第五章酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)

1、第五章第五章 酶與細(xì)胞的固定化技酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)術(shù)酶應(yīng)用過(guò)程中的一些不足酶應(yīng)用過(guò)程中的一些不足 酶的穩(wěn)定性較差酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無(wú)疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化

2、帶來(lái)一定的困難。 固定化技術(shù)固定化技術(shù)酶的固定化酶的固定化 1 1、什么是固定化技術(shù)和固定化酶、什么是固定化技術(shù)和固定化酶2 2、固定化酶的研究歷史、固定化酶的研究歷史3 3、酶的固定化技術(shù)、酶的固定化技術(shù)4 4、固定化酶的特點(diǎn)、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGoGo 固定化生物技術(shù)固定化生物技術(shù) 通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。復(fù)利用。 1.1.酶酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。機(jī)溶劑對(duì)其有影響）。2.2.不能回收，也使

3、產(chǎn)物中混雜酶蛋白。不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.3.分離純化困難。分離純化困難。 游離酶的缺點(diǎn)：游離酶的缺點(diǎn)：什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)固定化酶 固定化酶：是指借助物理或化學(xué)方法將酶固定在載體上，并在一定的空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化酶可以連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。 固定化酶形狀：顆粒、線條、薄膜和酶管等。 固定化菌體 優(yōu)點(diǎn)：1）可提高穩(wěn)定性；2）能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用；3）可連續(xù)化生產(chǎn)操作；4）可實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化控制；5）酶可以再生利用。 缺點(diǎn)：1）酶固

4、定化后酶活力有損失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)。制備固定化酶的依據(jù)制備固定化酶的依據(jù) 固定化酶必須能保持酶原有的專(zhuān)一性、高效催化能力和常溫、常壓下能起催化反應(yīng)等特點(diǎn)。 固定化酶應(yīng)能回收、貯藏，利于反復(fù)使用。 固定化酶應(yīng)用于機(jī)械化和自動(dòng)化操作，所用載體常有一定的機(jī)械強(qiáng)度。 固定化酶應(yīng)能保持甚至超過(guò)原有酶液的活性。即要保護(hù)活性中心基團(tuán)。 固定化酶應(yīng)能最大程度與底物接近，從而提高產(chǎn)量。具有最小的空間位阻。 固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。 定化酶應(yīng)易與產(chǎn)物分離。固定化方法固定化方法 吸附法吸附法 結(jié)合法結(jié)合法 交聯(lián)法交聯(lián)法 包埋法包埋法網(wǎng)格型網(wǎng)格型微微囊型囊型共價(jià)鍵共

5、價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合法離子鍵離子鍵結(jié)合法結(jié)合法酶的固定化方法 1 1、吸附法、吸附法 利用各種固體吸附劑將酶或含利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。定化的方法。 常用的固體吸附劑有常用的固體吸附劑有活性炭、活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。等。 操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。且可反復(fù)使用。 由于靠物理吸附作用，由于靠物理吸附作用，結(jié)合力結(jié)合力較弱較弱，酶與載體結(jié)合

6、不牢固而容易，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。脫落，所以使用受到一定的限制。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，酶活力損失少。便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸結(jié)合力弱，易解吸附附。 2、結(jié)合法、結(jié)合法選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為：離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子：通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為離子鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使

7、用的載體是某些不溶于水的離子交換鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法所使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有劑。常用的有DEAE-DEAE-纖維素纖維素、TEAE-TEAE-纖維素纖維素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠等。等。 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法稱為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：合法。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素纖維素、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠、葡聚糖葡聚糖凝膠凝膠、甲殼質(zhì)甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要

8、有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基酶分子中可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使和咪唑基等。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使載體活化載體活化。第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化過(guò)氧化氫酶固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基?；腹潭ɑ被；?借助共價(jià)借助共價(jià)鍵將酶的活性鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。聯(lián)。共價(jià)結(jié)合法（共價(jià)結(jié)合法（covalent b

9、inding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling） 1 1）載體：）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體親水載體優(yōu)于疏水載體 如如: :天然高分子衍生物天然高分子衍生物: : 纖維素纖維素 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 親和性好，機(jī)械性能差親和性好，機(jī)械性能差 瓊脂糖瓊脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu) 尼龍尼龍 使載體活化的方法很多，主要使載體活化的方法很多，主要的有：重氮化法、疊氮法、溴化氰的有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。法、烷基

10、化法等。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性?？臻g構(gòu)象而影響酶的催化活性。 3 3、交聯(lián)法、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法定化酶的方法。戊二醛有兩個(gè)醛基，這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反戊二醛有兩個(gè)醛基，這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（應(yīng)，形成席夫（SchiffSchiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定）堿，而使

11、酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體?；富蚬潭ɑw。交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。 酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶酶活力損失較大活力損失較大，而且制備

