分子信標(biāo)：新型核酸分子探針

1、分子信標(biāo)：新型核酸分子探針摘要：分子信標(biāo)是基于熒光共振能量傳遞原理設(shè)計的一種發(fā)夾型寡聚核酸分子熒光探針，能夠與待測核酸序列分子相互作用發(fā)生結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生不同強度的熒光信號及電化學(xué)信號等，具有高靈敏度、高選擇性、適于活體檢測等優(yōu)點。本文介紹了分子信標(biāo)的作用原理，不同的分子信標(biāo)類型以及應(yīng)用，最后對前景作出了預(yù)測。關(guān)鍵詞：分子信標(biāo) 熒光探針 靈敏度 選擇性 活體檢測引言：從20世紀(jì)60年代初至今，分子信標(biāo)（Molecular beacon,MB）已被廣泛地應(yīng)用于生物、藥物、化學(xué)等多個領(lǐng)域【1,2,3,4】。近年來，MB特別是基于DNA結(jié)構(gòu)的MB，已成為一種重要工具，用于核酸的復(fù)制、重組、翻譯和表達(dá)的研

2、究【5,7,12】。為了滿足后基因組時代的發(fā)展需求，人們通過各種分子工程策略，發(fā)展了許多敏銳性更高、選擇性更優(yōu)的MB。自從1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信標(biāo)探針，由于其獨特的性質(zhì)和多功能性，如操作簡單、靈敏度高、特異性強等。在它出色地完成了液相靶標(biāo)測定(實時PCR測定)任務(wù)之后，人們又將其應(yīng)用于核酸實時定量測定、活體分析、化學(xué)與生物傳感、疾病基因檢測與診斷等研究中【8,9,10,11】。又由于易于對其進(jìn)行修飾和改性，在這十來年的發(fā)展中，人們在經(jīng)典分子信標(biāo)模型的基礎(chǔ)上，設(shè)計出了許多新型的分子信標(biāo)，如無莖分子信標(biāo)，用PNA【13】鏈代替ssDNA形成的PNA分子信標(biāo)，以及LN

3、A分子信標(biāo)等。這些新型的分子信標(biāo)是為了滿足不同的需要而設(shè)計的，特異性更強，穩(wěn)定性更好，為許多新的研究領(lǐng)域提供了一個平臺。為了滿足基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，對分子信標(biāo)的固定化也成了必然的發(fā)展趨勢，自從譚蔚泓【14】首次將分子信標(biāo)固定在硅膠上以來，固定化分子信標(biāo)也迅速發(fā)展起來。尤其是后來設(shè)計的將分子信標(biāo)固定在金表面【15,16】，利用金的強摩爾消光系數(shù)進(jìn)行淬滅，簡化了分子信標(biāo)的設(shè)計，更加方便對其進(jìn)行操作，大大促進(jìn)了基因微陣列技術(shù)的發(fā)展。1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)和作用原理分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)(圖1)：分子信標(biāo)是一種設(shè)計巧妙的熒光探針。常規(guī)的分子信標(biāo)是由一段包含了莖一環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈寡聚核苷酸組成，形成一個發(fā)夾型結(jié)

4、構(gòu)。在其環(huán)狀部分，一般是一段長度為1530堿基的序列，能與目標(biāo)分子特異結(jié)合，莖區(qū)是長度為58堿基的互補序列，莖區(qū)的兩端分別連接有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。為了保證分子信標(biāo)的靈敏度和熱力學(xué)穩(wěn)定性，在其莖干區(qū)設(shè)計的堿基數(shù)目一般為其環(huán)區(qū)的一半。過長，則靈敏度下降；過短，則穩(wěn)定性下降。由于分子信標(biāo)雜交前后環(huán)狀區(qū)與目標(biāo)分子的雙鏈結(jié)構(gòu)之間存在熱力學(xué)平衡關(guān)系，使它的雜交特異性明顯高于常規(guī)的線狀探針。近來，Dubertret等【17】用金納米粒子簇代替DABcYL做淬滅劑，可以通過調(diào)節(jié)金納米簇的形狀、大小和組成而得到不同的淬滅劑。由于金納米簇對熒光試劑有著更高的淬滅效率，所以用金納米粒子代替DABcYL后，大大提高

