啤酒發(fā)酵工藝流程

1、實驗一 單細胞蛋白（SCP）的生產(chǎn)一、實驗?zāi)康? 了解單細胞蛋白的開發(fā)優(yōu)勢及技術(shù)現(xiàn)狀。2 掌握單細胞蛋白的液體深層培養(yǎng)法及工藝控制規(guī)律。3 了解發(fā)酵過程中菌體濃度及生物量的一般檢測方法。二、實驗原理所謂SCP（Single Cell Protein）就是指那些工廠化大規(guī)模培養(yǎng)、作為人類食品和動物飼料的蛋白質(zhì)來源的酵母、細菌、放線菌、霉菌、藻類和高等真菌等微生物的干細胞。SCP工業(yè)，主要是飼料酵母工業(yè)。酵母是一種單細胞微生物，生長繁殖快，菌體營養(yǎng)豐富。飼料酵母是一種營養(yǎng)價值很高的蛋白飼料，成品呈微黃色粉末狀，具有酵母特殊香味。酵母蛋白質(zhì)含量一般都在70%左右，比大豆高1倍。與肉蛋白、雞蛋蛋白、大

2、豆蛋白相比，單細胞蛋白所含的氨基酸組分齊全，有18-20種氨基酸，尤其是谷物中所缺乏賴氨酸含量較高。此外，維生素含量也十分豐富。每千克酵母類單細胞可使奶牛的產(chǎn)奶量增加6-7，用含有10%單細胞蛋白飼料養(yǎng)雞，產(chǎn)蛋提高21%-35%。1噸單細胞蛋白可節(jié)約5-7噸飼料糧，可產(chǎn)1.5噸雞肉或3萬枚雞蛋。我國單細胞蛋白（酵母）年產(chǎn)量近3萬噸，多用于醫(yī)藥、面包生產(chǎn)和飼料。用于生產(chǎn)飼料酵母的原料來源廣泛，有礦物資源（如石油、甲烷、泥炭等）、纖維資源（如秸桿、木屑等）、糖類資源（如糖蜜、紅薯等）、石油二次制品、廢棄資源（包括有機廢水、廢渣、動物糞便等）。從我國目前的情況出發(fā)，生產(chǎn)飼料酵母等單細胞蛋白值得優(yōu)先開

3、發(fā)的原料有廢糖蜜、薯干、紙漿廢液，豆制品廠、味精廠、淀粉加工廠的廢液等，用這些原料生產(chǎn)飼料酵母，首先是產(chǎn)品無毒性，另外也有利于解決工廠和城市的污染問題。酵母細胞的發(fā)酵特點：目前，最廣泛用于生產(chǎn)作為蛋白資源的酵母是假絲酵母，該酵母生長繁殖速度快，每2-4小時可繁殖一代，培養(yǎng)10小時左右就能繁殖到種子菌體量的15倍。發(fā)酵過程中，要保證罐內(nèi)的液體混合良好和較適當?shù)靥峁┭鯕?，還要控制好溫度和pH。采用流加間歇發(fā)酵可以保證糖被具有良好活性的酵母呼吸消耗，以達到最適產(chǎn)量。底物濃度過高，即使在有氧條件下，酵母也會發(fā)酵產(chǎn)生碳水化合物。如果酵母生長速率過快，底物也會發(fā)酵。因此，在培養(yǎng)過程中，底物濃度應(yīng)維持在一定

4、較低的水平，并維持一定的通風量。酵母生物量的檢測方法及分離：最普遍的檢測方法是細胞干重法、顯微鏡記數(shù)法和光密度法。菌體的分離常采用過濾法和離心分離法。三、實驗儀器與材料（一）儀器10L發(fā)酵罐、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、顯微鏡、大容量冷凍離心機、高壓滅（二）材料菌種：熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）, 由中國科學院微生物研究所提供。葡萄糖、蛋白胨、飴糖、牛肉膏、NaCl。（三）培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基：酵母膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂1.5%，pH6.0。搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖3.0%，蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，牛肉膏0.3%，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：飴糖2.0

