分子診斷知識點

1、名師總結精品學問點1、基因（ gene） 是含有生物信息的dna功能片段，依據(jù)這些生物信息可以編碼具有生物功能的產(chǎn)物，包括rna和蛋白質(zhì)（多數(shù)）.2、 基因組genome, 指細胞或生物體一套完整的遺傳物質(zhì)，包括全部基因和基因間的區(qū)域（序列）；3、基因組學genomics 以基因組為討論對象的一門學科，包括基因組作圖、 基因組測序、基因定位、基因功能分析4、結構基因：編碼rna或蛋白質(zhì)的核苷酸序列5、基因表達：dna攜帶遺傳信息通過轉錄傳遞給rna ， mrna通過翻譯將基因的遺傳 信 息在細胞內(nèi)合成具有生物功能的各種蛋白質(zhì)的過程6、c 值 基因組dna全部堿基（對）數(shù)；c值是物種的一個重要特

2、性常數(shù)；c 值沖突，c 值悖論：生物體的進化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象7、n值沖突， n值悖論：基因組中的基因數(shù)目與生物進化程度或復雜程度的不對稱性8、必需基因（致死基因）關系到生物體存活的基因；可通過基因突變試驗確定必需基因；：9、原核生物基因組1、細菌、支原體、立克次體、衣原體、螺旋體、放線菌、藍綠藻等10、重疊基因 : 是指兩個或兩個以上的基因共有一段dna序列，或是指一段dna序列為兩 個或兩個以上基因的組成部分；11、操縱子：由一組功能相關的結構基因連同其上游調(diào)控序列共同組成一個轉錄單位12、質(zhì)粒的分類致育質(zhì)粒f 質(zhì)粒）編碼性菌毛，介導細菌之間的接合傳遞；耐藥性質(zhì)粒r 質(zhì)

3、粒） 編碼細菌對抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性； 毒力質(zhì)粒 vi 質(zhì)粒）編碼與該菌致病性有關的毒力因子； 細菌素養(yǎng)粒 編碼細菌產(chǎn)生細菌素； 代謝質(zhì)粒 編碼產(chǎn)生相關的代謝酶；13、 嚴緊掌握型拷貝數(shù)少，一般<10 個，分子量大；調(diào)劑因子是蛋白質(zhì)，復制受限，受 染色體dna復制系統(tǒng)的掌握；嚴謹掌握機理（低拷貝緣由），認為是該質(zhì)?？梢援a(chǎn)生 阻遏蛋白，反饋抑制自身dna合成；放松掌握型拷貝數(shù)多， 10-200 個，分子量??；調(diào)劑因子是rna ，復制不受染色體dna復制系統(tǒng)限制基因工程使用放松型 （高拷貝數(shù)）質(zhì)粒，以獲得較多的基因產(chǎn)物；14、質(zhì)粒性質(zhì)1、質(zhì)粒的轉移： 可以通過轉化、 轉導或接合作用而

4、由一個細菌細胞轉移到另 一個細菌細胞中，使兩個細胞都成為帶有質(zhì)粒的細胞；質(zhì)粒轉移時，它可以單獨轉移，也可 以攜帶著染色體（片段）一起進行轉移，所以它可成為基因工程的載體；2、質(zhì)粒具有挑選性標記：質(zhì)粒有抗藥性基因、養(yǎng)分缺陷型基因、抗重金屬鹽基因等多種挑選性標記3、質(zhì)粒的不相容性：質(zhì)粒已成為分子克隆的有用工具，是目的dna的載體；載體質(zhì)粒大多是在天然質(zhì)粒基礎上經(jīng)人工構建而成，15、質(zhì)粒特點：1、有限制性核酸內(nèi)切酶單一切口，可用以重組外源dna ； 2、有挑選標記，如抗藥基因等；3、插入外源dna后，仍能轉化宿主細胞，并能復制；16、質(zhì)?；蜣D移的方式1.接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸

5、時，質(zhì)粒dn從一個細胞 （細菌） 轉移至另一細胞 （細菌） 的 dna轉移稱為接合作用2.轉化作用通過自動獵取或人為地供應外源dna ，使細胞或培育的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用3、轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（受體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的dna轉移及基因重組即為轉導作用4、轉染作用 通過感染方式將外來dna引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀轉變的過程稱為轉染transfection；轉染是轉化的一種特殊形式；名師總結精品學問點17、完整的病毒顆粒包括：衣殼、基因組（ dna或 rna ） 、被膜、病毒顆粒中的其他內(nèi) 容物18、病毒分段

