第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測定

1、第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基第五課蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測定酸序列測定 蛋白質(zhì)和多肽是由蛋白質(zhì)和多肽是由20種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長種氨基酸按照一定的順序通過肽鍵連接成一長鏈，然后通過鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進行折疊、鏈，然后通過鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進行折疊、卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及功能。因此，測定蛋白質(zhì)的氨基酸一級結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)及功能。因此，測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列是進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部

2、分。另外，蛋白質(zhì)一級序列是進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部分。另外，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息也有助于對其基因結(jié)構(gòu)的研究。結(jié)構(gòu)的信息也有助于對其基因結(jié)構(gòu)的研究。 目前，進行蛋白質(zhì)序列測定有兩個關(guān)鍵步驟，即：目前，進行蛋白質(zhì)序列測定有兩個關(guān)鍵步驟，即：氨基酸殘基一個一個依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來；氨基酸殘基一個一個依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來；正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。正確鑒定每次切割下來的氨基酸殘基。 其中第一步可采用化學(xué)法或酶法進行裂解。由于化學(xué)法較之酶法具有其中第一步可采用化學(xué)法或酶法進行裂解。由于化學(xué)法較之酶法具有裂解率高、易于自動化、耗費少等諸多優(yōu)點，被蛋白質(zhì)化學(xué)實驗室

3、普遍裂解率高、易于自動化、耗費少等諸多優(yōu)點，被蛋白質(zhì)化學(xué)實驗室普遍采用，可以從蛋白質(zhì)和多肽的采用，可以從蛋白質(zhì)和多肽的N端進行裂解，也可以從端進行裂解，也可以從C端進行分析。端進行分析。 第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個生色基團，通過高效液相色第二步通常是在氨基酸殘基上衍生了一個生色基團，通過高效液相色譜進行分離分析。譜進行分離分析。 本章將就蛋白質(zhì)和多肽的本章將就蛋白質(zhì)和多肽的N端、端、C端氨基酸序列分析端氨基酸序列分析的原理和方法、進行序列分析前蛋白質(zhì)和多肽樣品的準備作一介紹。的原理和方法、進行序列分析前蛋白質(zhì)和多肽樣品的準備作一介紹。第一節(jié)第一節(jié) N端分析原理端分析原理一、耦一、耦

4、聯(lián)聯(lián) 蛋白質(zhì)和多肽的自由蛋白質(zhì)和多肽的自由氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試試劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容劑耦聯(lián)后，與其緊鄰的第二個殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。易斷裂。二、裂二、裂 解解 在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個殘基。緊挨的在無水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個殘基。緊挨的第二個氨基酸殘基暴露出自由的第二個氨基酸殘基暴露出自由的氨基，又可與氨基，又可與PITC進行進行耦聯(lián)反應(yīng)。耦聯(lián)反應(yīng)。三、轉(zhuǎn)三、轉(zhuǎn) 化化 ATZ氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液(25)中可轉(zhuǎn)化中可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的成穩(wěn)定的PTH氨基酸。氨基酸

5、。第二節(jié)第二節(jié) N端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀三、氣相序列儀三、氣相序列儀 自動化蛋白質(zhì)序列儀剛問世時，需要樣品量為自動化蛋白質(zhì)序列儀剛問世時，需要樣品量為12mg。1978年年Tarr等將一種四級銨鹽聚合物等將一種四級銨鹽聚合物“polybrene”引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測引入了蛋白質(zhì)、多肽的序列測定，它能和肽鏈中的極性基團作用定，它能和肽鏈中的極性基團作用(非共價鍵合非共價鍵合)而將蛋白質(zhì)和多肽有效而將蛋白質(zhì)和多肽有效地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時樣品的損失。為了適應(yīng)分子地固定在玻璃纖維支持膜上，防止了萃取時樣品的損失。為了適應(yīng)分子生物學(xué)對蛋白質(zhì)微量分析的要求，生物學(xué)對蛋白質(zhì)微量

