色譜分析法液相色譜分離方法PPT課件

1、17.1固定相的作用 在液相色譜中通常都強(qiáng)調(diào)流動(dòng)相的作用，如流動(dòng)相的極性、選擇性和優(yōu)化等，這是因?yàn)樵谝合嗌V中流動(dòng)相參與柱色譜過(guò)程的分配作用，而且組分的最佳分離在很大程度上取決于流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化，并因此而忽略了柱子在液相色譜分離過(guò)程中的作用。其實(shí)液相色譜的發(fā)展主要是柱子和固定相的發(fā)展，色譜分離技術(shù)的開(kāi)拓和商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)往往集中于固定相和柱子。固定相和柱子是兩個(gè)相關(guān)而又不盡相同的兩個(gè)問(wèn)題，柱子包括固定相，但柱子還有柱型、柱尺寸、柱材料以及像離子色譜中的柱配置等問(wèn)題。 天然化合物多種多樣，它們可以按分子大小、極性、離解度和空間結(jié)構(gòu)等方法分類(lèi)，而這些化合物又通?？杀荒骋蝗軇┤芙?，甚至在溶液中解離。

2、而其中固定相在不同類(lèi)化合物的分離中起著相當(dāng)重要的作用，它決定了物質(zhì)的分離過(guò)程，也決定了流動(dòng)相的基本性質(zhì)。第1頁(yè)/共30頁(yè)27.2吸附色譜 吸附色譜（Adsorption Chromatography），文獻(xiàn)中也稱(chēng)之為液固色譜（Liquid Solid Chromatography）或正相色譜（Normal Phase Chromatography）。吸附一詞可能更準(zhǔn)確地反映這類(lèi)分離過(guò)程的本質(zhì)，并與液相色譜的其他技術(shù)相區(qū)別。7.2.1分離原理7.2.2固定相 吸附色譜中目前最常用的固定相是硅膠，其次是氧化鋁，為了某些樣品的分離，也使用苯乙烯二乙烯苯等聚合物作為吸附劑。硅膠表面的SiOH是最主要的

3、吸附點(diǎn)，氧化鋁中Al3+是顯著的吸附中心。選擇吸附劑的原則是樣品的性質(zhì)和吸附劑本身具有的品質(zhì)。這些品質(zhì)包括顆粒形狀、顆粒直徑、表面積、孔徑以及吸附劑表面的酸堿性等。附表7.1中列出了部分吸附劑的商品名稱(chēng)、特點(diǎn)和生產(chǎn)廠家，以硅膠為主。第2頁(yè)/共30頁(yè)37.2.3流動(dòng)相 在吸附色譜中，固定相是極性吸附劑，因此流動(dòng)相多以非極性溶劑為主?？勺鳛榱鲃?dòng)相的溶劑很多，根據(jù)式（7.5）可以把它們按照0的大小排列成表(見(jiàn)表6.7)，這種排列稱(chēng)為洗脫系列。這個(gè)表所列的數(shù)據(jù)是在氧化鋁柱上測(cè)定的，使用硅膠柱時(shí)順序不變，0SiO2 的數(shù)值相當(dāng)于0Al2O3的0.8倍左右。 這些溶劑大致可分為3類(lèi)：一類(lèi)是非極性的，如正己

4、烷等烴類(lèi)；一類(lèi)是中等極性的，主要是鹵代烷、酯類(lèi)；一類(lèi)是極性的，醇和乙腈；等等。水雖然是極性很強(qiáng)的溶劑，但水分子會(huì)永久地吸附在吸附劑的表面，導(dǎo)致活性降低而失去分離作用。第3頁(yè)/共30頁(yè)4圖7.1 二元混合物的溶劑強(qiáng)度（SiO2O2)第4頁(yè)/共30頁(yè)57.2.4溶質(zhì)的保留功能團(tuán)的極性越大，吸附作用越強(qiáng)，水的氫鍵作用甚至導(dǎo)致永久性吸附。圖7.2 吸附色譜（硅膠柱）流動(dòng)相對(duì)溶質(zhì)保留的影響第5頁(yè)/共30頁(yè)6在功能團(tuán)相同的情況下，分子的體積由于和數(shù)目的不同而不同。同分異構(gòu)體，主要指幾何異構(gòu)體，由于空間結(jié)構(gòu)的差別，在吸附劑表面上的吸附強(qiáng)度相差很大。7.3分配色譜 分配色譜（Partition Chromat