6、基因組： 流感病毒屬分段 rna 病毒：意義： a）降低包裝壓力 b）降低了造 成斷裂的可能性，提高編碼才能 c 有分段基因組的病毒一般感染效率較低，只有全部基 因組核酸片段存在時， 病毒才具有感染才能； 植物病毒 d 由于分段基因組易發(fā)生重組， 故 病毒簡單變異； 19、病毒基因組特點： 1、有特殊的末端序列：粘性末段、反向互補序列、長末端重復序列、帽和尾結構等；2、 結構緊密，表達在不僅非編碼序列少，而且有重疊基因的存在；真核生物20、染色體的包裝：（ 1）染色體的一級結構核小體（2）染色體的二級結構螺線管3） 染色體的三級結構超螺線管（4）染色體的四級結構染色單體21、真核生物染色體基因

7、組一般特點1、真核生物的基因組比較巨大；2、線性雙鏈dna和二倍體； 3、真核細胞基因轉錄產(chǎn)物為單順反子；4、 存在重復序列，重復次數(shù)可達百萬次 以 上 5、基因是不連續(xù)的（斷裂基因）22、單順反子：一個結構基因經(jīng)過轉錄生成一個mrna分子，再翻譯生成一種蛋白質(zhì)；23、重復序列：指多拷貝的相同或近似序列的dna片段高度重復序列：按其結構特點分為三種： 1、反向重復序列2、衛(wèi)星dna由于這類序列的堿基組成不同于其他部份， 可用等密度梯度離心法將其與主體dna分開，因而稱為衛(wèi)星dna（或隨體dna ） 3、較復雜的重復單位組成的重復次序中度重復次序：依據(jù)重復次序的長度，中度重復次序可分為：短散布元

8、件和長散布元件alu家族是哺乳動物基因組中含量最豐富的一種中度重復 次序家族（短分散元件）， alu家族每個成員的長度約 300bp ，每個單位長度中有一個 限制性內(nèi)切酶 alu 的 切點（ ag ct） ， alu可將其切成長130 和 170bp 的兩段，因而定名為alu序列（或alu家族）24、斷裂基因（splitgene） ：真核生物的結構基因，由如干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)相間隔但又 連續(xù)鑲嵌而成， 為一連續(xù)的氨基酸組成的完整的蛋白質(zhì)編碼，或為具有特殊功能的trna 或 rrna編碼， 因此稱為斷裂基因；并非真核生物全部的結構基因均為splitting gene例：組 蛋白基因家族、干擾素

9、、酵母中多數(shù)基因25、線粒體dna的遺傳特性： 母系遺傳、突變率高、異質(zhì)性、閾值效應、半自助復制與 協(xié)同效應26、閾值效應： mtdna突變導致氧化磷酸化水平降低，當突變的mtdna達到肯定比例時，使得線粒體總的能量供應降低到維護組織正常功能所需能量的最低值時，才可能引起某組織 或器官的功能反常而顯現(xiàn)臨床癥狀；27、dna分子多態(tài)性的主要方式：微衛(wèi)星dna多態(tài)性（同一位點不同個體之間有不同長度的微衛(wèi)星dna ） 、單個核苷酸的變異單核苷酸多態(tài)性（snp）等28、str 結構：微衛(wèi)星dna又稱短串聯(lián)重復str，指以1 6 個堿基為核心單位串聯(lián)重 復而成的一類序列；微衛(wèi)星dna結構序列由中間的核心

10、區(qū)（重復序列） 和外圍的側翼區(qū)（非重復序列）組成，其核心序列為1 6bp，為高度重復序列；成因： 1.姊妹染色單體的不均等交換2.復制滑移29、 snp： snp 是基因組中散在的單個核苷酸的變異形成的一種 dna 分子多態(tài)性 位置： 編 碼區(qū) snp csnp） 、基因周邊區(qū) snp psnp ） 基因間 snp isnp ） snp 非編 、 碼區(qū) ： snp 編碼區(qū) = 5 ：1 成因：單個核苷酸（堿基）置換： 轉換 ：嘧啶嘧啶， 嘌 呤嘌呤；顛換：嘧啶嘌呤 ,嘌呤嘧啶轉換：顛換 =3：1；蛋白質(zhì)組1、蛋白質(zhì)組：生物體的全套蛋白質(zhì)；或一個生命單位的全套蛋白質(zhì)名師總結精品學問點2、蛋白質(zhì)組