5、了分子信標(biāo)的靈敏度和特異性。其它的淬滅基團(tuán)還有銅離子螯合物【18】、超分子淬滅劑【19】以及直接利用堿基【20】本身做淬滅劑等。 圖1 典型分子信標(biāo)結(jié)構(gòu) 另一種結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)是無莖分子信標(biāo)。與經(jīng)典分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)類似，無莖分子信標(biāo)只是不再含有雙鏈結(jié)構(gòu)的莖桿區(qū)，只含有單鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有很好的柔韌性。目前的無莖分子信標(biāo)有PNA【21,22,23】和DNA【24,25,26】兩種，自由狀態(tài)時，由于熒光分子與淬滅分子之間的疏水作用使得無莖分子信標(biāo)近似于一個閉環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)分子信標(biāo)與靶序列結(jié)合后，探針與靶標(biāo)形成的雙鏈由于具有剛性使得熒光分子與淬滅分子分開，熒光恢復(fù)。無莖分子信標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)分子信標(biāo)相比，由于其柔韌性

6、增加，所以在體系中檢測時，對靶標(biāo)的響應(yīng)加快，特異性也增強，又因為其不需要莖的結(jié)構(gòu)，在設(shè)計和合成上相對簡單，成本降低。但其結(jié)構(gòu)上缺少了莖區(qū)，穩(wěn)定性有所下降，背景熒光相對增強。分子信標(biāo)作用原理：在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)以發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，莖區(qū)的堿基互補配對，使連接在探針的5端熒光基團(tuán)及3端的淬滅基團(tuán)相互接近(約為710 nm)。當(dāng)一定波長的激發(fā)光照射時，熒光分子和淬滅分子之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。熒光基團(tuán)受激所產(chǎn)生的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，并以熱量的形式散發(fā)，熒光幾乎完全淬滅，此時熒光背景極低(如圖2)。加入與環(huán)狀區(qū)互補的靶核苷酸序列后，分子信標(biāo)可與之形成相對剛性并且更加穩(wěn)定的雙鏈體，使莖干區(qū)的互補鏈被拉開

7、，從而使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，空間距離增大，根據(jù)Forster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。雜交后，分子信標(biāo)的熒光幾乎完全恢復(fù)。并且熒光強度與溶液中靶標(biāo)序列的量成正比，所以可以用來作定量分析。 圖2. 分子信標(biāo)作用原理2 分子信標(biāo)的類型2.1 雙重?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)分子信標(biāo)雙重?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)(圖3)分子信標(biāo)【27】是指在一個體系中同時設(shè)計了兩種分子信標(biāo)，只有通過這兩種分子信標(biāo)的相互作用才能實現(xiàn)檢測。其中一個分子信標(biāo)包含一個熒光給體基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)，另一個分子信標(biāo)包含一個熒光受體基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)。在自由狀態(tài)時，熒光給體基團(tuán)和熒光受體基團(tuán)都處于

8、熒光淬滅狀態(tài)，當(dāng)在體系中加入目標(biāo)分子時，這一對分子信標(biāo)同時打開，熒光給體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)頭對頭地與目標(biāo)分子特異性結(jié)合，此時，兩基團(tuán)彼此挨得很近(<6 nm)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，給體分子將能量傳遞給受體分子，受體分子獲得能量發(fā)出特征熒光。通常用來做熒光給體的是鑭系元素螯合物，有機(jī)熒光團(tuán)作為熒光受體。因為鑭系元素螯合物的熒光發(fā)光壽命很長(約1 ms)，發(fā)出的光的帶分布很窄，在某一些波長區(qū)域，幾乎不發(fā)熒光，而且還能有效地降低熒光受體基團(tuán)、實驗中干擾物以及池子自身的熒光，使得在某一些波長區(qū)域的背景熒光幾乎接近零，大大地提高了信噪比，從而提高了檢測的靈敏度，所以很適合于作為熒光給體材料。因為

9、常規(guī)的分子信標(biāo)用于活體檢測時，由于細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境比較復(fù)雜，如可能被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解或非特異性地與核酸結(jié)合蛋白結(jié)合，而導(dǎo)致假陽性信號。但采用這種雙重?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)分子信標(biāo)，因為只有當(dāng)熒光給體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)同時發(fā)生雜交時，才能發(fā)出受體基團(tuán)的特征熒光，所以能大大地減小假陽性信號。與以前的雙線型探針相比，采用這種方法能顯著地降低由于光譜重疊而產(chǎn)生的高背景信號，提高檢測靈敏度，還能區(qū)分單堿基多態(tài)性【28,29】。因此，這種分子信標(biāo)將會成為基因表達(dá)實時監(jiān)測，活體細(xì)胞定量檢測的有力工具【30,31】。 圖3 FRET雙分子信標(biāo)2.2超級猝滅基團(tuán)分子探針(SQ-MB)SQ-MB是一個一端具有