6、分析的要求，20世紀世紀80年代初，年代初，Hewick及及Hunkpillar等人改進了自動化蛋白質(zhì)序列儀中的儀器結(jié)構(gòu)，它用彈筒型等人改進了自動化蛋白質(zhì)序列儀中的儀器結(jié)構(gòu)，它用彈筒型玻璃反應(yīng)室玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約內(nèi)部體積約0.05m1)代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用polybrene固定樣品，固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以氣體方式輸送，其他試劑以流動或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列輸送，其他試劑以流動或液相脈沖方式輸送。此儀器較之以前幾種序列儀具有以下明顯優(yōu)點：儀具有以下明顯優(yōu)點：靈敏度高

7、，耗費樣品量少，通常僅需靈敏度高，耗費樣品量少，通常僅需50100pmol；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的l10，降低了費用；，降低了費用；縮短了每步降解循環(huán)時間，提高了分析效率?？s短了每步降解循環(huán)時間，提高了分析效率。 20世紀世紀80年代末又對氣相序列儀進行了部分改進，即將原來三氟乙酸年代末又對氣相序列儀進行了部分改進，即將原來三氟乙酸以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應(yīng)不同以氣體方式輸送改為液相脈沖方式，稱為脈沖液相序列儀，以適應(yīng)不同樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團的功能性樣品的分析需要。另外，由于載有活性基團的功能性

8、PVDF膜的問世，膜的問世，蛋白質(zhì)和多肽可以共價固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進行蛋白質(zhì)和多肽可以共價固定在此類膜上，直接在上述兩種序列儀上進行固相序列分析。固相序列分析。 在這兩種序列儀中，在這兩種序列儀中，Edman降解后的降解后的PTH氨基酸衍生物可及時直接氨基酸衍生物可及時直接從轉(zhuǎn)化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行從轉(zhuǎn)化腔中自動輸入高效液相色譜儀中進行PTH氨基酸衍生物的定性及氨基酸衍生物的定性及定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統(tǒng)一定量分析，這樣不僅快速可靠，而且防止了樣品的損失。這兩臺儀器統(tǒng)一用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動記錄和處

9、理。圖用電腦控制，包括化學(xué)反應(yīng)和分析鑒定以及數(shù)據(jù)的自動記錄和處理。圖4.2為標準為標準PTH氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在氨基酸的色譜分離圖。由圖可見，欲在20min內(nèi)將各組分內(nèi)將各組分較好分離，需選擇合適的色譜條件，表較好分離，需選擇合適的色譜條件，表4.1列出了各種條件的改變導(dǎo)致個列出了各種條件的改變導(dǎo)致個別組分位置的遷移及圖譜的改善。別組分位置的遷移及圖譜的改善。第三節(jié)第三節(jié) 影響影響N端端Edman反應(yīng)裂解率的因素反應(yīng)裂解率的因素 在測序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使在測序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)端很均一的蛋白質(zhì)(第一個循環(huán)出現(xiàn)單第一個循環(huán)出現(xiàn)單個氨基酸殘基個氨基酸殘基)，經(jīng)過

10、十幾個循環(huán)后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是，經(jīng)過十幾個循環(huán)后背景明顯不及第一個殘基清晰。這是由于由于Edman反應(yīng)是一個化學(xué)過程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可反應(yīng)是一個化學(xué)過程，在其耦聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。目前最佳產(chǎn)率為9598。因此，經(jīng)過。因此，經(jīng)過50次循環(huán)后，次循環(huán)后，PTH氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰，氨基酸分析譜中將出現(xiàn)較多雜峰，影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質(zhì)最多能分析至影響正確辨認，也就是說對于一般蛋白質(zhì)最多能分析至N端第端第50個氨基個氨基酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)

11、降解成一系列肽段分析后再拼接。酸左右，欲知全順序，則需將蛋白質(zhì)降解成一系列肽段分析后再拼接。對于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對對于有些蛋白質(zhì)由于含有較多的對Edman反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂反應(yīng)敏感的殘基或肽鍵，裂解效率將更低。解效率將更低。循環(huán)至循環(huán)至Ser和和Thr時產(chǎn)率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基時產(chǎn)率突然降低，這是因為在進行這兩個氨基酸殘基分析前一個循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與分析前一個循環(huán)中，三氟乙酸除起裂解作用外，可能與Ser和和Thr上的羥上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和和Thr的的N端端氨基。氨基。另外，絲氨酸和蘇氨酸的另外，絲氨酸和蘇氨