11、特性： 與基因組相比， 蛋白質(zhì)組有高度動態(tài)性：有組織特異性、 生長發(fā)育特異性、生理病理狀態(tài)特異性；3、討論的必要性：1、蛋白質(zhì)的數(shù)量比基因的數(shù)量多（轉錄、翻譯、翻譯后水平的調(diào)控）2、基因組是靜態(tài)的，蛋白質(zhì)組是動態(tài)的3、蛋白質(zhì)之間及其與其它各種大、小分子之間的廣泛 作用形成的如同網(wǎng)絡狀的復雜系統(tǒng)；4、蛋白質(zhì)組學是討論生物體全套蛋白質(zhì)的組成、結構與功能的科學5、蛋白質(zhì)的分別：雙向凝膠電泳及圖像分析技術1、雙向凝膠電泳2-de ：第一向的固相ph 梯度等電聚焦電泳ipg-ief其次向sds-page組成的分別系統(tǒng)： 電泳速度只與蛋白質(zhì) 分子質(zhì)量有關；原理：等電聚焦電泳:基于蛋白質(zhì)等電點（pi ）的差

12、異進行分別；聚丙烯酰 胺凝膠電泳 :是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量（mw ）的不同進行分別6、質(zhì)譜技術ms ： （用于蛋白質(zhì)的鑒定）是在高真空系統(tǒng)中樣品分子離子化后，依據(jù)不同離 子間質(zhì)荷比差異，以確定樣品相對分子質(zhì)量及分子結構的技術；7、質(zhì)譜：化合物分子受到電子流沖擊后， 形成的帶正電荷分子離子及碎片離子， 依據(jù)其質(zhì) 荷比大小依次排列而被記錄下來的圖譜， 稱為質(zhì)譜； 8、質(zhì)譜儀的組成： 離子源、 質(zhì)量分析器、檢測器核酸分子雜交1、核酸變性：在理化因素作用下，維系dna二級結構的氫鍵和堿基積累力遭到破壞，dna雙螺旋的兩條互補鏈松散而分開成為單鏈，從而導致dna的理化性質(zhì)及生物學性質(zhì)發(fā)生改變2、核酸復性：變

13、性的單鏈核酸分子在肯定條件下按堿基互補原就重新結合為雙鏈核酸的過程，稱復性或雜交；3、分子雜交： 不同來源的核酸變性后，合并在一起， 只要這些核酸分子含有可以形成堿基互補配對的序列，復性也會發(fā)生在不同來源的核酸鏈之間，形成雜化雙鏈4、分子雜交技術： 用標記的已知dna或 rna片段（探針） 來檢測樣品中未知核酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原就發(fā)生異源性結合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結合核酸序列的 位置或大小顯示出來的技術；待測的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組dna和組織細胞的 dna 、 rna ；5、核酸探針： 指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方

14、法檢測的、帶 有標記的、并已知堿基序列的核酸片段；6、原位雜交：以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其檢測的方法7、寡核苷酸探針的特點及設計原就？特點 : （1）依據(jù)需要來合成相應的核酸序列， 防止 了自然探針的缺點； （ 2）大多數(shù)寡核苷酸探針長度較短 ,一般為 1050bp,其序列復雜度低， 所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短； （3）寡核苷酸探針特殊適合點突變的檢測短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的tm值； （ 4）探針的長度較短，特異性 較 低，雜交信號較弱；設計原就: （ 1）探針長度：一般要求在10 50bp; （2） gc含量為4

15、0 60 ; （ 3）探針分子中應防止互補序列; （ 4）防止同一堿基連續(xù)顯現(xiàn)，一般 不能多于 4 個;（5）探針與非靶基因序列的同源性不能超過70或 8 個以上連續(xù)的堿基同源；8、一個抱負的探針標記物應具備的特性？1、靈敏度高2、標記物與探針結合后，應不影響 雜交反應，特殊是雜交特異性、穩(wěn)固性和tm值 3、標記物對檢測方法無干擾4、檢測方法 要靈敏、特異、穩(wěn)固、簡便5、標記物對環(huán)境污染小，對人體無損耗，價格低廉；9、southern 印跡雜交的基本步驟？其毛細管轉膜的原理？southern 印跡指將電泳分別的名師總結精品學問點dna片段轉移到肯定的固相支持物上的過程；基本步驟：1、基因組dn

16、a經(jīng)限制酶消化后 進行瓊脂糖凝膠電泳2、將含有dna片段的凝膠放入變性溶液使dna變性3、將固體支持物放在凝膠上，通過毛細管虹吸或電轉移將腳上的dna片段轉移到固體支持物 上，轉移過程中，各dna片段間的相對位置保持不變，然后通過加熱使dna固定于膜上 4、加入探針使之與膜上的dna雜交5、沖洗掉為雜交的探針，檢測雜交信號 10、 毛細管虹吸印跡法其基本原理是：容器中的轉移緩沖液含有高濃度的nacl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的dna片段垂直向上運動，凝膠中的dna片段移出凝膠而滯留在膜上11、原位雜交時組織和細胞應固定