5、ography）以溶質(zhì)在流動(dòng)和固定兩相中的分配為基礎(chǔ)。在現(xiàn)代液相色譜中分配色譜大致分為兩類(lèi)：一類(lèi)類(lèi)似氣液色譜，把固定液涂布于惰性擔(dān)體上，為液液分配色譜。但在液相色譜中流動(dòng)相是液體，由于固定液在流動(dòng)相中的溶解而不能穩(wěn)定地保持在擔(dān)體上而給操作帶來(lái)麻煩；另一類(lèi)使用鍵合固定相，即把有機(jī)化合物的一部分通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合在擔(dān)體的表面上，而克服了固定液的流失現(xiàn)象，因此，使用這類(lèi)固定相的色譜過(guò)程也稱(chēng)為鍵合相色譜（Bonded Phase Chromatography）。第6頁(yè)/共30頁(yè)77.3.1分離原理 在分配色譜中流動(dòng)相和固定相是互不相溶的兩種液體，溶質(zhì)既溶解于固定相，也溶于流動(dòng)相中，并根據(jù)在兩相中的溶解度

6、不同而分布于兩相中，類(lèi)似液液萃取過(guò)程。7.3.2固定相）載體圖7.3 硅膠表面化學(xué)第7頁(yè)/共30頁(yè)8）鍵合反應(yīng)）固定相的性質(zhì)7.3.3流動(dòng)相圖7.4反相HPLC主要溶劑與水混合時(shí)溶劑強(qiáng)度的比較，ACN乙腈，MeOH甲醇，THF四氫呋喃第8頁(yè)/共30頁(yè)92)正相色譜）反相色譜圖7.5 反相HPLC中流動(dòng)相pH值對(duì)組分分離的影響第9頁(yè)/共30頁(yè)10圖7.6離子強(qiáng)度對(duì)PTH（乙內(nèi)酰苯硫脲）組氨酸（H）和精氨酸（R）衍生物保留的影響第10頁(yè)/共30頁(yè)117.3.4溶質(zhì)的保留 以鍵合固定相為基礎(chǔ)的分配色譜，特別是反相色譜，由于流動(dòng)相選擇的隨意性，可分析的樣品范圍非常廣。7.4離子對(duì)色譜 離子對(duì)色譜（Io

7、nPair Chromatography）源于液液萃取過(guò)程，是經(jīng)典的離子型化合物的分離方法。7.4.1分離原理 7.4.2離子對(duì)試劑7.4.3固定相 在反相離子對(duì)色譜中主要使用鍵合相。鍵合固定相對(duì)分離的影響主要是表面覆蓋程度和鍵合相的種類(lèi)。比較差的固定相難以得到重復(fù)性的結(jié)果，也難以對(duì)分離作出預(yù)測(cè)。常使用的固定相是C18或C8鍵合相，短鏈的穩(wěn)定性比較差。第11頁(yè)/共30頁(yè)127.4.4流動(dòng)相(1)介質(zhì) (2)對(duì)離子的濃度(3)有機(jī)改性劑圖7.7 固定相中配對(duì)離子濃度（mol/g)對(duì)K(對(duì)數(shù)值）的影響第12頁(yè)/共30頁(yè)137.4.5應(yīng)用 離子對(duì)色譜主要用于離子型或可離子化的化合物，這些化合物多數(shù)與

8、生命科學(xué)有關(guān)系，如天然化合物、合成藥物、生物體液等。這些化合物如果不經(jīng)過(guò)處理采用常規(guī)正、反相色譜方法是難以分析的。因此，在這些領(lǐng)域的研究中，離子對(duì)色譜具有廣泛的用途。7.5離子交換與離子色譜 離子交換現(xiàn)象作為一種色譜技術(shù)始于20世紀(jì)50年代氨基酸的分析，并成為現(xiàn)代液相色譜技術(shù)發(fā)展的開(kāi)端。雖然其他色譜技術(shù)也可以分離離子型化合物，但相比之下離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography）和以離子交換為基礎(chǔ)的離子色譜（Ion Chromatography）在離子型化合物的分析中，特別是環(huán)境、食品及金屬化合物等樣品的分析中仍具有廣泛的用途。7.5.1離子交換原理7.5.2固定相第

9、13頁(yè)/共30頁(yè)14）聚合物交換劑（）化學(xué)性質(zhì)（）物理結(jié)構(gòu)圖7.8 離子交換劑的類(lèi)型第14頁(yè)/共30頁(yè)15）硅膠鍵合相7.5.3流動(dòng)相圖7.9 硅膠鍵合離子交換劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)第15頁(yè)/共30頁(yè)16圖7.9 硅膠鍵合離子交換劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)第16頁(yè)/共30頁(yè)177.5.4離子色譜 圖7.11雙柱離子色譜工作原理示意圖第17頁(yè)/共30頁(yè)18圖7.12 離子色譜抑制膜工作原理第18頁(yè)/共30頁(yè)197.5.5離子色譜流動(dòng)相 離子色譜流動(dòng)相雖然總的趨勢(shì)是降低離子強(qiáng)度，但雙柱和單柱仍有不同。除離子分離的共同目的外，雙柱要考慮離子抑制形式，單柱只考慮與檢測(cè)方法的匹配。 ）雙柱（）陰離子（）陽(yáng)離子）單柱第19頁(yè)/共

