細(xì)胞壁蛋白與寡糖素3

1、細(xì)細(xì) 胞胞 壁壁 (cell wall) 次生細(xì)胞壁、初生細(xì)胞壁和中膠層結(jié)構(gòu)示意圖次生細(xì)胞壁、初生細(xì)胞壁和中膠層結(jié)構(gòu)示意圖細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)(the proteins of cell wall) l是植物初生細(xì)胞壁中一類富含羥脯氨酸的糖蛋白(hydroxyproline-richglycoprotein ergp)，為英國劍橋大學(xué)的lamport和northcote于1960年首次發(fā)現(xiàn)。同年，美國威斯康星大學(xué)的dougall和shimbayasi也發(fā)表了類似的結(jié)果。因猜測這種蛋白質(zhì)可能與細(xì)胞生長時的細(xì)胞壁伸展性有關(guān)，故lamport試名之為伸展蛋白。llamport在番茄細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)了羥脯氨酸阿

2、拉伯糖苷，并證實了這類糖苷和不被糖基取代的羥脯氨酸在菌藻、苔蘚、蕨類和種子植物四大門的多種植物細(xì)胞壁中的廣泛存在。l用酸和胰酶水解番茄細(xì)胞壁，得到了5種肽段。其突出特點是都含有五肽段五肽段ser(hyp)4。l在此基礎(chǔ)上，經(jīng)證實伸展蛋白中半乳糖以糖苷鍵與絲氨酸相聯(lián)之后，lamport提出了伸展蛋白由重復(fù)的結(jié)構(gòu)單位所組成的設(shè)想。la：serhyphyphyphypserhypserhyphyphyphyp(“tyr”tyr)lyslb：serhyphyphyphypserhyplyslc：serhyphyphyphypthrhypvaltyrlysld：serhyphyphyphyplysle：

3、serhyphyphyphypval(“tyr”lyslys)lsmith等發(fā)展了從完整細(xì)胞直接分離純化伸展蛋白前體的技術(shù)，從番茄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞得到了伸展蛋白前體p1和p2。l經(jīng)氟化氫脫糖、胰酶水解和高效液相層析，得的肽段特點也是都具有五肽段ser(hyp)4 。這就進(jìn)一步支持了lamport等提出的結(jié)構(gòu)單位的設(shè)想。lp1：lh5：serhyphyphyphypthrhypvaltyrtyslh20：serhyphyphyphypvallysprotyrhisprothrhypvaltyrlyslp2：lh4：serhyphyphyphypvaltyrlyslh11：serhyphyphyphy

4、pval1/2idtlyslchen和varner建立了胡蘿卜伸展蛋白的cdna克隆和基因組文庫。從dna序列推斷出一個有306個氨基酸殘基、富含羥脯氨酸的多肽。其中五肽段ser-(hyp)4重復(fù)了25次。此后，其它研究組相繼在菜豆和牽牛等植物中分離了伸展蛋白的cdna或基因組克隆，并發(fā)現(xiàn)它們所編碼的多肽中都有重復(fù)出現(xiàn)的ser-(pro)4。l羥脯氨酸是脯氨酸羥基化的產(chǎn)物，ser-(hyp)4是伸展蛋白中重復(fù)出現(xiàn)的特征性結(jié)構(gòu)單位，甚至可以說是判別伸展蛋白的絕對必要條件。 la：serhyphyphyphypserhypserhyphyphyphyp(“tyr”tyr)lyslb：serhyph

5、yphyphypserhyplyslc：serhyphyphyphypthrhypvaltyrlysld：serhyphyphyphyplysle：serhyphyphyphypval(“tyr”lyslys)l (帶引號者為酪氨酸衍生物)l一些研究者發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞壁蛋白，它們的生化特性與經(jīng)典的伸展蛋白類似，但卻不含ser-(hpy)4這一結(jié)構(gòu)單位。如tierney等在胡蘿卜根中發(fā)現(xiàn)的、具有13次重復(fù)的 proproval/ilehislys和第4次重復(fù) proprovaltyrthr 的壁蛋白p33；franssen等發(fā)現(xiàn)的、含有重復(fù)20次的proprohisglulys的根瘤蛋白noduli