12、酸的PTI-汀生物也會部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造汀生物也會部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。成產(chǎn)率的降低。 耦聯(lián)試劑耦聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些本身也將發(fā)生下列副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)雜質(zhì)”。測序完。測序完成成后，電腦將每個循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率后，電腦將每個循環(huán)的產(chǎn)率處理，得出起始產(chǎn)率(initial yield)和重復(fù)產(chǎn)和重復(fù)產(chǎn)率率 (repetitive yield)，其中通過起始產(chǎn)率可以估計蛋白質(zhì)的真實含量，其中通過起始產(chǎn)率可以估計蛋白質(zhì)的真實含量，有時可以推測有時可以推測N端是否封閉端是否封閉(和氨基酸組成分析測得的含量相差甚遠和氨基酸組成分析測得的含量相差甚遠

13、)，而，而重復(fù)產(chǎn)率則表明機器是否正常運轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有重復(fù)產(chǎn)率則表明機器是否正常運轉(zhuǎn)。另外，如果蛋白質(zhì)或多肽中含有過多的過多的Ser、Thr、Glu、Trp等氨基酸殘基，也將降低這兩個數(shù)值。等氨基酸殘基，也將降低這兩個數(shù)值。第六節(jié)第六節(jié) C端序列分析端序列分析 雖然建立在雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動化化學(xué)法上的自動化N端測序技術(shù)日趨成熟，但仍端測序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問題需借助有不少問題需借助C端序列分析來解決。端序列分析來解決。C端測序尤其適合于基因重組蛋端測序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時的質(zhì)量控制、白是否正確表達的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時的質(zhì)量

14、控制、N端封閉蛋白的分端封閉蛋白的分析以及析以及DNA探針的設(shè)計。探針的設(shè)計。 由于選擇性對由于選擇性對C端羧基進行耦聯(lián)修飾并從端羧基進行耦聯(lián)修飾并從C端逐一將氨基酸殘基切下端逐一將氨基酸殘基切下較較N端測序困難，在過去的近端測序困難，在過去的近20年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致年里，雖然為數(shù)不少的蛋白質(zhì)化學(xué)家致力于力于C端測序研究，但目前仍不能和端測序研究，但目前仍不能和N端測序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué)端測序技術(shù)程度媲美。蛋白質(zhì)化學(xué)工作者曾利用羧肽酶分析工作者曾利用羧肽酶分析C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對個端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對個別氨基酸殘基有選擇性，使用時仍有一定

15、困難。別氨基酸殘基有選擇性，使用時仍有一定困難。 最近，由于對化學(xué)法測定最近，由于對化學(xué)法測定C端技術(shù)進行了一系列改進，已有了自動化端技術(shù)進行了一系列改進，已有了自動化C端序列儀問世。所以介紹一種自動化端序列儀問世。所以介紹一種自動化C端測序方法的原理及應(yīng)用。端測序方法的原理及應(yīng)用。一、一、C端分析原理端分析原理 基于與基于與N端端Edman降解類似的原理，降解類似的原理，C端分析采用化學(xué)試端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的劑與蛋白質(zhì)和多肽的羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C端衍生物被端衍生物被切割下來，通過切割下來，通過HPLC系統(tǒng)進行分離分析。系統(tǒng)進行分離分析。一個完整的一個完整的C端

16、序列分析包括以下幾個步驟：端序列分析包括以下幾個步驟： (1)活化活化 蛋白質(zhì)和多肽蛋白質(zhì)和多肽C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進一步端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進一步環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。C端的嗯唑端的嗯唑酮在硫氰四丁銨的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲酮在硫氰四丁銨的作用下，轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰硫脲(thiohydantoin，TH)。(2)酰胺化保護側(cè)鏈羧基酰胺化保護側(cè)鏈羧基 側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進一步作用形成酰側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進一步作用形成酰胺，以保護側(cè)鏈。胺，以保護

