微生物生理生化實驗

1、 山東大學實驗報告 2014年 12月 5 日姓名 班級 13級生命基地班 學號 同組者： 科目 微生物學實驗 題目 微生物生理生化實驗 組別 3【實驗題目】 微生物生理生化實驗【實驗目的】1. 了解生理生化的意義。2. 掌握幾種常用生理生化的實驗方法?！緦嶒炂鞑摹?、 菌種： 枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，變形桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌2、試劑：  盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水等3、 儀器和用具：  酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管 等4、 培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基（大分子物質(zhì)水解實驗） 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（

2、內(nèi)附倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵實驗） 蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚實驗） 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（甲基紅培養(yǎng)基）【實驗原理】 在所有生活細胞中存在的全部生物化學反應稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應過程。具有酶功能的蛋白質(zhì)多數(shù)在細胞內(nèi)，稱為胞內(nèi)酶。許多細菌產(chǎn)生胞外酶，這些酶從細胞中釋放出來，以促進細胞外的化學反應。各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)出很大的差異，如表現(xiàn)在對大分子糖類和蛋白質(zhì)的分解能力以及分解代謝的最終產(chǎn)物的不同，反映出他們具有不同的酶系和不同的生理特性，這些特性可被用作為細菌鑒定和分類的內(nèi)容。具體實驗原理如下：1、 大分子物質(zhì)的水解實驗原理1、淀粉水解 由于微生物對淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用

3、，所以必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質(zhì)為較小的化合物,使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶將淀粉水解為小分子的糊精,雙糖和單糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉。已知淀粉遇到碘會顯現(xiàn)藍色，因此可通過在淀粉培養(yǎng)基上滴加碘液來判斷微生物是否能產(chǎn)生淀粉酶分解淀粉，菌落周圍不呈藍色，出現(xiàn)無色透明圈，則該菌種能夠水解淀粉。2、油脂水解 脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸，而產(chǎn)生的脂肪酸可改變培養(yǎng)基的PH,因此在油脂培養(yǎng)基上接種細菌，培養(yǎng)一段時間后可通過觀察菌苔的顏色判斷菌種是否能夠水解油脂，若出現(xiàn)紅色斑點，則說明這種菌可產(chǎn)生分解油脂的

4、酶。2、 糖發(fā)酵實驗原理 糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應,在腸道細菌的鑒定上尤為重要.絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異.有些細菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和氣體(如氫氣,甲烷,二氧化碳等);有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。A 培養(yǎng)前的情況B 培養(yǎng)后 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣C 培養(yǎng)后 產(chǎn)酸產(chǎn)氣 圖1：糖發(fā)酵實驗3、 IMViC實驗1、 吲哚實驗 用來檢測

5、吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實驗可以作為一個生物化學檢測的指標。大腸桿菌吲哚反應陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。2、 甲基紅實驗 某些細菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進而被分解產(chǎn)生甲酸、乙酸和乳酸等多種有機酸，使培養(yǎng)基的PH值降低，加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉變?yōu)榧t色，即甲基紅反應。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸，但是這個實驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上還是有價值的。這兩種細菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有

6、機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)的后期仍能維持酸性（PH4),而產(chǎn)氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇，丙酮酸等，使PH升至6左右。因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性?！緦嶒瀮?nèi)容及步驟】1、淀粉水解實驗  （1）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右， 在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個平板。  （2）標記：用記號筆在平板底部劃成四部分，標好要進行接種的菌的編號，以免混淆。 （3）接種：在無菌操作臺上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別在 標記好的區(qū)域內(nèi)點種，如圖1所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)

7、基，避 免因接種菌量過多而造成假陽性。  （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。  （5）觀察：取出培養(yǎng)基，觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入適量盧戈氏碘液于 平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板，觀察培養(yǎng)皿中菌落周圍是否 有無色透明圈產(chǎn)生，若有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，該種菌為陽性， 反之則為陰性。記錄實驗結果。2、油脂水解試驗（1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50左右， 充分振蕩，使油脂均勻分布，在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個平板。  （2）標記：用記號筆在在

8、平板底部劃成四部分，并標好需要接種的菌的編號。（3）接種：在無菌操作臺上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌和銅綠假單胞菌分別劃十 字線接種于平板相對應部分的中心，如圖2所示。  （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28溫箱中培養(yǎng)兩天。 （5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點，說明脂肪水解，為陽性反應。記錄 實驗結果。3. 葡萄糖發(fā)酵實驗 （1） 培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，先將德漢氏 小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空 氣，每組3只試管，滅菌。 （2） 接種：待培

9、養(yǎng)基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支分別接 入大腸桿菌和普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣 泡，第3支不接種，作為對照組。在各試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發(fā)酵 培養(yǎng)基的名稱和所接種的細菌菌名。  （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結果。4. 乳糖發(fā)酵實驗（1） 培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往 德漢氏小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓

10、德漢氏小管中 進入空氣，每組五只試管，滅菌。 （2） 接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支分別接入 大腸桿菌和普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。在 試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細菌菌名。  （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4） 觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結果。5. 吲哚實驗（1） 培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組3只，高壓 滅菌鍋滅菌 （2） 接種

11、：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別接入2支蛋白胨 水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上放好，將其放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：往培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入3-4滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應。觀察加入試劑后試管內(nèi)的顏色反應并記錄實驗結果。6. 甲基紅實驗（1） 培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組3只 試管 ，高壓滅菌鍋滅菌。（2） 接種：待培養(yǎng)