17、處理，抱負固定液應具備哪些條件？1、保持組織細胞的形狀 2、對核酸無抽提， 修飾與降解作用3、不轉變核酸在組織細胞內(nèi)的定位4、不阻礙核酸與探針的雜交過程5、對雜交信號無遮擋作用6、理化性質(zhì)穩(wěn)固 12、 如何增強組織的通透性和核酸探針的穿透性？組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結合成核酸蛋 白復合體， 影響探針的穿透和雜交體的形成； 去垢劑和蛋白酶 k 去除核酸表面的蛋白質(zhì)； 控 制消化時間， 防止細胞結構破壞和核酸從載玻片上脫落 分子克隆 （也稱基因克隆或 dna 克?。?：指依據(jù)人的意愿，在體外將制備的 dna 片段與載 體 dna 重組，然后導入受體細胞，并在受體細胞中復制、擴增，以獲得該 dna

18、分子的大 量拷貝的技術；又稱重組 dna 技術1、制備目的基因主要有哪幾種方法？直接分別、人工合成、構建基因組文庫g-文庫、構建 cdna文庫c-文庫 2、載體：是指能在連接酶作用下和外源dna片段連接起來，并運輸?shù)剿拗骷毎M行擴增或表達的運載工具；載體化學本質(zhì)為dna分子； 克隆載體：能將外源基因在受體細胞中復制擴增并產(chǎn)生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體表達載體：能夠攜帶目的dna片段進入宿主細胞擴增和表達，獲得目的dna蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一類dna分子3、轉化（ transformation ） 以質(zhì)粒dna或以它為載體構建的重組子導入受體細胞的過程稱為轉化；轉染（ transfaction ）

19、 是指以噬菌體dna或以它為載體構建的重組子導入受體細胞的過程稱為轉染；感染 infection具有感染力的噬菌體將頭部重組子導入受體細胞的過程稱為感染. 4、重組子：含有重組dna分子的轉化細胞重組體：不同來源的dna通過重組作用所組成的dna分子重組dna: 不同來源的dna通過磷酸二酯鍵連接而重新組合成新 的 dna分子的過程5、g- 文庫 ;將某種生物體的全部基因組dna用限制性內(nèi)切酶或機械力氣切割成肯定長度范疇的dna片段，再與合適的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的全部陽性菌落6、c-文庫 : 將某種生物體基因組轉錄的全部mrna, 經(jīng)反轉錄產(chǎn)生cdna片段 ,再分別與克隆載

20、體重組，儲存于某種受體菌中7、基因組文庫：含有某種生物全部基因隨機片段的重組dna克隆群8 感受態(tài)細胞 :competent cell細胞膜結構轉變、通透性增加并具有攝取外源dna才能的細胞；9、2 型限制酶：能夠識別dna的特異序列 , 并在識別位點或其四周切割雙鏈dna的一類 核酸內(nèi)切酶；命名：限制性核酸內(nèi)切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名其次、三個字母小寫，斜體 代表宿主菌種名第四個字母代表宿主菌的株或型如名師總結精品學問點從一種菌株中發(fā)覺了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即依據(jù)發(fā)覺和分別的先后次序用羅馬字母表示； 識別序列特點： 具有回文結構的dna片段切割方式： 在對稱軸處同時切

21、割dna的兩條鏈、在對稱軸兩側相類似的位置切割兩條鏈末端類型：平末端和3* 或 5* 突出的粘性末 端 10、dna連接酶：是一種封閉dna鏈上切口的酶催化反應的化學本質(zhì)：修復雙鏈dna上切口處的磷酸二酯鍵反應條件： dna連接酶的反應條件tris-hcl50-100mmol/lph7.5mgcl210mmol/latp 0.5-1mmol/ldtt 5mmol/lvolume 10-20l temperature 4-15 time 4-16h 作用：能夠催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈dna分子形成磷酸二酯鍵，實現(xiàn)dna重 組；連接多個平頭雙鏈dna分子11、dna聚合酶：酶類：1、大腸桿

22、菌dna聚合酶2、t4 dna聚合酶3、逆轉錄酶、4 、 taq dna聚合酶5、末端脫氧核苷酸轉移酶6、大腸埃希菌dna聚合酶1klenow大片段、7、t7dna聚合酶 :活性： 1、大腸桿菌dna聚合酶：參加dna修 復 , 具 53 核酸聚合酶活性、3 5和 5 3外切酶活性2 、 t4 dna聚合酶： 有 35的核酸外切酶活性、5 3的 dna聚合酶活性； 3、逆轉錄酶：以單鏈rna 為模板，催化合成cdna單鏈 從 5* 末 端或3* 末端降解dna雜合鏈中的dna以 dna為模板，催化合成cdna雙鏈； 4、taq dna聚合酶：有強的53 dna聚合酶活性、有5 3核酸外切酶活性