12、成的固定化酶或固定化菌體的，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。為此，給使用帶來(lái)不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短以取長(zhǎng)補(bǔ)短。 常用的雙功能試劑有戊二醛、常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。戊二醛。酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) 酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：(1)(1)反

13、應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。帶來(lái)不便。 4. 4. 包埋法包埋法 將酶用物理的方法將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：網(wǎng)格型：將酶包埋在高將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：微囊型：將酶包埋在高將酶包埋在高分子半透膜中。分子半透膜中。1）網(wǎng)格型包埋法網(wǎng)格型包埋法（gel (latticgel (lattic) entrapment) entrapment） 又稱

14、凝膠包埋法又稱凝膠包埋法凝膠凝膠包埋條件包埋條件 酶活性酶活性強(qiáng)度強(qiáng)度天然凝膠天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠角叉菜膠、明膠溫和溫和不變不變差差合成凝膠合成凝膠聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹(shù)脂交聯(lián)樹(shù)脂聚合反應(yīng)聚合反應(yīng) 部分失活部分失活 高高使用的多孔載體及其特點(diǎn)使用的多孔載體及其特點(diǎn)海藻酸鈣凝膠包埋法：海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至滴至海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法：角叉菜膠包埋法： 滴至滴至角叉菜膠角叉菜膠E (or cell) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：

15、聚丙烯酰胺凝膠包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation） 又稱半透膜包埋法又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi)微孔膜內(nèi) 。半透膜：直徑幾十微米到幾。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約百微米，厚約25nm25nm。 半透膜孔徑半透膜孔徑 酶分子孔徑，小于半透酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進(jìn)出，被稱為出，被稱為“人工細(xì)胞人工細(xì)胞”。 與網(wǎng)

16、格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1 1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。2 2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免體內(nèi)既可避免引起免疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高反應(yīng)條件要求高, ,制備成本也較高。制備成本也較高。 包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：法，與其它固定

17、化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。 吸附法吸附法 結(jié)合法結(jié)合法 交聯(lián)法交聯(lián)法 包埋法包埋法 酶的四種固定化方法酶的四種固定化方法固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法結(jié)合法結(jié)合法交聯(lián)法交聯(lián)法制備難易制備難易易易較難較難難難較難較難結(jié)合程度結(jié)合程度弱弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收活力回收高，酶易流高，酶易流失失高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能不能不能不能不能費(fèi)用費(fèi)用低低低低高高中等中等底物專(zhuān)一性底物

18、專(zhuān)一性 不變不變不變不變可變可變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較固定化酶性質(zhì) 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性影響：1）對(duì)熱穩(wěn)定性提高；2）對(duì)變性劑、抑制劑的耐受性提高；3）對(duì)蛋白酶抵抗能力增加、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。 最適溫度：一般與游離酶相似。 最適pH：受載體帶電性和產(chǎn)物性質(zhì)等最適pH會(huì)受一定影響。 底物特異性：是否變化與底物的分子質(zhì)量大小有一定關(guān)系。 米氏常數(shù)：固定化酶的表觀米氏常數(shù)隨載體帶電性能而變化。固定化酶操作的注意事項(xiàng)固定化酶操作的注意事項(xiàng) 活性中心活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)

19、結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。 功能基團(tuán)功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固定化結(jié)合定化結(jié)合 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活，

20、因此，操作有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。分類(lèi)方式分類(lèi)方式 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 分類(lèi)方式分類(lèi)方式固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型微生物微生物植物植物動(dòng)物動(dòng)物生理狀態(tài)生理狀態(tài)死細(xì)胞死細(xì)胞: :完整細(xì)胞完整細(xì)胞, ,細(xì)胞碎片細(xì)胞碎片, , 細(xì)胞器細(xì)胞器活細(xì)胞活細(xì)胞: :增殖細(xì)胞增殖細(xì)胞, ,靜止細(xì)胞靜止細(xì)胞, , 饑餓細(xì)胞饑餓細(xì)胞細(xì)胞的固定化方法細(xì)胞的固定化方法 1) 1) 直接固定法直接固定法 不使用載體，借助物理（如加熱、冰凍）、不使用載體，借助物理（如加熱、冰凍）、化學(xué)方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細(xì)胞直接化

21、學(xué)方法（如檸檬酸、各種絮凝劑）將細(xì)胞直接固定。固定。 一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。 2)2)吸附法吸附法 3)3)包埋法包埋法 2. 2. 固定化方法固定化方法 與固定化酶相比，固定化細(xì)胞的情與固定化酶相比，固定化細(xì)胞的情況比較復(fù)雜。況比較復(fù)雜。 （1 1）有活性升高的現(xiàn)象。）有活性升高的現(xiàn)象。（2 2）穩(wěn)定性的增加）穩(wěn)定性的增加 。（3 3）最適溫度和最適）最適溫度和最適pHpH常保持不變。常保持不變。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 固定化酶（細(xì)胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)（一） 固定化酶（細(xì)胞）活力：固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測(cè)定自然酶活力的方法改進(jìn)