12、基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌分別接入2支葡萄糖 蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。 （3） 培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28下培養(yǎng) 兩天。 （4） 觀察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入2滴甲基紅試劑，培 養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實驗結果?！緦嶒灲Y果】 表1.淀粉水解試驗結果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰/陽性結論大腸桿菌-不可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉普通變形桿菌-不可以水解淀粉銅綠假單胞菌-不可以水解淀粉 表2

13、. 油脂水解試驗結果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰/陽性結論大腸桿菌-不可以水解油脂枯草芽孢桿菌-不可以水解油脂普通變形桿菌-不可以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂 表3. 葡萄糖發(fā)酵試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色黃色黃色紫色是否產(chǎn)氣是是否陰/陽性+-結論大腸桿菌能分解葡萄糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣對照組 表4. 乳糖發(fā)酵試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色黃色紫色紫色是否產(chǎn)氣是否否陰/陽性+-結論大腸桿菌能分解乳糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣普通變形桿菌不能分解

14、乳糖對照組 表5.吲哚試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌是否產(chǎn)生紅色環(huán)狀物是否陰/陽性+-結論大腸桿菌可以分解色氨酸生成吲哚產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸生成吲哚 表6. 甲基紅試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌顏色變紅變黃陰/陽性+-結論大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性PH產(chǎn)氣腸桿菌將有機酸轉化為非酸性末端產(chǎn)物【實驗小結】本次實驗的內(nèi)容包括：用淀粉培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和普通變形桿菌進行培養(yǎng)，并用盧戈氏碘液檢驗菌種是否具有產(chǎn)生淀粉酶，利用淀粉的能力；再用油脂培養(yǎng)基對這四種菌進行培養(yǎng)，用中性紅指示劑檢驗其是否會產(chǎn)生脂肪

15、酶；用糖發(fā)酵培養(yǎng)基對大腸桿菌和普通變形桿菌進行培養(yǎng)，利用1.6%溴甲酚紫乙醇溶液和德漢氏小管檢驗其是否能利用糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；用蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，用乙醚和吲哚檢驗其能否產(chǎn)生色氨酸；用葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，用甲基紅指示劑檢驗其能否利用葡萄糖產(chǎn)有機酸。實驗內(nèi)容較多，且用到的試管，平板和菌種較多，因此實驗中要及時貼好標簽，做好標記，以免混淆。同時，通過這次實驗掌握了幾種常用的生理生化實驗方法，相信對以后的實驗會有很大幫助，并掌握了多種培養(yǎng)基制備的方法以及點種與十字接種兩種接種方法：點種時接種面積要小，使菌在小范圍內(nèi)生長，以便于觀察；十字接種時盡量將菌

16、接種在該部分的中央?yún)^(qū)域，在本次實驗進行十字接種時，由于劃線時沒有看清接種環(huán)和培養(yǎng)基之間的距離，導致將固體培養(yǎng)基表面劃破，在今后的實驗中，要在接種操作時更小心仔細些?！舅伎寂c討論】1、 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：淀粉是大分子物質(zhì)，進入細胞十分困難，甚至需要觸及高耗能的胞吞作用。因而通過胞外酶的作用，將淀粉水解為葡萄糖后運入細胞，較方便高效。實驗中菌苔周圍出現(xiàn)透明圈，說明培養(yǎng)基內(nèi)淀粉被水解，可推測是細菌細菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2、 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解后產(chǎn)生葡萄糖，因此可以用斐林試劑驗證淀粉是否被分解。呈陽性者則說明產(chǎn)生了葡萄糖，淀粉

17、被水解；陰性則說明淀粉未被水解。3、 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵實驗應該出現(xiàn)什么結果？答：有氧代謝葡萄糖產(chǎn)生CO2，但CO2微溶于水且碳酸酸性較弱，因此試管中顏色不變化，仍為紫色。但由于產(chǎn)生了CO2，因此德漢氏小管中有氣柱。4、 討論IMViC試驗在醫(yī)學檢驗上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產(chǎn)氣腸桿菌引起的。5、 解釋在細菌培養(yǎng)中吲哚檢測的化學原理，為什么在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：有些細菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲

18、哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學檢測的指標。 因為丙酮酸是生物體呼吸作用的產(chǎn)物，無論是有氧還是無氧，都會產(chǎn)生丙酮酸，因而無法作為色氨酸酶活性的指示劑進行區(qū)分。同時吲哚能通過有明顯顏色變化的化學反應觀測到，而丙酮酸不能，所以試驗中用是否有吲哚產(chǎn)生作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸。6、 為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽性,而產(chǎn)氣腸桿菌為陰性？答：當細菌代謝糖產(chǎn)生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.3）轉變?yōu)榧t色（PH4.2），即甲基紅反應。而大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)的后期仍能維持酸性PH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大約6。因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。 【附錄】培養(yǎng)基配方一、淀粉培養(yǎng)基蛋白胨10gNaCl5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g蒸餾水1000ml瓊脂15-20g121滅菌20min.2、 油脂培養(yǎng)基蛋白胨10g牛肉膏5gNaCl5g香油或花生油10g1.6中性紅水溶液1ml瓊脂15-20ml蒸餾水1000mlPH7.2121S滅菌20min注：1、不能使用變質(zhì)油。2、油和瓊脂及水先加熱。3、調(diào)好PH后，