5、%，葡萄糖3.0%，蛋白胨1%，酵母浸汁1.0%，K2HPO3 0.3%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH自然。四、實驗步驟（一）斜面種子的制備于超凈工作臺面上，在火焰保護下，用無菌接種棒挑取酵母菌少許，于斜面培養(yǎng)基內(nèi)，先劃中線，后從下而上往兩邊劃線均勻地鋪開，塞好棉塞。扎好后，放25-30ºC恒溫箱中培養(yǎng)（斜面朝下放），培養(yǎng)4-6天。（二）搖瓶種子的置備刮下斜面酵母少量，接種于搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)，置搖床上，于28ºC恒溫搖床240rpm培養(yǎng)24h。 （三）發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)在10L發(fā)酵罐中裝入配好的發(fā)酵培養(yǎng)基（配料體積6L，消后體積6L），用飽和蒸汽對發(fā)酵罐進行實罐消毒，冷

6、卻后接入搖瓶種子（接種量5%），在控制條件下進行發(fā)酵。（四）罐上各傳感器的標定及滅菌操作（五）發(fā)酵罐工藝控制要點1 發(fā)酵全程罐溫控制在28±1ºC，中后期溫度可以適當降低些；2 周期為72-96h，罐壓保持在0.03-0.04Mpa，攪拌速度控制在200rpm；3 空氣流量控制在1.5VVM（VVM，即單位時間內(nèi)（min）通過單位體積（m3）發(fā)酵液的空氣體積（m3）左右；4 補料控制:發(fā)酵過程中可根據(jù)殘?zhí)橇窟m當補入含飴糖及葡萄糖的料液1-2次；（六）中間控制操作要求1 048h：每隔6h取樣，測細胞數(shù)（采用血球記數(shù)板記數(shù)）、pH、總糖、氨基氮，并作好記錄。涂片鏡檢，觀察菌體

7、形態(tài)，并作好記錄。觀察發(fā)酵液外觀、粘稠度、氣味等，并作好記錄；2 48h放罐：每隔12h取樣，觀察發(fā)酵液外觀、顏色、粘稠度，測pH、總糖、氨基氮、生物量（1500rpm,10min，收集菌體，干燥，稱重），并作好記錄；3 取樣的操作要求同實驗22；4 每0.5h觀察并記錄一次：罐溫、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速。（七）發(fā)酵液的處理放罐后發(fā)酵液采用離心分離法收集菌體，離心機的分離因數(shù)為3000g（n=，n為每分鐘轉(zhuǎn)速，r為旋轉(zhuǎn)軸到離心管中心距離），離心10分鐘。將濕菌體放入已知重量的平皿或燒杯內(nèi)，于105ºC烘干至恒重，取出放入干燥器內(nèi)冷卻，再稱重，即得菌體干重。由于干燥后細胞具有吸濕性，可用自動天

8、平迅速稱量。五、實驗結(jié)果及分析（一）測定方法1. 總糖和還原糖含量測定：蒽酮比色法2. 氨基氮含量測定：甲醛氧化法3. 發(fā)酵液中細胞量測定采用血球記數(shù)板記數(shù)4. 生物量的統(tǒng)計采用細胞干重稱量法（二）分析觀察酵母細胞在整個發(fā)酵過程中，細胞增長規(guī)律及菌體形態(tài)變化情況。六、注意事項提前一周左右接斜面，斜面培養(yǎng)成熟后置冰箱保藏備用（4°C冰箱中保存）；提前一周左右，采購實驗用相關(guān)材料，配制中間體檢測用化學試劑。本實驗預(yù)計學時數(shù)20學時。實驗二 工程菌發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸一、實驗?zāi)康?了解以細菌（大腸桿菌）為產(chǎn)生菌，獲得初級代謝產(chǎn)物為目的的液體深層發(fā)酵方法。2學習細菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸過程中的菌體生長的

9、規(guī)律以及發(fā)酵產(chǎn)酸的規(guī)律。3了解發(fā)酵液中色氨酸含量的檢測方法。二、實驗原理L色氨酸化學名稱為L-氨基吲哚基丙酸，分子式：C11H12N2O2，分子量：204.23，它是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。色氨酸的化學結(jié)構(gòu)式L-色氨酸是人體和動物生命活動中八種必需氨基酸之一，對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面。L-色氨酸的生產(chǎn)最早主要是依靠化學合成法和蛋白質(zhì)水解法制造。隨著色氨酸市場的開拓，微生物法生產(chǎn)色氨酸的方法現(xiàn)已走向?qū)嵱貌⑶姨幱谥鲗У匚弧Ｎ⑸锓ù篌w上可以分為直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法。直接發(fā)酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為

