果表明，該系統(tǒng)發(fā)育多樣性和根際微生物群落的結(jié)構(gòu)沒有被eO3或小麥品種顯著影響，這與我們對(duì)功能基因的上述分析基本一致。討論了解土壤微生物群落對(duì)eO3的響應(yīng)對(duì)在eO3的環(huán)境中建立可持續(xù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)而言至關(guān)重要。在此研究中，我們檢測(cè)了eO3條件下，煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16兩個(gè)小麥栽培品種的根際微生

29、物群落的功能性成分和結(jié)構(gòu)。我們的研究結(jié)果表明總體的微生物功能多樣性或結(jié)構(gòu)并沒有受到eO3的顯著影響，但參與 C 循環(huán)的功能基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，所參與的 C、 N 和 S 循環(huán)的功能基因被驗(yàn)證發(fā)生了顯著變換。同時(shí)，功能基因的豐度普遍下降，表明 eO3 對(duì)土壤微生物群落有抑制作用。此外，eO3條件下煙農(nóng) 19（臭氧敏感） 品種懷有的根際微生物群落似乎比揚(yáng)麥16品種的更為敏感。 我們的一個(gè)假設(shè)是，eO3通過植物特性和土壤微環(huán)境的變化來顯著影響根際微生物群落的整體功能的多樣性和結(jié)構(gòu)。以往的研究表明，eO3降低植物，尤其是在小麥，地上部分和根系的生物量以及籽粒產(chǎn)量，改變了凋落物和土壤化學(xué)，并且調(diào)整抗氧化

30、能力。然而，只有少數(shù)的研究關(guān)注eO3對(duì)微生物群落功能的影響。例如，對(duì)小麥根際土壤而不是土體觀察是對(duì)唯一碳源利用模式的一個(gè)顯著的歧視，eO3條件下根際微生物的功能多樣性降低。此外，一些在Aspen FACE網(wǎng)站，和通過開放頂式氣室或生物群落的研究表明，eO3改變了土壤中微生物群落的功能的多樣性，結(jié)構(gòu)和/或代謝潛力。在這項(xiàng)研究中，我們的研究結(jié)果并不完全支持eO3會(huì)改變根際微生物群落的整體功能多樣性和結(jié)構(gòu)的假說。這里有幾種可能。首先，aO3（40 ppb的）和eO3（60 ppb）之間的濃度差異沒有大到足以引起整體土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的顯著變化。然而，還應(yīng)當(dāng)注意，盡管O3的增加是比較小的，那些

31、在本研究中鑒定的差異與不久的將來以及目前臭氧濃度相對(duì)較高是高度相關(guān)的。二，eO3暴露時(shí)間可能仍然過短以致于土壤微生物群落不能向eO3回應(yīng)。三，因?yàn)镈OC主要由低pH條件下的低分子量化合物（例如，有機(jī)酸，氨基酸和糖）組成，DOC的降低可能導(dǎo)致pH值的升高，但這兩個(gè)因素的綜合作用可能會(huì)導(dǎo)致觀察不到顯著的變化。四，植物生物量或根生物量在aO3和eO3兩個(gè)條件下，或煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16品種間并沒有顯著變化，表明土壤碳的輸入可能保持不變。此外，在此研究中僅設(shè)置三個(gè)重復(fù)可能會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)功效可能不足以區(qū)分細(xì)微的變化。 雖然對(duì)eO3 的回應(yīng)并沒有顯著改變整體微生物多樣性和結(jié)構(gòu)，我們還是觀察了eO3誘導(dǎo)和由參與 C

32、、 N 和 S 循環(huán)的關(guān)鍵功能基因引起的品種特性的變化。例如，在 eO3條件下fhs基因的豐度明顯減少。由fhs編碼的甲酰合成酶催化還原產(chǎn)酸通路的關(guān)鍵步驟，并從C1的前體產(chǎn)生乙酸（例如，CO 2）。產(chǎn)乙酸對(duì)全球碳循環(huán)具有十分重要的意義，每年在厭氧棲息地生產(chǎn)醋酸的10。乳酸是重要的土壤中的許多微生物的底物，在eO3條件下，fhs豐度的降低表明醋酸產(chǎn)生減少，這可能導(dǎo)致pH值的升高。有趣的是，eO3條件下煙農(nóng)19的fhs基因的豐度顯著減少，而揚(yáng)麥16則顯著增加。由lip基因編碼的木質(zhì)素過氧化物酶使用兩個(gè)基片：1，2-bis(3，4-dimethoxyphenyl) 丙烷-1，3-二醇和過氧化氫，生產(chǎn)