6、n75；以及 hong等和averyhart-fullard等發(fā)現(xiàn)的含有多次重復(fù)proprovaltyrlys的大豆細(xì)胞壁蛋白。因為這些蛋白質(zhì)都不含有ser-(pro)4而不被認(rèn)為是伸展蛋白。 l李雄彪等從甜菜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中純化到一種細(xì)胞壁蛋白p1。根據(jù)這種糖蛋白的氨基酸組成、中性糖的種類和含量、免疫學(xué)特性、電鏡下的形狀以及能被伸展蛋白過氧化物酶在體外交聯(lián)成多聚體等特性，而被確認(rèn)為伸展蛋白的前體。但是，經(jīng)胰酶水解后的甜菜p1的肽段序列中卻不存在ser-(hyp)4。l根據(jù)甜菜p1的肽段序列，經(jīng)分析比較胡蘿卜p33、nodulin75等氨基酸序列，李雄彪等提出serhyphyp(x)hyphyp

7、肽段是伸展蛋白的結(jié)構(gòu)特點。 lh2：tyrprohyphypthrhypvaltyrtyslh1：serhyphypvalhislyslh5：serhyphypvalhisglutyrprohyphypthrhypvaltyrtysl1、羥脯氨酸的含量一般為蛋白質(zhì)的30%40%。其它含量較高的氨基酸是絲氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸和賴氨酸。l2、糖的組分主要是阿拉伯糖和半乳糖，含量為糖蛋白的26%65%。聯(lián)接到氨基酸上的糖在維持伸展蛋白的羥脯氨酸左手螺旋第ii型構(gòu)象中起重要作用。l3、含特征性結(jié)構(gòu)單位serhyphyp(x)hyphypl4、透射電鏡下單體分子為具紐結(jié)的桿棒狀l不少實驗

8、證據(jù)表明，伸展蛋白與細(xì)胞壁的伸展性并沒有直接關(guān)系。lamport本人也不堅持初衷。但由于extensin這一名詞已被廣泛沿用至今，目前尚未有人建議為伸展蛋白“正名”。l前述伸展蛋白的結(jié)構(gòu)特點與動物結(jié)締組織中富含羥脯氨酸的結(jié)構(gòu)糖蛋白膠原的特點極其相似。所以，人們認(rèn)為伸展蛋白是細(xì)胞壁中起結(jié)構(gòu)作用的一種組分。llamport和epstein提出的經(jīng)緯模型(warp and weft model)較好地解釋了伸展蛋白的結(jié)構(gòu)作用。l可溶性的伸展蛋白前體從垂直于細(xì)胞壁平面的方向(緯向)由細(xì)胞質(zhì)分泌到細(xì)胞壁中；l 在平行于細(xì)胞壁的方向(經(jīng)向)，纖維素一層一層地敷著(apposition)到細(xì)胞壁上并形成獨立

9、的微纖絲;l橫向進(jìn)入、亦即內(nèi)填(intussusception)入細(xì)胞壁的伸展蛋白前體之間以異二酪氨酸為聯(lián)鍵形成伸展蛋白網(wǎng)；l經(jīng)向的纖維素網(wǎng)和緯向的伸展蛋白網(wǎng)相互交織；l結(jié)合在纖維素上的木葡聚糖和以離子鍵結(jié)合在伸展蛋白上的果膠象閂塞(latch)一樣可以可逆地松弛或固定兩網(wǎng)的聯(lián)結(jié)。ltolbott及ray提出了初生細(xì)胞壁的“千層餅”模型。他們認(rèn)為細(xì)胞壁各類組分之間存在大量非共價鍵，只有很少的共價鍵。細(xì)胞壁是由各種組分(果膠多糖、伸展蛋白、木葡聚糖、纖維素等)一層一層地重復(fù)堆積而形成的，形狀極似千層餅。l機(jī)械損傷、真菌感染、植物抗毒素誘導(dǎo)劑處理、甚至熱處理都能引起細(xì)胞壁中的伸展蛋白反應(yīng)。l在把胡

