單克隆抗體的制備

1、第十一章 單克隆抗體的制備1975年Khler和Milstein首先報道用細胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,建立起第一個B細胞雜交瘤細胞株,并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monlclonalantibody,McAb）。迄今世界已研制成數(shù)以千計的McAb。單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，McAb在診斷疾病、判斷預(yù)后、防治疾病以及疾病機制研究等方面起著巨大的促進作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理

2、雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細胞作小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長（選擇原理后見），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列幾個主要步驟闡明。（一）細胞的選擇與融合建立雜交瘤技術(shù)的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的碑細胞。脾是B細胞聚集的重要場所，無論

3、以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞融合伴侶。目前常用的B細胞瘤株有：P3-X63-Ag8(KhlerandMilstein，1975)，P3-NSI/1-Ag4-1(KhlerandMilstein，1976)，X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等，這些細胞株皆為HAT敏感細胞株。使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞

4、易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（PEG10002000）是目前最常用的細胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40（W/V）。（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅57天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。細胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸

5、，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT細胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖（圖

6、11-1）。圖11-1細胞融合與HAT選擇示意圖（三）有限稀釋與抗原特異性選擇在動物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實質(zhì)是眾多B細胞群的抗體分泌。而針對目標(biāo)抗原表位的B細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中，有相當(dāng)比例的無關(guān)細胞的融合體，需細篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行：一是融合細胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間（30的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞

7、；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)撰寫劉雪松1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的

8、一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。細胞融合前準(zhǔn)備細胞融合，選擇雜交瘤抗體的檢測雜交瘤的克隆化和凍存單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的鑒定影響因素、失敗原因分析一、細胞融合前準(zhǔn)備(一)免疫方案選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。1.顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1×100.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)23周后第二次免疫1×100.5ml ip3周后加強免疫(融合

9、前三天)1×100.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 Ag150g加福氏完全佐劑皮下多點注射(一般0.81ml0.2ml點)3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip(ip劑量不宜超過0.5ml)3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip (57天后采血測其效價，檢測免疫效果)23周后加強免疫，劑量50500g為

10、宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，促進免疫細胞對抗原反應(yīng)性。(二)飼養(yǎng)細胞在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐

11、長期保存，隨用隨復(fù)蘇。小鼠腹腔巨噬細胞的制備小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周齡拉頸處死浸泡于75酒精，消毒35分鐘用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入68ml培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)分離心56分鐘用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)1×10ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培養(yǎng)一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得58×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5×106ml，小鼠脾細胞為1×106ml，小鼠的成纖維細胞(

12、3T3)1×105ml，均為100l孔。(三)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1020，細胞的最大密度不得超10ml，一般擴大培養(yǎng)以110稀釋傳代，每35天傳代一次。細胞的倍增時間為1620小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的

13、敏感性，每36月應(yīng)用8AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95，也是決定細胞融合的關(guān)鍵。(四)免疫脾細胞免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細胞數(shù)為×10左右。二、細胞融合，選擇雜交瘤(一)細胞融合流程(1)取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP2

14、0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(2)同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(3)將骨髓瘤細胞與脾細胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。(5)輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。(6)在室溫下融合:30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，邊加邊攪拌。作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔分鐘分別加

15、入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)離心，800rpm，6分鐘。(8)棄上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。(10) 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng)。一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。(二)HAT選擇雜交瘤應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和

16、HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200l孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補加的量可用全量的23進行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。50×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4M一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底110面積時，即可開始檢

17、測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等McAb的檢測。2.RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。3.FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。4.IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程?？煽康暮Y選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個篩選時機。四、雜交瘤的克隆化和凍存克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選

18、后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關(guān)抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。1.

19、有限稀釋法的程序制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)細胞數(shù)在15×10ml取130個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞ml，100l孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個ml，100l孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個ml，100l孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200l孔。第89天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。注:初次克隆化的雜交

20、瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。2.軟瓊脂法軟瓊脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI16401瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5瓊脂：由1份1瓊脂加1份含20小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。用上述0.5瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。按100ml，500ml或5000ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。1ml 0.5瓊脂液(42預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合?；靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。45天后即可見針尖大小白色克隆，

21、710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再克隆化。(二)雜交瘤細胞的凍存及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。細胞凍存液:50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10DMSO(

22、二甲亞砜)凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0，再降溫時一般按每分鐘降溫23，待降至-70可放入液氮中?；蚣毎芙抵? 后放-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復(fù)蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。2.體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。實體瘤法對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按13×107ml接種

23、于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共24點。待腫瘤達到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)

24、蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。2.McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進行篩選時，已

25、經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG(3)，將有利于沉淀線的形成。3.McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。4.McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。5.McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、影響