23、、無3 5 核酸外切酶活性5、末端脫氧核苷酸轉移酶：標記dna的 3 oh末端；也可催化載體分子或待克隆的dna片段上加上互補的同聚尾，便于進一步連接；活性同37、 6、 5*-3* 聚合酶活性、 3*-5* 外切酶活性 2 6 12、工具酶 作用 限制酶： 識別和切割雙鏈 dna 連接酶 連接兩個 dna 分子 聚合酶dna 聚合、外切 酶 1 聚合外切 taqdna 聚合酶 聚合外切 逆轉錄酶 cdna 合成 末端脫氧核苷酸轉移酶 3* 末端聚合 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 t4 多核苷酸激酶 5* 末端磷酸化 核酸酶 s1 水解單鏈核酸13、載體挑選原理：通過某些特定方法，從被轉化的細胞

24、群體或基因文庫中，鑒別出真正的重組子的過程14 載體特點： 1、獨立復制2、挑選標志3、較多拷貝數(shù)4、多克隆位點5、較高遺傳穩(wěn)固性14、幾種常用載體比較克隆容量受體細胞挑選原理質(zhì)粒載體 2kb大腸桿菌puc系列 藍白斑挑選pbr322雙抗生素挑選噬菌體載體大腸桿菌入噬菌體 22kb藍白斑挑選m13噬菌 體 1kb藍 白斑 挑選粘粒 載體40-50kb大 腸 桿 菌酵母人工染 色體 200-1000kb酵母細胞病毒載體動物細胞15、 pbr322 質(zhì)粒特點： 1、相對分子質(zhì)量好，4.363kb 2 、有一個復制起始點，為放松復制子 3、可用氯霉素擴增其質(zhì)?？截悢?shù)4、有四環(huán)素、氨芐霉素兩個基因5、

25、有24 種限制酶的單一識別點 16、puc:puc18/19質(zhì)粒載體是由pbr322 質(zhì)粒和m13噬菌體重組構建而成的雙鏈dna克 隆載體； puc 是系列質(zhì)粒載體17、 puc 質(zhì)粒結構特點： 1） puc 載體較小，全長僅 2686 bp ；具有更高的拷貝數(shù) 2）只保 留了一個藥物抗性基因 ampr3 ） 大腸桿菌 半乳糖苷酶基因的啟動子及其編碼 - 肽鏈的 dna 序列 lacz 基因； 4）有一個多克隆位點區(qū)，極有利于克隆外源基因；16、分子克隆的基本步驟分：目的基因的獲得（基因文庫、逆轉錄、人工合成、從基因組分別） 、載體的獲得切：限制酶切割目的基因和載體，產(chǎn)生平末端或相同的粘性末端

26、；接：連接酶連接分子間的粘性末端或平末端；轉：重組體導入受體細胞，轉化或轉染；篩：雙抗生名師總結精品學問點18、重組體的挑選方法：1、依據(jù)遺傳表型挑選（抗生素抗性挑選、b- 半乳糖苷酶系統(tǒng)挑選）2、 依據(jù)重組子結構特點挑選（ 1、 快速裂解菌落并鑒定分子大小2、 內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定 3、 核酸分子雜交挑選4、pcr 挑選重組子5、核苷酸序列測定）19、簡述如何挑選puc載體和目的基因形成的重組體：（ 1）2.69kb，保留了pbr322質(zhì)粒的ampr ，轉化菌可在氨芐青霉素培育基中存活；（ 2） lacz 基因編碼 -半乳糖苷酶的一個片段，與宿主細胞編碼的缺陷型 -半乳糖苷酶互補成為完整的酶，

27、催化指示劑底物x-gal形成藍色產(chǎn)物，菌落呈藍色；（ 3）lacz 基因中有mcs外源基因插入，使 lacz 基因插入失活，不能表達a-片段，不能與宿主細胞互補，x-gal不能轉變?yōu)樗{色，表現(xiàn)白色菌落；19、連接dna片段的方法主要有哪些？粘端連接、平端連接、定向連接、同聚物加尾連接、人工接頭連接20、重組體dna導入受體細胞的方法主要有哪些？1、cacl2轉化法2、電穿孔法3、 磷酸 鈣共沉淀法4、 噬菌體的轉染5、脂質(zhì)體法6、顯微注射法核酸分別與純化：1、鑒定完整性： 以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果可用于判定核酸完整性1、完整無降解或降解很少的總rna電泳圖，除具特點性三條帶外，三

28、條帶的熒光強度應為一特定比值2、降解系數(shù)大的核酸條帶相對分子質(zhì)量大，電泳遷移率低， 溴化乙錠嵌入核酸中的數(shù)量也增多，熒光強度高；反之3、一般28s 或 23srna的熒光強度約為18s 或16s 的2 倍，否就提示有rna降解，如在加樣槽鄰近有條帶，就 dna有污染2、真核生物rna18s 、 28s 原核： 23s、16s 3、mrna代表基因轉錄水平，行使模版功能4、核酸純度鑒定：1、紫外分光光度法：最常用a ：核酸在260nm 處有最大吸取峰b ：蛋白質(zhì)在280nm處c：鹽和小分子在230nmd: 酚在270nm處 5、純dna a260/a280=1.8 a260/a280=2.0高質(zhì)

