食品中單核細胞增生李斯特氏菌及其檢驗

1、第三節(jié) 單核細胞增生李斯特氏菌及其檢驗v主要內(nèi)容：一、生物學特性一、生物學特性二、流行病學二、流行病學三、檢驗三、檢驗四、控制四、控制v李斯特氏菌屬包括七個種： 單核細胞增生李斯特氏菌 、綿羊李斯特氏菌 、英諾克李斯特氏菌 、威爾斯李斯特氏菌 、西爾李斯特氏菌 、格氏李斯特氏菌 、默氏李斯特氏菌。 v其中單核細胞增生李斯特氏菌對人類致病性強，綿羊李斯特氏菌對人類也有一定的致病性，其余李斯特氏菌無致病性。 單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。病原菌。 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、為敗

2、血癥、 腦膜炎和腦膜炎和單核細胞增多單核細胞增多。 它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在氏菌對人類的安全具有危險，該菌在44的環(huán)境中的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須加以重視。必須加以重視。v毒血癥：病原菌在入侵的局部生長繁殖，細菌不侵入血流，只是其產(chǎn)生的毒素侵入血流引起全身性狀白喉、破傷風v菌血癥：病原菌入侵機體后進入血流，但不在血流中繁殖，如傷寒、流行性腦脊髓膜炎的早期有

3、菌血癥期.v膿毒血癥:病原性球菌引起的敗血癥.由于病原菌隨血流播散,在全身多種組織或臟器(肝肺腎皮下等)引起多發(fā)性化膿病灶.如金黃葡萄球菌導致的膿毒血癥.v敗血癥:是球菌、桿菌等侵入血液中并在其中生長繁殖產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染。癥狀是寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關節(jié)痛及肝脾腫大，部分有感染性休克和遷徙性病灶。v1 1、形態(tài)與染色、形態(tài)與染色v革蘭氏革蘭氏陽性短桿菌，大陽性短桿菌，大小為小為0.40.50.40.50.520.52m m，在有些培養(yǎng)基中稍彎，多數(shù)菌體一端較大，似棒在有些培養(yǎng)基中稍彎，多數(shù)菌體一端較大，似棒狀，細胞常呈狀，細胞常呈v v字形排列，在較老的或生長不良的字形

4、排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀。培養(yǎng)物中，可能形成絲狀。v20-2520-25以以4 4根周生根周生鞭毛鞭毛運動，在運動，在3737只有較少的只有較少的鞭毛或鞭毛或1 1根鞭毛；根鞭毛；v無芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖無芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖莢膜。莢膜。 2、培養(yǎng)特性 該菌營養(yǎng)要求不高，在該菌營養(yǎng)要求不高，在20-2520-25培養(yǎng)有動力，穿刺培培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)養(yǎng)2 25 5天可見傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見天可見傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。翻跟斗運動。 該菌的生長范圍為該菌的生長范圍為2-422-42（也有報道在（也

5、有報道在00能緩慢生能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為長），最適培養(yǎng)溫度為35-3735-37，在，在phph中性至弱堿性中性至弱堿性（ph9.6ph9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，在該菌生長良好，在ph3.8ph3.84.44.4能緩慢生長，在能緩慢生長，在6.5% 6.5% naclnacl 肉湯中生長良好。肉湯中生長良好。產(chǎn)單核細胞李斯特菌在半固體培養(yǎng)基中的生長情況有動力自穿刺線向四周蔓延生長呈典型傘狀生長，底部為彎月牙狀2、培養(yǎng)特性v在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露

6、滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。v在在5-7%5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的-溶血環(huán)溶血環(huán)。v在在0.6%0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(tsaye)(tsaye)瓊脂上，瓊脂上，用用4545角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。listeria monocytogenesv3 3、生化反應、生化反應v觸酶觸酶陽性，陽性，氧化酶氧化酶陰