22、后才能用于測(cè)定固定化酶。 通常采用間歇測(cè)定和連續(xù)測(cè)定方法。 蛋白總量：1）雙辛可寧酸法(BCA法) ；2）考馬斯亮藍(lán)法 。 半衰期：在連續(xù)測(cè)定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示，是衡量穩(wěn)定性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 如果耦聯(lián)率與酶活力回收率相近，則表明固定化方法對(duì)酶活力沒(méi)有明顯影響。固定化酶（細(xì)胞）的評(píng)價(jià)指標(biāo)（二） 偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100% 活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力100% 相對(duì)活力=固定化酶總活力/ (加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)100%乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸

23、乙酰乙酰 -D Ala固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用 一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 1. 氨基酰化酶（氨基?；福ˋminoacylase） 世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶泵泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)離心機(jī)消消旋旋反反應(yīng)應(yīng)器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala 2.2.葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶 世界上生產(chǎn)規(guī)模世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶。的一種固定化酶。二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 消血栓：消血栓：n纖

24、溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無(wú)法長(zhǎng)期使用。反應(yīng)，無(wú)法長(zhǎng)期使用。n酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。能自由進(jìn)出。2. 2. 人工腎：人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。和微膠囊活性炭組成人工腎。1.1.酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅?

25、固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)既有不溶性酶體系的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；電極的高靈敏度；酶的專(zhuān)一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，酶的專(zhuān)一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。 三、在分析檢測(cè)中的應(yīng)用三、在分析檢測(cè)中的應(yīng)用 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個(gè)生物傳感器世界上第一個(gè)生

26、物傳感器葡萄糖葡萄糖氧化酶電極氧化酶電極。 葡萄糖酶電極 酶電極示意圖D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5內(nèi)酯內(nèi)酯H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)電極GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據(jù)反應(yīng)中消耗的根據(jù)反應(yīng)中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧電極、可以用氧電極、pHpH電極和電極和H H2 2O O2 2電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。電極來(lái)測(cè)定葡萄糖的含量。 繼酶?jìng)鞲衅鳎ɡ^酶?jìng)鞲衅鳎╡nzyme sensorenzym

27、e sensor）后，又出現(xiàn)：）后，又出現(xiàn)： 細(xì)胞器傳感器（細(xì)胞器傳感器（cell organelle sensorcell organelle sensor） 組織傳感器（組織傳感器（tissue sensortissue sensor） 微生物傳感器（微生物傳感器（microbe sensormicrobe sensor） 免疫傳感器（免疫傳感器（immunosensorimmunosensor）1）酶?jìng)鞲衅鞯脑恚┟競(jìng)鞲衅鞯脑?生物傳感器生物傳感器 由生物識(shí)別單元（如酶、微生物、抗由生物識(shí)別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器

28、。析儀器。生物識(shí)別元件生物識(shí)別元件(Biological recognition element)(Biological recognition element) 是酶、抗原是酶、抗原( (體體) )、細(xì)胞器、組織、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)定的物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。物質(zhì)有選擇性的分子識(shí)別能力。 換能器換能器(Transducer)(Transducer) 將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中將識(shí)別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱

29、等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的或熱等轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系比例關(guān)系。酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髟硎疽鈭D酶?jìng)鞲衅鞴ぷ髟硎疽鈭D酶?jìng)鞲衅髅競(jìng)鞲衅髦饕芍饕晒潭ɑ改ず妥儞Q器固定化酶膜和變換器組成：組成：固定化酶膜：固定化酶膜：選擇性地選擇性地“識(shí)別識(shí)別”并催化被檢測(cè)物質(zhì)并催化被檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)儀表顯示出來(lái)。信號(hào)，通過(guò)儀表顯示出來(lái)。 2）酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用）酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用 水質(zhì)監(jiān)測(cè)水質(zhì)監(jiān)測(cè) 用化學(xué)法測(cè)定酚時(shí)，硫化物、油類(lèi)等用化學(xué)法測(cè)定酚時(shí)，硫化物、油類(lèi)等可干擾其測(cè)定?？筛蓴_其測(cè)定。 從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成酚傳感的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成酚傳感器，可檢測(cè)大多數(shù)酚類(lèi)化合物器，可檢測(cè)大多數(shù)酚類(lèi)化合物。醫(yī)療方面醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測(cè)定儀葡萄糖傳感器和血糖測(cè)定儀 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖傳感器，）制成葡萄糖傳感器，可測(cè)定血液中