29、量rna （ 1.8-2.1 ） a230/a260=0.4-0.5如上升，有殘余鹽2、熒光光度法pcr 1、pcr 聚合酶鏈反應技術的原理：由人為供應模板dna 、dna引物、4 種 dntp和 dna聚合酶，在體外條件下實現(xiàn)dna復制的過程； 2、pcr 用途：目的基因克隆、基因體外突變、dna和 rna的微量分析、dna序列測定、基因突變分析3、 pcr 三個基本步驟：變性退火延長變性：93-98 攝氏度退火：37-65攝 延長：70-75 攝,，整個pcr 過程一般需進行三十輪的循環(huán),4、退火溫度由引物的tm值打算，延長溫度和時間由taqdna酶活性打算一般變性溫度與 時間為94 30

30、 50s 產(chǎn)物由引物打算，循環(huán)次數(shù)由初始模版濃度打算5、變性：在第一輪循環(huán)前需預變性，在 94下變性5-10min特別重要， 它可使模板dna完全解鏈；退火：引物退火的溫度的高低和所需時間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度實際使用的退火溫度比擴增引物的tm值約低5退火溫度越高 , 所得產(chǎn)物的特異性越高延長：反應通常為72 ,接近于taq dna聚合酶的最適反應溫度75 6、tm值： dna熱變性發(fā)生在一個很窄的溫度范疇內(nèi)，將dna變性達到50%時的溫度稱 解鏈溫度或溶解溫度；gc 越高， tm 值越高7、標準的pcr 反應體系模板dna 0.1 2 ug

31、 引物各 0.1 1.0 umol/l 4種 dntp 混合物 各 200 umol/l taq dna聚合酶2.5u mg2+ 1.5-2.0 mmol/l8、產(chǎn)物不同：1、長片段產(chǎn)物以算術倍數(shù)增加在終產(chǎn)物中忽視不計2、短：長度嚴格定格在兩引物5* 端之間，是需要擴增的特異片段以指數(shù)倍數(shù)增加以上是pcr 產(chǎn)物不名師總結精品學問點需純化的緣由9、產(chǎn)物不同緣由：引物結合的模版不同10、引物：實際上就是兩段與待擴增靶 dna 序列 3 側互補的寡核苷酸片段； 擴增時從引 物的 3端開頭，以 5 3方向延長，兩引物的 5端打算擴增產(chǎn)物的兩個 5末端位置，兩引 物間距離打算擴增片段的長度；11、引物設

32、計的必要條件是與引物互補的靶dna序列必需是已知的12、引物設計有3 條基本原就： 1、引物與模板的序列要緊密互補；2、引物與引物之間避 免形成穩(wěn)固的二聚體或發(fā)夾結構3、引物不能在模板的非目的位點引發(fā)dna聚合反應 即錯配 13、pcr 擴增產(chǎn)物的檢測方法：1.凝膠電泳主要有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳 瓊最常用最經(jīng)典可判定產(chǎn)物大小2、限制性內(nèi)切酶酶切分析rflp 如知道pcr 擴增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，就可挑選合適的限制性內(nèi)切酶消化pcr 產(chǎn)物，再進行電泳分析，依據(jù)pcr 酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，可判定pcr 產(chǎn)物的特異性及是否存在 突 變；用于檢測基因突變3、分子雜交為了確定

33、pcr 產(chǎn)物是否是預先設計的目的片段 或產(chǎn)物是否有突變點雜交、 southern 印跡雜交點雜交靈敏度較高，特殊適用于特異性不 高的pcr 擴增產(chǎn)物分析；用于檢測基因突變,常規(guī)的southern 印跡雜交可鑒定pcr 產(chǎn)物的大小和特異性4、酶檢測pcr 法 首 先對pcr 反應的引物5端進行修飾，一個引物的5端攜帶便于pcr 產(chǎn)物固定的功能基因，如生物素等，另一個引物的5端具有便于酶聯(lián)顯色檢測的基團， 如酶或抗原、 抗體等； 通過包被于微孔板中的基團如親和素， 將 pcr 產(chǎn)物固定于微孔板上，進行酶聯(lián)顯色，比色測定適用于檢測引物5端修飾的pcr 產(chǎn)物比電泳檢測靈敏度高，比分子雜交法簡便；5、測