7、性。陰性。v能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖鼠李糖、七葉苷七葉苷、蔗糖、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。v不發(fā)酵不發(fā)酵木糖木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。v不利用枸櫞酸鹽，不利用枸櫞酸鹽，40%40%膽汁不溶解。膽汁不溶解。v吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性。賴氨酸、鳥氨酸均陰性。vv

8、pvp、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。觸酶試驗3 3、生化反應、生化反應 過氧化氫酶，又稱接觸酶，能催過氧化氫酶，又稱接觸酶，能催 化化過氧化氫水解為氫和氧過氧化氫水解為氫和氧右為陰性左為陽性葡萄糖：陽性糖酵解試驗麥芽糖 陽性對照七葉苷 陽性鼠李糖 陽性甘露醇陰性木糖陰性木糖陰性尿素酶試驗：有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解，產(chǎn)生兩個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。穿刺接種尿素瓊脂斜面，35培養(yǎng)5天，逐日觀察陰性尿素酶試驗尿素酶試驗1 未接種2 尿素酶陽性3尿素酶陰性硝酸鹽還原試驗：硝酸鹽還原試驗：v接種硝酸鹽肉湯，接種硝酸鹽肉湯，3535培養(yǎng)培養(yǎng)5 5天，

9、加入天，加入0.2ml0.2ml的試劑的試劑a,a,再加入再加入0.2ml0.2ml的試劑的試劑b,b,輕輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者表明有亞硝酸鹽存在，為硝酸棕色者表明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。鹽還原陽性。v若無顏色變化，須加入少量鋅粉若無顏色變化，須加入少量鋅粉變紅者為陰性（硝酸鹽未被還原）變紅者為陰性（硝酸鹽未被還原）不變?yōu)殛栃裕▉喯跛猁}已分解成氨和氮）不變?yōu)殛栃裕▉喯跛猁}已分解成氨和氮）硝酸鹽還原試驗v4 4、血清型、血清型v根據(jù)菌體（根據(jù)菌體（o o）抗原和鞭毛（）抗原和鞭毛（h h）抗原，將單增李）抗原，將單增李氏菌分成氏菌分

10、成1313個血清型，分別是個血清型，分別是1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e和和“7”137”13個血清型。個血清型。v致病菌株的血清型一般致病菌株的血清型一般1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,后兩型居多。后兩型居多。v該菌對理化因素的抵抗力較強，在土壤、糞便、該菌對理化因素的抵抗力較強，在土壤、糞便、青貯飼料和干草內(nèi)能長期存活。青貯飼料和干草內(nèi)能長期存活。v對堿和鹽的抵抗力較

11、強，對堿和鹽的抵抗力較強，60-7020-30min60-7020-30min即被即被殺死；殺死；70%70%的酒精的酒精5min5min，2.5%2.5%的氫氧化鈉、的氫氧化鈉、2.5%2.5%的石炭酸、的石炭酸、2.5%2.5%的福爾馬林的福爾馬林20min20min即可殺死此菌。即可殺死此菌。v該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、磺胺均該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。敏感。v單增李氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受單增李氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、污水、地表水、廢水、植物、較高的滲透壓，在土壤、污水、地表水、廢水、植物、青貯飼料、爛

12、菜中均有該菌存在，所以，動物很容易誤青貯飼料、爛菜中均有該菌存在，所以，動物很容易誤食該菌，并通過口腔食該菌，并通過口腔- -糞便的途徑進行傳播。李氏菌是條糞便的途徑進行傳播。李氏菌是條件致病菌，大多為散發(fā)病例，也可因污染食品而爆發(fā)。件致病菌，大多為散發(fā)病例，也可因污染食品而爆發(fā)。v本菌能產(chǎn)生一種溶血性質的外毒素，能引起人、牛、綿本菌能產(chǎn)生一種溶血性質的外毒素，能引起人、牛、綿羊等動物的腦膜炎，可使家兔、豚鼠等實驗動物感染引羊等動物的腦膜炎，可使家兔、豚鼠等實驗動物感染引起血中單核細胞增高。起血中單核細胞增高。v可引起嬰兒及新生兒的化膿性腦膜炎或腦膜腦炎，死亡可引起嬰兒及新生兒的化膿性腦膜炎或