33、 3，4-二甲氧基苯甲醛、 1-(3，4-dimethoxyphenyl) 乙烷-1，2-二醇和過氧化氫，其中，過氧化氫是主要負(fù)責(zé)植物響應(yīng)eO3的適應(yīng)性。在eO3條件下lip基因豐度的顯著增加可能與根際過氧化氫濃度減少和促進(jìn)根際和/或植物中過氧化氫的解毒有關(guān)。此外，更多的基因在aO3或/和eO3條件下展示出因品種特性而發(fā)生變化。例如，揚(yáng)麥16中編碼CODH（一氧化碳脫氫酶）、外切葡聚糖酶、NifH 和 DsrA 的基因豐度顯著高于煙農(nóng)19，雖然這些基因在aO3和eO3條件之間并沒有顯著差異。這些結(jié)果與以前 eO3條件下對(duì)于1，4-b-糖苷酶、1，4-b-N-乙酰和其他 C 降解酶活性的研究基本

34、一致。此外，功能基因豐度的變化表明兩個(gè)清除模式：(i) eO3條件下，大多數(shù)碳循環(huán)基因豐度降低，而揚(yáng)麥 16在aO3和eO3條件下均表現(xiàn)出較普通較高豐度 (ii) 大多數(shù)C、S和P循環(huán)基因在煙農(nóng)19增加，隨揚(yáng)麥16降低，盡管揚(yáng)麥16表現(xiàn)出一般的高豐度。 因此，我們的研究結(jié)果表明一些關(guān)鍵基因的豐度在eO3條件下和/或兩個(gè)品種間發(fā)生顯著變化，其改變可能會(huì)改變生態(tài)系統(tǒng)功能行成的進(jìn)程，有力支持我們對(duì)于eO3會(huì)影響根際微生物群落的組成和代謝潛力的假設(shè)。此外，這項(xiàng)研究鑒定了一些重要的功能基因，這些基因參與還原產(chǎn)酸途徑 (例如，fhs)、 木質(zhì)素降解 (例如，lip) 和 氮固定（例如，nifH）來響應(yīng)eO

35、3的影響；因此，我們今后的研究可能會(huì)通過定量 PCR 和/或高通量測(cè)序方法，側(cè)重研究關(guān)鍵基因的多樣性和量化。 微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)也受到環(huán)境因素的影響，如土壤和植物特性。以往的研究表明，土壤pH值和C投入顯著影響土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)。在這項(xiàng)研究中，觀察到了土壤pH值的增加和DOC的減少。對(duì)所有檢測(cè)基因的Mantel分析還表明，許多參與C，N，P和S循環(huán)的基因的豐度（例如，ACEA，ACEB，PCC，NASA，nirK，PPK和dsrA）與土壤變量顯著相關(guān)。進(jìn)一步的CCA分析表明，參與C循環(huán)的功能基因的結(jié)構(gòu)可能在很大程度上是由土壤pH，DOC，MBC，CNR和粒重決定的。因此，

36、本研究表明，微生物群落結(jié)構(gòu)可能是由土壤環(huán)境因子和植物特性影響形成。 根系分泌物對(duì)植物-微生物相互作用，土壤多樣性、結(jié)構(gòu)和功能的形成，尤其是根際微生物群落的起到重要作用。先前有研究通過PHLD基因分析，表明小麥品種和熒光假單胞菌屬的互動(dòng)程度的特異性。此外，最近的一項(xiàng)研究以擬南芥表明，根系分泌物的差異可能會(huì)影響根際細(xì)菌群落。同樣，另一項(xiàng)包括不同的植物（小麥，玉米，油菜和桶三葉草）的研究表明，植物根系分泌物顯著影響根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。此外，有研究將人工根系分泌物溶液加入到土壤微環(huán)境中，結(jié)果表明，有機(jī)酸可能在塑造土壤細(xì)菌群落形成中起重要作用。然而，目前還不清楚，如果根系分泌物是否參與塑造煙農(nóng)19和揚(yáng)麥16兩個(gè)栽培品種的根際微生物群落，并且需要通過根系分泌物作進(jìn)一步調(diào)查，并將其與微生物的功能結(jié)構(gòu)和活動(dòng)聯(lián)系起來。 煙農(nóng)19的根際微生物群落可能比揚(yáng)麥16的