34、序pcr 產(chǎn)物直接進行測序分析可檢測基因突變是檢測其特異性的最牢靠方法14、rflp限制性內(nèi)切酶酶切分析：由于基因突變導致某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列產(chǎn)生或消逝，經(jīng)電泳分別出大小不同的片段；15、提高pcr 的特異性和敏銳性1.熱啟動pcr：一種在冰上配制pcr 反應液，并將其置于預熱的pcr 儀,通過抑制一種基本成分推遲dna合成，直到pcr 儀達到變性溫度；2、梯 度 pcr： 復性溫度高低打算擴增的特異性產(chǎn)物高低選定一個復性溫度范疇，跨過引物tm 值 10 20；早期循環(huán)，復性時從高溫開頭，逐步降低復性溫度，直至最低復性溫度3、巢式 pcr （ nested pcr）嵌套式pcr：用2

35、 對引物進行2 次 pcr 來 擴增目的基因第一次pcr：一對外側引物其次次pcr：一對內(nèi)側引物4、免疫pcr：酶檢 測 pcr 法 通過免疫酶反應 pcr 來進一步提高敏銳性和特異性 16、多重pcr：它是在同一pcr 反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段 的 pcr 反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般pcr 相同17、不對稱pcr ：目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈dna ；方法：采納兩種不同濃度的引 物；分別稱為限制性引物和非限制性引物,其正確比例一般是0.01 0.5m, 關鍵是限制性引物的肯定量；用途：制備核酸序列測定的模板、制備雜交探針、基因組dna結構功能的研

36、究18、反向pcr：目的：在于擴增一段已知序列旁側未知dna序列19、任意引物pcr： ap-pcr區(qū)分不同種的菌株、種內(nèi)不同血清型、血清型內(nèi)不同亞型；作 用：判定相同種的不同分別株是否有流行病學上的相關性20、 重組 pcr ： 利用 pcr 技術， 使兩個不相鄰的 dna 片段重組在一起的方法， 稱重組 pcr 目的： 使 2 個不同來源的 dna 片段重組； 構建基因突變體如點突變、 缺失、插入等；21、 反轉錄pcr rt-pcr ： rna分子為模板進行的擴增，以 其第一要進行反轉錄產(chǎn)名師總結精品學問點生 cdna ， 然后進行常規(guī)的pcr 反應關鍵步驟是rna反轉錄為cdna ，

37、cdna進行pcr 與一般由 pcr 無差別； 22、熒光定量pcr（fq-pcr ）又稱實時pcrrt-pcr: 非探針類pcr，通過對熒光信號的 檢測實現(xiàn)對pcr 過程中產(chǎn)物量的實時監(jiān)測，并精確地運算出pcr 的初始模板量23、熒光定量pcr 技術在hbv檢測中的應用：hbv感染的早期診斷、監(jiān)測治療成效、判 斷病情，指導制定合理的治療方案、在乙肝病毒耐藥性檢測中的應用、血液制品和鮮血員的挑選， 隱匿性肝炎的發(fā)覺、hbv-dna定量有助于指導懷孕，降低宮內(nèi)感染的發(fā)生率、挑選肝炎的質(zhì)量藥物 24、水解探針 :taqman 探針： pcr 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針；該

38、探針為始終線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸取，pcr 儀檢測不到熒光信號，pcr擴增時（在延長階段）taq 酶的5 3 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團 ， 和淬滅熒光基團分別，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號25、beacon 技術 :即分子燈塔法或分子信標技術：單鏈寡核苷酸熒光探針，在無靶序列的情況下， 探針始終是發(fā)卡結構，報告基團的熒光被猝滅基團猝滅，使熒光檢測儀檢測不到熒光信號； 而在有靶序列時，即在pcr 的退火階段探針與靶序列結合，使熒光報告基團和猝滅 基團分開，這樣熒光儀可以檢測到熒光，熒光信號

39、的強弱代表了靶序列的多少；26、 fret 技術：基本原理是：兩條直線型寡核苷酸探針，其中一條的3 端標記熒光激發(fā) 基團，另一條的5 端標記熒光檢測基團，在無靶序列的情形下，兩條探針分開，無法進行能量的傳遞，這樣熒光儀不能檢測到熒光信號，當有靶序列時，即在pcr 的退火階段兩條探針與靶序列結合，使得兩條探針上的熒光基團可以進行能量的傳遞，這樣熒光儀就可以檢測到熒光信號，熒光信號的強弱代表了靶序列的多少；所以對該信號的檢測是在退火后進行27、sanger 定義：以靶dna鏈為模板，指導核酸合成的過程中，以釋放熒光為檢測信號，從而對靶dna鏈進行實時測序的方法原理：利用dna聚合酶，以單鏈dna為