10、碳源，利用優(yōu)良的色氨酸產(chǎn)生菌來生產(chǎn)色氨酸。由于色氨酸合成的多重反饋抑制機制及弱化子調(diào)節(jié)機制，加上整個芳香族氨基酸代謝流在生物體內(nèi)本來就較弱，使得該法在相當長的一段時間內(nèi)達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。隨著重組DNA技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用，為優(yōu)良的色氨酸生產(chǎn)菌株的篩選和產(chǎn)酸水平的提高提供了可靠的技術(shù)保障，使微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)色氨酸成為一種廉價的工業(yè)化生產(chǎn)方法。微生物轉(zhuǎn)化法是使用葡萄糖作為碳源，同時添加合成色氨酸所需的前體物（如鄰氨基苯甲酸、吲哚、L-絲氨酸等），利用微生物的色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化前體來合成色氨酸。酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生產(chǎn)色氨酸。這些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、

11、絲氨酸消旋酶等。酶法一般由酶源菌體的培養(yǎng)、菌體的分離洗滌、固定化和催化反應(yīng)等幾個階段組成。酶法能夠利用化工合成的前體物為原料，既充分發(fā)揮了有機合成技術(shù)的優(yōu)勢，又具有產(chǎn)物濃度高、收率高、純度高、副產(chǎn)物少、精制操作容易的優(yōu)點，是一種成本較低的工業(yè)化生產(chǎn)色氨酸的方法。氨基酸的直接發(fā)酵生產(chǎn)多以細菌發(fā)酵為主，本實驗選用谷氨酸棒桿菌來發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸。三、實驗儀器與材料（一）儀器 10L發(fā)酵罐、恒溫搖床、超凈工作臺、顯微鏡、數(shù)字可調(diào)移液器、高壓滅菌鍋、721分光光度計、電爐、恒溫培養(yǎng)箱、堿式滴定管、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、試管（18×180mm）。 （二）材料 大腸桿菌(Escheric

12、hia coli) 實驗室提供。 蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、酵母膏、玉米漿、硫酸銨、硫酸鎂、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、生物素、硫胺素。（三）試劑1、菌種保藏斜面培養(yǎng)基： 0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 瓊脂，pH 7.02、平板活化培養(yǎng)基：0.3%NaCl，0.5% 酵母膏，0.7%牛肉膏，1% 蛋白胨，2% 瓊脂，1%葡萄糖，pH 7.03、種子培養(yǎng)基（g/L)：每升含葡萄糖 20g，酵母浸出粉5.0，KH2PO4 11.5g，MgSO4.7H2O 3.0g，(NH4)2SO4 6.0g， 硫酸亞鐵66mg， 檸檬酸三鈉二水物3.0，pH 7.0-

13、7.2，115，15min4、發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)：每升含葡萄糖 20g，酵母浸出粉1.0，硫酸銨4.0，檸檬酸三鈉二水物2.0，硫酸鎂3.0,磷酸二氫鉀2.0，硫酸亞鐵100mg，pH7.0-7.2,115,115min5、0.2% 蒽酮試劑 準確稱取0.2g 蒽酮溶于100 mL濃硫酸中，并于棕色瓶冷暗處保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。6、0.5% 亞硝酸鈉溶液準確稱取0.5 g亞硝酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100 mL，新鮮配制。7、50% 硫酸儲備液將500 mL濃硫酸小心的加入到500 mL蒸餾水中，邊加邊攪拌，最終定容至1000 mL，配成9 mol/L的硫酸儲備液。8、3.0 g/L對二甲氨基苯甲

14、醛儲備液準確稱取1.5 g對二甲胺基苯甲醛溶于500 mL 50%的硫酸溶液中，移至500 mL容量瓶中，以50%的硫酸溶液定容至刻度。四、實驗步驟（一）種子培養(yǎng)方法1、種子活化培養(yǎng)：于超凈工作臺面上，在火焰保護下，將斜面保藏的菌種接到活化斜面上置35 培養(yǎng)箱中（斜面朝下放）培養(yǎng)1-2天 (LB固體培養(yǎng)基）。2、搖瓶種子培養(yǎng)：從生長良好的活化斜面接一環(huán)菌苔至裝有20 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置回轉(zhuǎn)式搖床上，于240 r/min，35振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期。（二）發(fā)酵培養(yǎng)工藝：10L發(fā)酵罐基礎(chǔ)料配料體積5L，消后體積5L，接種量200mL。培養(yǎng)12h以后補加2L發(fā)酵液（已滅菌），