10、蘿卜切成片這樣的機(jī)械損傷后，細(xì)胞壁中就積累了hrgp，并且hrgp的mrna含量也增加l損傷后的番茄莖也積累hrgp和hrgp的mrna。植物被感染hrgp的增加與抗病性相關(guān)。lesquerre-tugaye和lamport發(fā)現(xiàn)引起炭疽病的瓜類炭疽刺盤孢菌(colletotrichum lagenarium)感染黃瓜植株后，后者細(xì)胞壁中的hrgp增加約10倍。lhammer-schmidt等則發(fā)現(xiàn)當(dāng)真菌瓜瘡痂芽枝霉(cladosporium cucumerinum)感染抗性品種和敏感品種的黃瓜植株時，抗性品種細(xì)胞壁中羥脯氨酸含量增加比敏感品種的更迅速。l細(xì)胞壁hrgp是一類熱休克(heat s

11、hcok)蛋白。lstemer和hammerschmidt發(fā)現(xiàn)黃瓜植株被熱處理后，其細(xì)胞壁的羥脯氨酸含量增加。同時，這種經(jīng)過熱休克的植株對真菌感染的抗性增強(qiáng)。lzimmerman等則發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱休克的胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞中hrgp的mrna含量增加。l大豆種皮中羥脯氨酸的含量可能與種子發(fā)育有一定關(guān)系。l生長素誘導(dǎo)的伸長生長與伸展蛋白的合成、積累、轉(zhuǎn)運之間也可能有某種聯(lián)系。l光敏色素調(diào)控細(xì)胞壁中羥脯氨酸的含量又使人認(rèn)為伸展蛋白可能與光形態(tài)建成有關(guān)。l伸展蛋白可能是將多糖從細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)郊?xì)胞壁的載體。 lcondit和meagher在“nature” 上報道從矮牽?；蛭膸熘蟹蛛x了grp基因，該基因編碼的多

12、肽grp由384個氨基酸殘基組成，其中67%的殘基為甘氨酸。和基因克隆pdc5a1編碼的伸展蛋白一樣，grp編碼的多肽也包括一個信號肽。該信號肽含27個氨基酸殘基，在rgp的運輸及翻譯后加工中起作用。grp的一級結(jié)構(gòu)可以用(gly-x)n表示。其中x既可以是甘氨酸，也可以是其他氨基酸。grp的構(gòu)象為8段反向平等的折迭片。l在同一期“nature”上，研究細(xì)胞壁蛋白的權(quán)威專家、美國華盛頓大學(xué)的joseph e.varner教授認(rèn)為grp是一種新的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白。其原因如下：l甘氨酸在多種植物細(xì)胞壁中普遍存在并且含量豐富。如大豆(glycine max)和無花果葉瓜(cucurbita ficif

13、olia)的種皮細(xì)胞壁都含21%甘氨酸，燕麥(avena sativa)胚芽鞘細(xì)胞壁含27%的甘氨酸，希臘杠柳(periploca graeca)莖的細(xì)胞壁含31%甘氨酸，而西葫蘆(cucurbita pepo)種皮含甘氨酸高達(dá)47%。l萊因衣藻(chlamydomonas reinhardi)細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)糖蛋白含23%的甘氨酸。噬熱菌(thermomicrobium roseum)細(xì)胞壁中一種主要的蛋白質(zhì)有34%的甘氨酸。這些事實表明富含甘氨酸的蛋白質(zhì)在細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中起重要作用。lgrp的結(jié)構(gòu)特征與動物的結(jié)構(gòu)蛋白膠原(xprogly)n和家蠶繭絲蛋白(xgly)n的結(jié)構(gòu)特征類似，也具有某