13、腦膜腦炎，死亡率可達率可達70%70%，子宮內(nèi)感染的胎兒，可導致流產(chǎn)、習慣性流，子宮內(nèi)感染的胎兒，可導致流產(chǎn)、習慣性流產(chǎn)、死胎或新生兒李斯特氏菌病。產(chǎn)、死胎或新生兒李斯特氏菌病。與李斯特氏菌有關的食品與李斯特氏菌有關的食品肉制品（熱狗、香腸）肉制品（熱狗、香腸）軟奶酪軟奶酪鮮奶鮮奶生菜色拉生菜色拉 1、樣品的采集: 冷凍樣品：2-5 解凍，不超過18小時。若不能及時檢驗，應置于-15 保存 非冷凍易腐樣品：應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置于4 冰箱保存，在24小時之內(nèi)檢驗。v2 2、樣品的處理、樣品的處理: : 以無菌操作采取樣品以無菌操作采取樣品25ml(g)25ml(g)置于滅菌均質

14、器中置于滅菌均質器中, ,加加入入225ml225ml的的ebeb和和lblb增菌液增菌液, ,充分攪拌均勻充分攪拌均勻. .如不能及如不能及時檢驗時檢驗, ,可保存在可保存在44冰箱中冰箱中. .v3 3、增菌培養(yǎng)、增菌培養(yǎng) ebeb增菌液放入增菌液放入(30+-1)(30+-1)溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)48h-7d.lb148h-7d.lb1增增菌液放入菌液放入(30+-1)(30+-1)溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24h,24h,取出取出0.1ml0.1ml加入加入10ml10ml的的lb2lb2增菌液中增菌液中2 2次增菌次增菌. .v4 4、分離培養(yǎng)、分離培養(yǎng)v將將ebeb增菌液和增菌液和lbl

15、b2 2增菌液分別畫線接種于增菌液分別畫線接種于mmamma選擇性選擇性培養(yǎng)基瓊脂平板上培養(yǎng)基瓊脂平板上, ,置置(30+-1)(30+-1)培養(yǎng)培養(yǎng)48h48h小時小時, ,挑選挑選可疑菌落可疑菌落, ,用白熾燈用白熾燈4545度角斜光照射平板度角斜光照射平板, ,該菌的菌該菌的菌落為灰藍或蘭色小圓形菌落落為灰藍或蘭色小圓形菌落. .v選擇選擇mmamma平板上平板上5 5個以上的可疑菌落接種三糖鐵瓊脂個以上的可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和和simsim動力培養(yǎng)基動力培養(yǎng)基, ,培養(yǎng)于培養(yǎng)于(25+-1) ,(25+-1) ,觀察是否有觀察是否有動力動力, ,且傘狀或月牙狀生長且傘狀或月牙狀生長.

16、 .一般觀察一般觀察, ,陽性者作下一陽性者作下一步實驗步實驗. .三糖鐵（tsi）瓊脂試驗sim動力試驗接種三糖鐵瓊脂，35培養(yǎng)5天。v5 、純培養(yǎng) 將上述有動力、傘狀，并在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上層下層產(chǎn)酸而不產(chǎn)硫化氫的可疑菌落接種于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（ysa-ye）上，做純培養(yǎng)，供做證實試驗鑒定用v6、染色鏡檢：從ysa-ye平板上挑取可疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色并做濕片查該菌為陽性無芽孢桿菌；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉或翻滾樣運動革蘭氏染色陽性v6、生化試驗：將上述可疑菌落做進一步的生化試驗，該菌的生化特征及種間區(qū)別如下：v+ +為陽性；為陽性；- -為陰