10、多個猝滅基團(tuán)的熒光分子探針【32,33】，如圖4所示。近年來，MB被廣泛地應(yīng)用于生物技術(shù)研究的各個領(lǐng)域。但由于MB結(jié)構(gòu)中的熒光基團(tuán)不能被有效地猝滅，較高的背景噪音嚴(yán)重影響了實際應(yīng)用過程中測試結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，通過結(jié)構(gòu)的優(yōu)化以降低體系的背景噪音越來越受到關(guān)注。據(jù)報道，應(yīng)用多個猝滅基團(tuán)與一個熒光基團(tuán)配對，可以有效地提高猝滅效率。這是由于多個猝滅基團(tuán)可以提高吸收效率、增強猝滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)問的偶極一偶極配位能力，從而提高猝滅效率。圖4 包含3個淬滅基團(tuán)的分子信標(biāo)2.3 鎖定分子信標(biāo)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對分子信標(biāo)的應(yīng)用也不僅僅限于體外檢測?；铙w檢測是目前發(fā)展的一個很重要的方向，但由于活體內(nèi)的環(huán)境比

11、體外要復(fù)雜得多，如活體內(nèi)存在的核酸酶能快速地將常規(guī)的分子信標(biāo)分解，造成假陽性信號。對分子信標(biāo)進(jìn)行修飾【34】就是為了有效地避免核酸酶等外在物質(zhì)的影響而進(jìn)行的。而鎖定分子信標(biāo)正是為了滿足這一發(fā)展需求而設(shè)計的一類穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度都非常高的核酸探針。LNA【35,36】是將核苷酸中的核糖的2一O和4一C用一個亞甲基連結(jié)起來，形成一個核糖雙環(huán)結(jié)構(gòu)，改變了它的幾何和立體性質(zhì)，減小了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，從而顯著地提高了它的穩(wěn)定性。但修飾后的核酸依然保持了雙螺旋結(jié)構(gòu)，對互補鏈的親和度不受影響，在水中的溶解度也能保持一樣，還因其帶有一定的負(fù)電荷，用帶正電荷的脂質(zhì)體就能很容易地將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，且它的合成方法

12、也與合成DNA的方法類似。因此，鑒于LNA的上述性質(zhì)，在實驗室用LNA操作起來就比DNA方便，能夠簡化實驗過程。圖5 LNA/2-O-methyl RNA探針I(yè)rina【37】 等用 LNA/2-O-methyl RNA嵌合探針用于活細(xì)胞中mRNA中的動態(tài)成像。實驗結(jié)果表明該方法與普通的分子信標(biāo)相比，與mRNA的雜化率更高。2.4 無莖分子信標(biāo)在實際的檢測中，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)僅僅只是一個輔助基團(tuán)，真正起識別作用的只是分子信標(biāo)的環(huán)狀部分。無莖PNA能快速地與目標(biāo)鏈結(jié)合，減少檢測時間，并且在復(fù)雜的體系中也能保持相對的穩(wěn)定性。如將其與PNA 結(jié)合使用，還可用于DNA和RNA的檢測，背景信號低【38

13、】(圖6)。圖6 stemless FITPNA beacons in the detection of complementary nucleic acids2.5 熒光波長轉(zhuǎn)移型分子信標(biāo)圖7 熒光波長轉(zhuǎn)移型分子信標(biāo)在常規(guī)的分子信標(biāo)基礎(chǔ)上，Carolin【39】等設(shè)計了另一種分子信標(biāo)。他們在分子信標(biāo)莖部加入兩個發(fā)色團(tuán)噻唑橙和噻唑紅作為人工堿基，兩者間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，用490nm的光照射，發(fā)射峰在670nm，由綠光變?yōu)榧t光，然而當(dāng)該分子信標(biāo)與目標(biāo)鏈結(jié)合后，熒光降為530nm，該方法的優(yōu)勢在于不需要淬滅劑，而且背景信號低。3 固定化分子信標(biāo)分子信標(biāo)對靶序列的檢測盡管十分靈敏，但早期發(fā)展起來的分子