14、些多次重復(fù)出現(xiàn)的短肽段。lgrp被普遍認(rèn)為是一種細(xì)胞壁蛋白。 l富含蘇氨酸和羥脯氨酸與富含組氨酸和羥脯氨酸的細(xì)胞壁糖蛋白l(threonine and hydroxyproline-rich glycoprotein,thrgp. histidine and hydroxy proline-rich glycoprotein, hhrgp)l首次發(fā)現(xiàn)并一直研究伸展蛋白的lamport研究組在1987年從懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞中分離純化到 一 種 富 含 蘇 氨 酸 和 羥 脯 氨 酸 的 糖 蛋 白(thrgp)。一年后又分離到一種富含組氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白(hhrgp)。l他們的新發(fā)現(xiàn)使得單子

15、葉植物(特別是禾本科植物)細(xì)胞壁中經(jīng)典的伸展蛋白含量很低的現(xiàn)象有了合理的解釋。 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的含糖量細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的含糖量( (w/w)w/w) 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白蛋白含量蛋白含量(%)糖含量糖含量(%)hrgpthrgphhrgp607058403042 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白中糖的組成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白中糖的組成(%(%，w/w)w/w) 結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白阿拉伯糖阿拉伯糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖thrgphhrgphrgp100639003767002l首先，用鹽溶液洗脫完整的懸浮細(xì)胞來獲得蛋白質(zhì)的方法決定了thrgp和hhrgp位于細(xì)胞壁中。l其次，除了富含蘇氨酸或組氨酸以外，thrgp和hhrgp

16、的氨基酸組成與經(jīng)典的伸展蛋白的類似。此外，它們不僅都是糖蛋白，而且糖的組成及 含量和伸展蛋白的也有相似之處。并發(fā)現(xiàn)桿狀的分子外形與雙子葉植物伸展蛋白的外形相同；用番茄伸展蛋白p1免疫白兔產(chǎn)生的抗體能與thrgp和hhrgp發(fā)生較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。l最后，thrgp和hhrgp經(jīng)酶解后的肽譜分析結(jié)果表明，這兩種糖蛋白的氨基酸序列和番茄伸展蛋白的氨基酸序列類似，也具有較多的重復(fù)肽段。l根據(jù)上述各方面的研究結(jié)果，lamport等認(rèn)為thrgp和hhrgp是禾本科單子葉植物細(xì)胞壁中的伸展蛋白。 l阿拉伯半乳聚糖蛋白是一類糖蛋白。它們存在于植物的根、莖、葉、花、種子及培養(yǎng)的愈傷組織之中。在進(jìn)化程度較低的植物

17、，例如苔蘚中也發(fā)現(xiàn)存在agp。lagp干重的90%左右是碳水化合物。從阿拉伯半乳聚糖蛋白這一名稱可以看出，agp中的糖類主要是阿拉伯糖和半乳糖。除此以外，還存在少量的甘露糖、木糖、葡萄糖、巖藻糖以及葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。各種agp的分子量變化很大。這主要是由于它們糖基化的程度不同而造成的。 lagp的生物合成與細(xì)胞壁中hrgp的生物合成類似。編碼agp的mrna在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上被翻譯成蛋白質(zhì)。新合成的agp中的脯氨酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被羥基化為羥脯氨酸，然后，蛋白質(zhì)再在高爾基體中被糖基化，最終形成糖蛋白。lagp是胞外基質(zhì)中的糖蛋白，所以它們既可能作為細(xì)胞間的潤滑劑(lubricant)，也可以是樹膠