17、性；為陰性；為有反應為有反應菌種項目溶血反應硝酸鹽還原尿素酶mr試驗v-p試驗甘露醇鼠李糖木糖七葉苷h2o2酶試驗單增綿羊英諾克威爾斯西爾斯格氏墨氏v6、生化試驗溶血試驗：溶血試驗：7%7%羊血瓊脂平板，劃分小格，刺種菌落。羊血瓊脂平板，劃分小格，刺種菌落。做陽性對照和陰性對照（英諾克李斯特氏菌）。做陽性對照和陰性對照（英諾克李斯特氏菌）。3535培養(yǎng)培養(yǎng)24-4824-48小時，于明亮處觀察。小時，于明亮處觀察。單核細胞增生李斯特氏菌在單核細胞增生李斯特氏菌在刺種點產(chǎn)生窄小的透明刺種點產(chǎn)生窄小的透明溶血環(huán)。溶血環(huán)。v6 6、生化試驗、生化試驗 mr-vpmr-vp試驗：接種試驗：接種mr-v

18、pmr-vp肉湯，肉湯，35 35 培養(yǎng)培養(yǎng)4848小時。移取小時。移取1ml1ml于潔凈試管，加入于潔凈試管，加入5%5%的的-萘酚萘酚 溶液溶液6ml,6ml,再加入再加入10%10%的的kohkoh溶液溶液0.2ml,0.2ml, 輕搖輕搖1min,1min,靜置靜置20min.20min. v-p v-p陽性反應：紅色。陽性反應：紅色。 剩余培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)剩余培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2d,2d, 加入甲基紅指示劑加入甲基紅指示劑5 5滴。滴。 mrmr陽性反應：紅色。陽性反應：紅色。v6、生化試驗v糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗 接種接種0.5%0.5%的糖類發(fā)酵管。的糖類發(fā)酵管。3535培養(yǎng)培養(yǎng)24-4

19、8h24-48h，陰性繼續(xù)培，陰性繼續(xù)培養(yǎng)到養(yǎng)到5 5天。李斯特氏菌不產(chǎn)氣。天。李斯特氏菌不產(chǎn)氣。 單增李斯特氏菌生化反應如下：單增李斯特氏菌生化反應如下： 葡萄糖：陽性葡萄糖：陽性 麥芽糖：陽性麥芽糖：陽性 七葉苷：陽性七葉苷：陽性 甘露醇：陰性甘露醇：陰性 鼠李糖：陽性鼠李糖：陽性 木糖：陰性木糖：陰性 葡萄糖：陽性6、生化試驗鼠李糖 陽性6、生化試驗木糖陰性6、生化試驗甘露醇陰性6、生化試驗七葉苷 陽性6、生化試驗麥芽糖 陽性6、生化試驗v7、小鼠毒力試驗 將符合生化試驗的純培養(yǎng)物接種于將符合生化試驗的純培養(yǎng)物接種于tsb-yetsb-ye中，在中，在3030培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h，離心、

20、濃縮，使?jié)饪s液含細菌量，離心、濃縮，使?jié)饪s液含細菌量10101010個個/ml,/ml,取取0.5ml0.5ml濃縮液注射小白鼠腹腔（濃縮液注射小白鼠腹腔（3-53-5只），觀只），觀察小白鼠的死亡情況。致病菌株于察小白鼠的死亡情況。致病菌株于2-5d2-5d內(nèi)死亡，同內(nèi)死亡，同時應做已知菌對照試驗。單核細胞增生李斯特氏菌、時應做已知菌對照試驗。單核細胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌對小白鼠有致病性。綿羊李斯特氏菌對小白鼠有致病性。 8 8、協(xié)同溶血試驗（、協(xié)同溶血試驗（camp)camp) 在血平板上平行接種金黃葡萄球菌和馬紅球菌，在在血平板上平行接種金黃葡萄球菌和馬紅球菌，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，在在30 30 培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h,24-48h,檢查平板中垂直接種點對溶血環(huán)檢查平板中垂直接種點對溶血環(huán)的影響?？拷瘘S葡萄球菌接種點的單增李斯特氏菌的影響。靠近金黃葡萄球菌接種點的單增李