15、初始通氣量4 L/min;攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min;培養(yǎng)溫度35.5；以泡敵消泡；發(fā)酵過程中，通過自動流加氨水控制pH為7.0；當溶氧降至50%以下時，增加通氣量到8 L/min；同時攪拌轉(zhuǎn)速提升至250300 r/min；當培養(yǎng)液中葡萄糖濃度下降 1%時，把80%（1600g葡萄糖+蒸餾水定容至2L）的葡萄糖溶液以一定的流加速度加至培養(yǎng)液中，以維持發(fā)酵時葡萄糖濃度在1%-2%之內(nèi)。（三）pH電極的標定1. 準備小燒杯兩只，大燒杯一只，洗瓶一個(內(nèi)裝蒸餾水)，pH標準緩沖溶液：pH6.86，4.00或9.18，吸水紙若干；2. 接通設(shè)備電源，預(yù)熱5分鐘以上；3. 標定：pH標定兩個點，先確定

16、發(fā)酵過程中pH值是7還是7，若7，則用pH6.86和pH9.18的標準溶液來標定電極；若7，則用pH6.86和pH4.003標準溶液來標定電極；4. 標定一次，可連續(xù)使用2-3次，若停用時間較長，則使用前必須標定。（四）DO電極的標定接通設(shè)備電源，預(yù)熱5分鐘以上。取適量的無水亞硫酸鈉，放入三角燒瓶內(nèi)，并放入適當200mL左右的自來水，搖動幾下，保證為飽和溶液狀態(tài)。將DO電極放入燒瓶內(nèi)，稍后可見DO值下降，待5-10分鐘后，將其值設(shè)為0。將電極取出，放入發(fā)酵罐內(nèi)，在接種之前，發(fā)酵罐在大量充氣后進行攪拌，在操作溫度下，將DO值設(shè)為100%。（五）發(fā)酵罐滅菌操作1. 滅菌前的準備工作：主要包括，罐體

17、清洗，校正pH電極，標定DO電極的零點。嚴密度檢查（試壓），將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中，蓋好罐蓋。將電極分別插入罐蓋上對應(yīng)的孔中，并旋緊壓蓋。將控制pH用的酸堿液、消泡劑及其它物料分別放入鹽水瓶中（裝料總量不得大于總?cè)莘e的80），并連接好補液管和微孔過濾器。關(guān)閉所有管路閥門，在觸摸屏上開啟滅菌模式，開啟蒸汽發(fā)生器，壓力升至0.3 MPa。滅菌過程應(yīng)采用飽和蒸汽（總蒸汽壓力不低于0.3MPa0.35MPa，使用壓力不低于0.2MPa）；2. 滅菌開始：先用蒸汽沖洗各管路，打開排氣閥門，打開罐體夾套蒸汽管路相關(guān)閥門，將蒸汽引入夾套預(yù)熱，當罐內(nèi)溫度升至100時，關(guān)小排氣，開啟直接進罐蒸汽；3. 罐內(nèi)進汽：

18、關(guān)閉夾套進蒸汽閥門，打開直接進罐蒸汽閥門，蒸汽進罐內(nèi)，使罐內(nèi)升溫至121，打開經(jīng)蒸汽過濾器的空氣管路蒸汽閥門，對空氣過濾器進行滅菌，調(diào)整直接進罐蒸汽閥門、空氣管路蒸汽閥門以及排氣閥，使罐內(nèi)保持0.12MPa， 121滅菌30分鐘（該過程應(yīng)注意觀察液體的翻動情況，進、排氣情況，如是否通暢、排氣是否過大）；4. 滅菌結(jié)束：關(guān)閉所有蒸汽閥門，在罐壓下降的同時，關(guān)閉過濾器吹干排氣閥，緩緩開啟空氣入罐閥通入無菌空氣，引入無菌空氣保壓（只有在罐內(nèi)壓力小于過濾器空氣壓力時才可開啟空氣進罐閥門，防止料液倒壓至過濾器），罐壓維持在0.03-0.05MPa；5. 發(fā)酵開始：打開自來水閥門，進入快速降溫模式，降至發(fā)