18、的主要成分，還可能在細(xì)胞的相互識別中起重要作用。l富硫蛋白是一類低分子量蛋白，僅含有不到50個氨基酸殘基。早在1885年，jago等人就曾指出小麥面粉中存在一種使啤酒酵母致命的有毒物質(zhì)。1942年，balls等人將這種有毒成分分離出來，發(fā)現(xiàn)是一種低分子量的多肽，并稱之為purothionin。l此后，在大麥、燕麥、黑麥、玉米以及某些雙子葉植物中也發(fā)現(xiàn)了這類多肽。因為這些多肽都有較多的含硫氨基酸，而且它們的許多性質(zhì)又相互關(guān)聯(lián)，故把它們統(tǒng)稱為富硫蛋白。l1987年，h.bahlmann和k.apel在大麥葉中發(fā)現(xiàn)了富硫蛋白。它們存在于大麥葉片的細(xì)胞壁和液泡之中。l在黃化大麥葉中，所有細(xì)胞壁內(nèi)雖然均

19、可檢測出富硫蛋白，但是，表皮細(xì)胞層的外壁中富硫蛋白的濃度卻要高得多。l富硫蛋白大多數(shù)表現(xiàn)出對于細(xì)菌、真菌和高等生物的毒性。種子中的富硫蛋白，除了作為貯存蛋白外，它們也可能作為防御毒素，保護(hù)種子免遭細(xì)菌或真菌的侵染。l大麥幼苗在其生長早期處于大量的土壤微生物環(huán)境之中。這些微生物隨時都可侵染大麥幼苗。因此，黃化苗合成大量富硫蛋白以作為防御手段。一旦幼苗出土并暴露在陽光下和空氣中時，直接與它們接觸的病原微生物也相應(yīng)減少，所以葉片內(nèi)富硫蛋白的mrna濃度也就大大降低了。 l正常生長的植物接種白粉菌(erusyphe graminis)后，又能夠迅速合成富硫蛋白的mrna。由此看來，富硫蛋白很可能參與了

20、植物的防御體系。l albersheim等發(fā)現(xiàn)一些初生壁的寡糖片段能誘導(dǎo)植物抗毒素(phytoalexin)的形成，此外，它們還對其它生理過程有調(diào)節(jié)作用，便將這種具有調(diào)節(jié)活性的寡糖片斷稱為寡糖素(oligosaccharin)。 l細(xì)胞壁主要成分是90%左右的復(fù)雜多糖和10%的糖蛋白。多糖又可分為三大類：纖維素，半纖維素和果膠類。l在初生細(xì)胞壁中約20%30%是纖維素，它是1，4連接的d葡萄糖的聚合物，半纖維素中常見的是木葡聚糖和木聚糖，前者在雙子葉植物中較多，而后者主要在單子葉植物中，兩者結(jié)構(gòu)完全不同。木葡聚糖的主鏈也是1，4連接的葡萄糖，但約3/4的葡萄糖的c6上接有木糖，有些木糖上還接有

21、半乳糖和l巖藻糖。木聚糖主鏈?zhǔn)?，4連接的木糖，在部分木糖c3上還可掛有單個l阿拉伯糖。有的側(cè)鏈較長，在l阿拉伯糖基上再接有半乳糖，木糖或半乳糖基木糖。一些木糖的c2上也可接上葡萄糖醛酸或阿拉伯糖。l果膠類多糖的特征是含有較豐富的半乳糖醛酸或其他酸性單糖。最常見的是多聚半乳糖醛酸。它們是半乳糖醛酸通過1，4連接的同多糖。這種多聚半乳糖醛酸中的羧基仍然可以形成酯類，柑桔皮中的果膠就屬于這種結(jié)構(gòu)。另外還有兩類果膠多糖，鼠李半乳糖醛酸聚糖i和鼠李半乳糖醛酸聚糖ii。前者的結(jié)構(gòu)比后者簡單。假挪威槭(acer psuedoplatanus)的鼠李半乳糖醛酸聚糖i的聚合度2000，骨架中約有l(wèi)鼠李糖和半乳