14、信標(biāo)都是用于液相中的檢測，這樣就限制了分子信標(biāo)在活體生物醫(yī)學(xué)研究和DNA生物傳感中的大規(guī)模應(yīng)用。但如果能將不同序列的多種分子信標(biāo)固定在固體基片表面，并保持其原有性質(zhì)不變，無疑將可用于DNA的大規(guī)模并行檢測，大大提高分析效率。而目前固定化的分子信標(biāo)從檢測方式上來分有基于熒光和基于電化學(xué)的兩種。3.1 基于熒光檢測的固定化分子信標(biāo)這一方向的固定化分子信標(biāo)開展得相對較早，而且在這幾年的發(fā)展中也取得了不小的進(jìn)步。譚蔚泓等【14,41】于1999年首次通過生物素一抗生物素蛋白將分子信標(biāo)固定在硅片表面(圖8)。他選取靠近淬滅基團(tuán)的莖干區(qū)做固定點，將生物素標(biāo)記到ssDNA上，因為這樣對分子信標(biāo)的熒光、淬滅以

15、及雜交影響最小，再將標(biāo)記好的分子信標(biāo)連接到標(biāo)記有親和素的硅膠表面。為了盡可能地減小固定化的分子信標(biāo)產(chǎn)生的光漂白現(xiàn)象，他們采用羅丹明作為熒光基團(tuán)。這種固定化的分子信標(biāo)可以用于均相液態(tài)環(huán)境以及固液界面等較為復(fù)雜的環(huán)境中，其雜交能力，親和性等性質(zhì)基本不變，能檢測到的靶序列濃度達(dá)納摩爾級。圖8 固定化分子信標(biāo)3.2 基于電化學(xué)檢測的固定化分子信標(biāo)分子信標(biāo)的熒光檢測方法在過去的十來年中在實驗室已經(jīng)取得了很大的發(fā)展, 然而，固定化分子信標(biāo)用于電化學(xué)檢測也有報道。2011年，湖南大學(xué)的Liu C【40】等人用固定化分子信標(biāo)通過電化學(xué)方法檢測銅綠單胞桿菌的rRNA，如圖9所示，起初，信標(biāo)環(huán)成閉合狀態(tài)，當(dāng)加入目

16、標(biāo)鏈和鏈霉素辣根過氧化物酶（HRP)后，分子信標(biāo)構(gòu)型發(fā)生改變，目標(biāo)鏈與信標(biāo)環(huán)雜交，導(dǎo)致莖部打開，底部的生物素結(jié)合到基底上，而HRP結(jié)合到另一端，同時產(chǎn)生電化學(xué)信號。該方法的檢測限可達(dá)到0.012pg/mL，顯示了極高的靈敏度。圖9 基于電化學(xué)方法的固定化分子信標(biāo)4 分子信標(biāo)的應(yīng)用4.1 用于核酸檢測分析分子信標(biāo)在液相反應(yīng)體系中的一個最大的優(yōu)勢就是不需對多余的分子信標(biāo)進(jìn)行分離就可以檢測，所以它最開始的應(yīng)用便是用于PCR的檢測體系中【42】。由于它的背景信號很低，在每一輪的反應(yīng)中當(dāng)在反應(yīng)體系中加入與擴(kuò)增序列互補的分子信標(biāo)時，根據(jù)熒光強度的變化即可對擴(kuò)增過程進(jìn)行實時監(jiān)測，還可對體系中的擴(kuò)增靶標(biāo)量進(jìn)行

17、定量。Michael【43】等用鎖定分子信標(biāo)作為熒光探針用于細(xì)胞內(nèi)核酸檢測在DNA的體外檢測中。Wu【44】等用分子肽信標(biāo)比率計傳感檢測核酸，通過結(jié)合核酸前后熒光截然不同的變化，該信標(biāo)還可用于細(xì)胞內(nèi)核酸成像。Fu【45】等用DNA酶分子信標(biāo)探針用于靶誘導(dǎo)信號放大比色法檢測核酸，該方法通過巧妙的設(shè)計，使得待檢測DNA循環(huán)檢測，信號放大，達(dá)到了10nm的檢測限，比已報道方法低20倍。4.2 用于蛋白質(zhì)檢測分析盡管最初設(shè)計分子信標(biāo)的目的是用來特異性地檢測核酸，但當(dāng)這些探針與蛋白質(zhì)結(jié)合時，發(fā)現(xiàn)其熒光強度也會增加，這說明分子信標(biāo)對蛋白質(zhì)也有一定的識別能力，而核酸識體對蛋白質(zhì)的親和力和特異性可與蛋白質(zhì)的抗