19、酵所需設(shè)定溫度，退出快速降溫模式，在觸摸屏開啟發(fā)酵模式，進入保溫運行；6. 接種發(fā)酵：采用火焰法接種后，根據(jù)工藝要求，調(diào)整進排氣閥門，空氣流量，保持罐壓至發(fā)酵結(jié)束。（六）中間操作要求1. 種子：移種前需鏡檢（觀察菌的形態(tài)，有無雜菌）；2. 發(fā)酵過程中，每8小時取樣，做以下分析測定工作：鏡檢（觀察菌的形態(tài)、有無雜菌），測培養(yǎng)液pH，測培養(yǎng)液總糖及氨基氮，測生物量和色氨酸含量，并做好記錄；3. 每0.5小時觀察并做一次記錄：罐溫，罐壓，攪拌速度，p，溶氧。4. 取樣的操作要求：取樣管一般安裝在罐的側(cè)部或頂部，取樣頻率可根據(jù)實驗要求及培養(yǎng)物的體積而定。一般總?cè)恿坎粦?yīng)超過發(fā)酵液體積的10%，否則諸如

20、氧傳遞速率等會受影響。1) 取樣前對其取樣管道進行消毒。適當打開取樣管冷凝水閥，全開取樣管蒸汽閥，微開冷凝水閥，保持一定的活蒸汽消毒（每次取樣前或取樣后，至少需要蒸汽滅菌5min）；2) 取樣操作，關(guān)閉取樣管冷凝水閥，關(guān)閉取樣管蒸汽閥，適當開大取樣管冷凝水閥，打開取樣閥，使培養(yǎng)基緩緩流出；3) 取樣結(jié)束后關(guān)閉取樣閥，關(guān)閉取樣管冷凝閥，開大取樣管蒸汽閥，微開取樣管冷凝水閥，保持一定活蒸汽滅菌。5. 色氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵過程中生物量的測定方法將每隔8h取的發(fā)酵液稀釋50倍，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基做空白，用分光光度計在620nm，1cm光程下測量OD值。以時間為橫坐標，OD為縱坐標繪制菌體生長曲線。標準曲

21、線的繪制，取約100mL的培養(yǎng)細胞懸濁液，約20mL用于測定濁度，其余用于測干重求出細胞濃度。原液的吸光度在0.3以下時應(yīng)離心分離，將細胞濃縮。用緩沖液或原液離心后的上清液等稀釋至原液，原液×0.8，原液×0.6，原液×0.2，原液×0.1。由OD及細胞濃度的測定結(jié)果繪制標準曲線。吸光度在0.050.3的范圍內(nèi)，吸光度與細胞濃度呈線性關(guān)系。6 發(fā)酵液中色氨酸含量的測定方法取發(fā)酵液1mL加蒸餾水定容至50mL（稀釋50倍）。取兩支18×180mm試管，分別加入稀釋50倍后的發(fā)酵液各1mL，之后，一支加入對二甲氨基苯甲醛儲備液9mL，另一支加11硫

22、酸儲備液（即表示濃硫酸和水比例為11）9mL（做空白），搖勻后，共同放入沸水浴中加熱4min，取出，各加入2%的亞硝酸鈉溶液各1滴，搖勻后，繼續(xù)加熱3min，取出，冷水浴冷卻。用1cm比色皿在595nm處測定吸光值A(chǔ)。代入公式，計算色氨酸含量C。色氨酸標準工作曲線五、實驗結(jié)果及分析（一）測定方法1 總糖和還原糖含量測定2 氨基氮含量測定：甲醛氧化法3 發(fā)酵液中色氨酸含量的測定：比色法（二）計算1 發(fā)酵產(chǎn)率發(fā)酵產(chǎn)率是指單位操作時間內(nèi)，單位發(fā)酵罐容積生產(chǎn)的目的產(chǎn)物量，有小時產(chǎn)率（又稱發(fā)酵指數(shù)）和年產(chǎn)率兩種方法。發(fā)酵指數(shù)=g/(L·h)2以底物消耗為基準的菌體得率在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，某一時間