22、糖醛酸各300個。兩者交替以1，2和1，4連接方式存在，約有一半的l鼠李糖的c4上有側(cè)鏈，其組成有半乳糖、l阿拉伯糖以及少量的l巖藻糖，這些分支糖鏈的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。l還有一些其他的聚糖，如阿拉伯聚糖，半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖等。l以前只認(rèn)為這些多糖合在一起構(gòu)成極為牢固的細(xì)胞壁的骨架，猶如鋼筋水泥結(jié)構(gòu)。其中纖維素相當(dāng)于鋼筋，半纖維素和果膠類物質(zhì)則分別起到橋架在鋼筋間的鐵絲和水泥的作用。structural model of a cellulose microfibrill植物抗毒素的合成是植物的一種抗病機(jī)制，已表明同型多聚半乳糖醛酸片段能誘發(fā)組織合成植物抗毒素。誘發(fā)物(elicitor)包括真菌

23、細(xì)胞壁中的專一性寡聚葡萄糖苷和植物細(xì)胞壁中的同型多聚半乳糖醛酸。誘發(fā)物能改變受體細(xì)胞的代謝及與抗毒素合成有關(guān)的mrna和酶的從頭合成。l用酸水解從真菌大雄疫霉(phytopathora megasperma)菌絲細(xì)胞壁得到幾百種七聚葡糖，從中只分離出一種具誘發(fā)物活性的寡糖，可見作為誘發(fā)物必須具有很專一的結(jié)構(gòu)。l機(jī)械損傷誘導(dǎo)植物形成一系列的蛋白質(zhì)類的抑制劑，它們能夠抑制昆蟲和微生物的蛋白水解酶，并使得昆蟲和微生物難于消化植物材料，從而起到保護(hù)的作用。l在一些植物中發(fā)現(xiàn)了能誘導(dǎo)遠(yuǎn)離損傷部位的組織合成蛋白酶抑制劑的信號，即蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)因子(piif)。從蕃茄葉片中抽提的piif主要由-4-連接的

24、半乳糖醛酸殘基組成。l某些傷害細(xì)胞的非生物因素引起植物累積植物抗毒素，例如適度的凍融、紫 外線照射等，它們可能通過活化細(xì)胞中的酶，從胞壁中釋放內(nèi)源誘發(fā)物，從而誘發(fā)抗毒素的累積。l寡糖片段可能與植物病理中的過敏死亡現(xiàn)象有關(guān)。l懸浮培養(yǎng)的假挪威槭和玉米細(xì)胞初生壁經(jīng)部分酸水解分離得出一些活性片段，它們抑制蛋白質(zhì)的合成。入侵的病原菌分泌的酶可能從植物細(xì)胞壁解離下毒性片段引起細(xì)胞的過敏死亡，使得病原物不能進(jìn)一步散。l稻瘟病菌能分泌一種酶，本身能引起植物細(xì)胞死亡，此酶的作用機(jī)制可能是從細(xì)胞壁中釋放寡糖素引起細(xì)胞的死亡。l木葡聚糖的寡糖片段抑制2，4d誘導(dǎo)的豌豆上胚軸生長。此片段是假挪威槭細(xì)胞外多糖經(jīng)內(nèi)切1，4葡萄糖苷酶處理后制得的。l寡糖產(chǎn)物經(jīng)分離得到已知結(jié)構(gòu)的七糖和九糖。九糖有抑制活力，而七糖沒有。九糖的抑制活性表現(xiàn)出明顯的最適濃度曲線，排除了它對豌豆組織具毒性的可能性，抑制生長的九糖濃度只需能促進(jìn)最大伸長生長的2，4d濃度的1%。 l植物的成花是由許多環(huán)境因素控制的復(fù)雜過程。植物中可能有促進(jìn)成花和抑制成