10、30頁(yè)20（）陰離子（）陽(yáng)離子）假峰7.6體積排阻色譜 溶質(zhì)分子在多孔填料表面上受到的排斥作用稱(chēng)為排阻（exclusion）。產(chǎn)生排阻現(xiàn)象的原因很多，如帶電粒子的電荷，溶質(zhì)分子的大小和空間結(jié)構(gòu)，等等。根據(jù)這種現(xiàn)象，將溶質(zhì)分離的色譜過(guò)程稱(chēng)為排阻色譜。7.6.1分離原理 固體填料表面有不同尺寸的孔，它們按一定規(guī)律分布，并在制造過(guò)程中加以控制。試樣中溶質(zhì)的體積，即分子量，也不同，對(duì)于齊聚物，分子大小的分布也有一定規(guī)律?，F(xiàn)在用一個(gè)孔來(lái)說(shuō)明溶質(zhì)的分離過(guò)程。第20頁(yè)/共30頁(yè)21圖7.14 體積阻組色譜的校正曲線(xiàn)第21頁(yè)/共30頁(yè)227.6.2固定相圖7.15 孔徑與分離范圍之間的關(guān)系7.6.3流動(dòng)相 7

11、.7.1基本原理7.7.2配體 配體應(yīng)具有下列性質(zhì)：與反配體物生成可逆復(fù)合物；生成的復(fù)合物具有選擇性，并在一定條件下要有足夠的穩(wěn)定性；具有可固定在載體上的功能團(tuán)，且反應(yīng)具有專(zhuān)一性，避免非特異吸附及其他反應(yīng)。第22頁(yè)/共30頁(yè)23）特異性配體）非特異性或組特異性配體7.7.3載體(1)有機(jī)或生物聚合物，如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等軟性載體。(2)合成聚合物，如高交聯(lián)度苯乙烯二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、N丙烯?；鶈徇cN,N亞甲基一二酰胺共聚、羥基甲基丙烯酸、乙酯與二甲基丙烯酸乙烯酯共聚以及三丙烯?；酆衔锏取?3)無(wú)機(jī)物，如多孔玻璃、硅膠和氧化鋁等。7.7.4載體活化 載體活化很重要。在溴化氰活

12、化法（Axen.R.1967）引入之前，活化一直是影響親和色譜發(fā)展的障礙之一。配體固定在載體上稱(chēng)為固定化。配體要固定在載體上它們之間必須有相互作用的極性基團(tuán)，才能形成穩(wěn)定的固定相。第23頁(yè)/共30頁(yè)247.7.5固定化 圖7.16 間隔臂對(duì)配體效率的影響7.7.6洗脫 ）吸附）洗脫7.8手性色譜 飽和碳原子可以結(jié)合四個(gè)原子或基團(tuán)形成以碳原子為中心的四面體結(jié)構(gòu)。當(dāng)與碳聯(lián)結(jié)的四個(gè)原子或基團(tuán)完全不同時(shí)，可能出現(xiàn)兩個(gè)分子不能重疊的現(xiàn)象。第24頁(yè)/共30頁(yè)257.8.1分離原理（1）固定相（液體或固體）是手性的，流動(dòng)相是非手性的。（2）固定相是非手性的，流動(dòng)相是手性的，即在流動(dòng)相中添加手性試劑。圖7.1

13、7 三點(diǎn)作用模型第25頁(yè)/共30頁(yè)267.8.2固定相7.8.2固定相圖7.18 纖維素和支鏈淀粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)第26頁(yè)/共30頁(yè)272)環(huán)糊精（Cyclo dextrins，CD）圖7.19 環(huán)糊精的化學(xué)結(jié)構(gòu)和它在水相中的假想構(gòu)型第27頁(yè)/共30頁(yè)28）蛋白質(zhì)鍵合相）合成聚合物）選擇基鍵合相）配體交換固定相7.8.3流動(dòng)相（）纖維素及其衍生物（）環(huán)糊精（）蛋白質(zhì)鍵合相（）合成聚合物（）鍵合相7.8.4手性流動(dòng)相 普通硅膠鍵合相具有很好的色譜性能，但它不能直接用于旋光異構(gòu)體的分離。如果把選擇基添加到流動(dòng)相中，則可以使用這些鍵合相，并且有較寬的選擇性。第28頁(yè)/共30頁(yè)297.9高效液相色譜的應(yīng)用 高效液相色譜的出現(xiàn)與發(fā)展，使色譜的應(yīng)用領(lǐng)域驟然擴(kuò)大。就其分析的樣品而言幾乎無(wú)所不包，如：烴與芳烴，含氧、氮、