23、段內(nèi)，若菌體的濃度變化為X，對應(yīng)的某種營養(yǎng)物質(zhì)濃度變化為S，則菌體關(guān)于營養(yǎng)物質(zhì)的得率YX/S為：YX/S=3比生長速率反映菌體生長快慢的參數(shù)有菌體濃度變化率（dX/dt）和比生長速率（µ），二者的數(shù)學關(guān)系如下：=µXµ = 某一時段內(nèi)平均比生長速率的近似計算方法為： = 式中 X 發(fā)酵液中的菌體濃度，g/L；dX/dt 菌體濃度變化率，g/(L·h)；µ 比生長速率，h-1； 平均比生長速率，h-1；X1，X2 分別為對應(yīng)時刻t1和t2的菌體濃度。（三）分析菌體生長階段、糖耗與菌體生長及色氨酸合成的關(guān)系。（四）原始記錄及批報格式實驗發(fā)酵原始記錄

24、培養(yǎng)時間取樣時間罐溫（ºC）罐壓（MPa）通氣量（L/min）轉(zhuǎn)速（r/min）pH菌濃總糖（g/100mL）氨基氮（mg/100mL）細胞數(shù)量無菌度填表人六、注意事項提前一周將保藏的色氨酸產(chǎn)生菌接至斜面活化，培養(yǎng)成熟置斜面保藏備用。本實驗預(yù)計學時數(shù)20學時。附錄一 葡萄糖標準曲線的繪制發(fā)酵液中糖含量的分析蒽酮比色法原理：硫酸可使糖類脫水生成糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛與蒽酮脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍綠色，該物質(zhì)于620nm處有最大吸收。取葡萄糖標準溶液，適當稀釋配制成10、20、30、40、60、80 mg/L系列標準溶液，取各稀釋液1 mL加蒽酮試劑4 mL，搖勻，迅速浸于

25、冰水浴中冷卻，浸入沸水浴中自重新煮沸起，準確煮沸10 min取出，用流水冷卻，室溫放置10 min，用1 cm比色皿在620 nm處測定吸光值。以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度（mg/L）為橫坐標繪制L-色氨酸標準曲線，得出線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。發(fā)酵液中葡萄糖的定量測定將發(fā)酵液稀釋 倍，按照所述方法，做5個平行實驗，在620 nm波長下測定其吸光度，計算出發(fā)酵液中的糖含量.取1mL已處理好的樣液，加蒽酮試劑4mL，搖勻，迅速浸于冰水浴中冷卻，浸入沸水浴中自重新煮沸起，準確煮沸10 min取出，用流水冷卻，室溫放置10 min，用1 cm比色皿在620 nm處測定吸光值。以標準曲線法定量，求出葡萄

26、糖的含量。葡萄糖標準曲線的繪制按照上述方法繪制葡萄糖標準曲線，結(jié)果如圖所示。圖 葡萄糖標準曲線Calibration curve for the determination of Glucose由圖可知吸光度A與葡萄糖濃度之間形成一條良好的線性關(guān)系。線性回歸后得到回歸方程為A620nm=10.502C+0.0029，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9994，說明葡萄糖在0.010.08 g/L范圍內(nèi)，吸光度與葡萄糖濃度之間線性回歸比較顯著。附錄二 氨基氮的測定原理：由于NH3·H2O的Kb為1.8×10-5，它的共軛酸NH4+的Ka如下： 所以銨鹽中氮的含量不能用標準的堿直接滴定（只有

27、當弱酸的濃度與其解離常數(shù)的乘積大于10-8時，才有0.3pH的突躍，才能較準確地進行滴定）。甲醛試劑一方面可與無機銨迅速化合放出相當量的酸H+和質(zhì)子化的六亞甲基四銨鹽（Ka=7.1×10-6）.生成的酸可用酚酞做指示劑，用標準的氫氧化鈉溶液滴定。另一方面，由于甲醛的參與作用下，使氨基酸溶液的滴定終點能夠轉(zhuǎn)移到一般指示劑變色的范圍內(nèi)，可用標準堿液滴定。1）發(fā)酵液經(jīng)棉花或濾紙過濾，吸取濾液5ml于三角瓶中加無鹽水50ml，加甲基紅24滴，用0.1mol/L硫酸液滴至紅色不在消失，然后用0.0738mol/L氫氧化鈉滴至紅色剛退，加入18%的中性甲醛液5ml，搖勻，加入酚酞指示劑1ml，用0.0738mol/L氫氧化鈉滴定至酚酞剛顯紅色。以消耗的0.0738mol/L氫氧化鈉毫升數(shù)乘以20即為結(jié)果。2）采用公式計