18、體相媲美，解離常數(shù)通常在納摩爾到皮摩爾之間，且與抗體相比具有許多優(yōu)越性。如核酸識體是體外人工化學(xué)合成，合成簡單，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，容易修飾，可以按需要對序列中的核苷酸定點標(biāo)記各種官能團(tuán)和報告基團(tuán)(如熒光基團(tuán))，便于核酸識體的固定化和信號的檢測，檢測目標(biāo)廣泛等。所以將分子信標(biāo)和核酸識體有機(jī)地結(jié)合起來，這樣得到的組裝體叫做分子信標(biāo)識體，它一般是一種單鏈DNA或RNA分子，通常含有2560個核苷。 目前將分子信標(biāo)識體用于蛋白質(zhì)的研究中，研究得比較多的是凝血酶的檢測。Zhang【46】等設(shè)計了一個基于G四聚體結(jié)構(gòu)分子信標(biāo)的雙功能比色寡核苷酸探針，可以用于凝血酶的檢測。它是將識體的兩端分別連接上熒光基團(tuán)

19、和淬滅基團(tuán)，在凝血酶的存在下，分子信標(biāo)主要是以四螺旋(Quadruplex form)的形式存在，迫使熒光基團(tuán)靠近淬滅基團(tuán)，使熒光淬滅，但當(dāng)不存在凝血酶時，它可以采用任意的構(gòu)型，結(jié)合前后構(gòu)型的變化就是分子信標(biāo)識體信號轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)。4.3 DNA芯片與DNA傳感器傳統(tǒng)的DNA芯片是采用線型DNA探針作為捕獲探針，這種方法最大的缺點是需要對目標(biāo)鏈進(jìn)行標(biāo)記，這樣既耗時耗力，又容易增加在分析過程中誤差。而基于分子信標(biāo)的DNA芯片，展現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性、選擇性和更高的特異性，而且與其它類型探針的DNA芯片相比，分子信標(biāo)芯片具有背景熒光低、無需除去多余的探針、可多次使用等優(yōu)點。鑒于分子信標(biāo)在核酸、蛋白質(zhì)檢測分

20、析中的這些優(yōu)點，分子信標(biāo)作為生物芯片、生物傳感器中的探針分子，具有很大的意義【47】。5 小結(jié)與展望 分子信標(biāo)作為一種核酸探針，由于其巧妙的設(shè)計和獨特的性質(zhì)，引起了研究者們極大的興趣。盡管其最初的設(shè)計目的是利用它在檢測前后熒光強度的變化來對核酸進(jìn)行定量檢測，特別是用作實時熒光PCR反應(yīng)的探針。在這十來年的研究中，針對分子信標(biāo)在實際應(yīng)用中遇到的種種問題，出現(xiàn)了一系列新型的分子信標(biāo)，從DNAPNALNA，其應(yīng)用領(lǐng)域也從對一般PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時定量、定性分析、基因的點突變、SNP(單堿基多態(tài)性)、等位基因分析發(fā)展到用于活體的核酸代謝分析、DNA與蛋白質(zhì)相互作用分析、DNA傳感器、DNA芯片等【48,

21、49,50】。隨著分子信標(biāo)在分子生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中的進(jìn)一步拓寬，分子信標(biāo)在以下幾個方面有望得到進(jìn)一步的突破：(1)在保持其精簡構(gòu)型的前提下，拓寬分子信標(biāo)適應(yīng)的條件范圍，增強其穩(wěn)定性，提高選擇性，使其能應(yīng)用于大量疾病診斷和復(fù)雜條件下基因表達(dá)檢測中。(2)進(jìn)一步降低背景信號，提高分子信標(biāo)的信噪比，使其靈敏度和特異性有進(jìn)一步的突破，如選擇合適的熒光基團(tuán)淬滅基團(tuán)對，或?qū)Ψ肿有艠?biāo)進(jìn)行修飾。以滿足基因結(jié)構(gòu)、疾病診斷、疾病機(jī)制、藥物篩選等方面的應(yīng)用【51,52】。(3)優(yōu)化分子信標(biāo)的堿基序列和設(shè)計，使其能更好地應(yīng)用于功能基因組、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中。參考文獻(xiàn)1.Dave N, Liu J W. Fast Mol

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