40、模板，以 dntp 為底物， 在四組相對獨立的反應體系中分別加入不同的ddntp 作為鏈反應終止劑，依據(jù)堿基配對原就，在測序引物引導下，合成四組有序梯度的互補dna鏈，然后通過高辨論率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分別，放射自顯影檢測后直接識度待測dna的序列28、如何來確定模板dna的量？當固定c 循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比；當固定t 熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比；每個模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù) 存在線性關系， 起始拷貝數(shù)越多，ct 值越小利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線， 其中橫坐標代表起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代ct 值只要獲得未知樣品的ct 值，即可從標準

41、曲線上運算出該樣品的起始拷貝數(shù)；29、ct值的含義是： 每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)受的循環(huán)數(shù)；ct 值分析實際上就是低濃度的熒光值分析30、熒光域值：是指pcr 反應的前15 個循環(huán)的熒光信號31、 rna的體外擴增nasba ：核酸序列的擴增nasba 、轉錄依靠的擴增系統(tǒng)tas、自主 維護序列擴增或再生式序列復制3sr32、基本原理： 以 rna為模板在體外大量擴增rna ，利用3 種酶：逆轉錄酶、 t7rna聚合酶和rnaseh，模擬逆轉錄病毒rna genome的復制過程， 來大量擴增rna ；反應體系溫 度均一at 42 、rna產(chǎn)物以10 的指數(shù)方式增加33、 2

42、個特殊引物：引物a 與rna3 端互補， 5 端含t7啟動子引物b 與cdna第一條鏈 3端互補名師總結精品學問點34、連接酶鏈反應lcr基本原理：是以dna連接酶將某一dna鏈的5磷酸與另一相鄰鏈的 3羥基連接為基礎的循環(huán)反應；1、遺傳性疾病的分子診斷策略和方法？遺傳性疾病分兩類：符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因遺傳病、不符合孟德爾遺傳規(guī)律的多基因遺傳病（又稱多因素性疾?。?、三代遺傳標志1.rflp2.str ， vntr3.snp2、遺傳病的分子診斷：1、血紅蛋白?。貉t蛋白病可以分為由于珠蛋白一級結構的變化 所導致的反常血紅蛋白??；由于珠蛋白多肽鏈的合成速率不平穩(wěn)所導致的地中海貧血2、 鐮狀

43、細胞貧血：一種遺傳性貧血癥，屬隱性遺傳性疾??；患者的紅細胞缺氧時變成鐮刀形，失去輸氧的功能，破裂造成嚴峻貧血；該病常見于非洲和美洲黑人，由于雜合基因型細胞貧血癥狀稍微，但紅血球內(nèi)的稍微缺氧對寄生在紅血球里的瘧原蟲卻是致死的，有利于防止瘧疾的流行限制性內(nèi)切酶mst 識別序列為cctnagg ，n 為任意核苷酸；因此 珠蛋白基因的第5、6、7 密碼子中有該內(nèi)切酶的識別位點；發(fā)生鐮狀突變后該酶切位點消逝3、地 中海貧血： 是由于珠蛋白鏈的合成不平穩(wěn)所造成的一類常見的單基因遺傳性、溶血性疾病a:pcr法、southern 印跡法、b:pcr-rdb法、pcr-aso法、等位基因特異性pcr （ asp

44、cr ） 、 芯片技術3、產(chǎn)前遺傳缺陷的分子診斷：產(chǎn)前診斷pnd 、植入前遺傳學診斷pgd ：pnd和 pgd 的適 應癥：pnd ： （通過對絨毛組織或羊水細胞的基因分析，可診斷100 多種單基因遺傳??；pgd ： 采納極體分析法對30 多種遺傳病進行診斷；）a 有可能孕育出嚴峻遺 傳性疾病和先天性畸形胎兒的孕婦；b 夫婦一方有某種遺傳病或曾生出過某種遺傳病患兒，或孕婦有x 伴性隱性遺傳病家族史；c夫婦任何一方為染色體反常、染色體平穩(wěn)移位和倒位攜帶者； d 早 孕階段曾服用過致畸藥物或曾有病毒感染史等致畸情形； e羊水過多或過少； f緣由不 明的多次流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)的孕婦； g胎兒發(fā)育遲緩； h 未觸到正常的胎兒； i 年齡超 過 35 歲的孕婦等等4、腫瘤細胞增生的分子機制：原癌基因活化或抑癌基因失活；促凋亡基因失活或抑制凋亡基因功能增強； dna修復基因失活 5、家族性高脂血癥的分子診斷表型分類基因缺陷臨床特點家族性高膽固醇血癥ldl受體缺陷膽固醇上升為主，多為冠心病和高脂血癥家族史；家族性載脂蛋白b100 缺陷apo b100缺 陷 同上家族性混合型高脂血癥不清晰膽固醇和甘油三酯均上升，vldl