17、側(cè)鏈。(3)烷基化烷基化 由于由于C端環(huán)化形成的端環(huán)化形成的TH衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因衍生物較為穩(wěn)定而不易被切割，因此產(chǎn)率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成此產(chǎn)率不高。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成Alkylated-TH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。(4)修飾修飾Thr和和Ser的羥基的羥基 蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會干擾測序，因此需要修飾。在活蛋白質(zhì)和多肽中的羥基會干擾測序，因此需要修飾。在活化過程中，乙酸酐也會與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完化過程中，乙酸酐也會與羥基反應(yīng)將其乙?；磻?yīng)不完全，在全，在N甲基咪唑甲基咪唑(N

18、Ml)和乙酸酐的共同作用下，和乙酸酐的共同作用下，Thr和和Ser上的羥基基本被乙?；Ｉ系牧u基基本被乙?；?5)裂解和衍生裂解和衍生 C端的端的ATH衍生物在酸性條件下與衍生物在酸性條件下與NCS反應(yīng)而被反應(yīng)而被裂解生成裂解生成ATH氨基酸，新的氨基酸，新的C端自動形成端自動形成TH，而不必重新，而不必重新活化?；罨?。 因此，整個測序過程只需在開始時對因此，整個測序過程只需在開始時對C端進行一次性活端進行一次性活化，并修飾化，并修飾Asp和和Glu側(cè)鏈羧基以及側(cè)鏈羧基以及The和和Ser的羥基。實的羥基。實際上，循環(huán)反應(yīng)的只有烷基化和裂解兩步，其全過程圖解如際上，循環(huán)反應(yīng)的只有烷基化和裂解

19、兩步，其全過程圖解如下圖。下圖。二、二、C端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀 近年來，已有商品化的近年來，已有商品化的C端序列儀問世。端序列儀問世。C端序列儀一般端序列儀一般由由N端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不端序列儀改裝而成，其基本結(jié)構(gòu)與后者相似，兩者的不同之處主要在于：同之處主要在于： 反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵反應(yīng)所用的試劑不同，因此兩者不可兼容，否則極易堵塞管道；塞管道； 在在C端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中端序列儀中，所有的化學(xué)反應(yīng)均在彈筒型反應(yīng)室中進行，切割下來的進行，切割下來的ATHAA僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶解后即僅在轉(zhuǎn)化腔內(nèi)干燥和溶

20、解后即進入進入HPLC系統(tǒng)分離分析；而在系統(tǒng)分離分析；而在N端測序儀中，端測序儀中，ATZ AA需需在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為在轉(zhuǎn)化腔中轉(zhuǎn)化為PTH-AA。四、影響四、影響C端測序反應(yīng)產(chǎn)率的因素端測序反應(yīng)產(chǎn)率的因素 C端測序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為端測序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為20，而對于，而對于Glu，Asp，Ser，Thr等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。如等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。如C端富含上述幾種氨基酸，測序端富含上述幾種氨基酸，測序?qū)⑹掷щy。另外，一旦遇到將十分困難。另外，一旦遇到Pro，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐反應(yīng)成環(huán)，整個測序過程將終止。反應(yīng)成環(huán)，整個測

21、序過程將終止。 到目前為止，到目前為止，C端測序可測端測序可測110個殘基，一次測序需要的量比個殘基，一次測序需要的量比N端測端測序要大得多，至少需序要大得多，至少需1nmol。 此外，因為不同的氨基酸反應(yīng)產(chǎn)率不同，所以，對圖譜的分析也比此外，因為不同的氨基酸反應(yīng)產(chǎn)率不同，所以，對圖譜的分析也比N端測序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗。目前端測序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗。目前C端測序結(jié)果最好的一個樣品是馬端測序結(jié)果最好的一個樣品是馬肌紅蛋白原，可測肌紅蛋白原，可測C端端10個以上殘基，通常將其作為標準樣品來判斷儀個以上殘基，通常將其作為標準樣品來判斷儀器的穩(wěn)定性。器的穩(wěn)定性。 另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一種另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一