動物生化實驗實驗牛乳中蛋白質(zhì)的提取與鑒定

1、了解蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)；了解蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)；掌握蛋白質(zhì)的提取方法和鑒定理。掌握蛋白質(zhì)的提取方法和鑒定理。 牛乳中含豐富的蛋白質(zhì)（水分牛乳中含豐富的蛋白質(zhì)（水分87.8%87.8%、脂、脂肪肪3.5%3.5%、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)3.1%3.1%、乳糖、乳糖4.9%4.9%、灰分、灰分0.7%0.7%、能量、能量29.kg/100kg29.kg/100kg），其中主要是），其中主要是酪蛋白。酪蛋白在牛乳中約占總蛋白量酪蛋白。酪蛋白在牛乳中約占總蛋白量的的5/65/6。 蛋白質(zhì)是含羧基和氨基的兩性電解質(zhì)，在某蛋白質(zhì)是含羧基和氨基的兩性電解質(zhì)，在某一一phph值溶液中，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷和值溶液中，蛋

2、白質(zhì)分子所帶的正電荷和負(fù)電荷相等，蛋白質(zhì)以兩性離子狀態(tài)存在，負(fù)電荷相等，蛋白質(zhì)以兩性離子狀態(tài)存在，這時溶液的這時溶液的phph值，稱為該蛋白質(zhì)的等電點值，稱為該蛋白質(zhì)的等電點（pipi）。）。 在等電點時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，在等電點時，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，溶解度最小，蛋白質(zhì)沉淀析出，利用蛋白質(zhì)溶解度最小，蛋白質(zhì)沉淀析出，利用蛋白質(zhì)的這個特點可將蛋白質(zhì)提取出來。的這個特點可將蛋白質(zhì)提取出來。 由于粗提出的酪蛋白中還含有脂肪，可由于粗提出的酪蛋白中還含有脂肪，可用乙醇和乙醚洗滌除去。用乙醇和乙醚洗滌除去。酪蛋白酪蛋白中中含含有有酪酪氨酸殘基，氨酸殘基，酪酪氨酸殘基的氨酸殘基的r r基團(tuán)為基團(tuán)

3、為： 含含酚羥基，可與米倫試劑反應(yīng)先生成白色絮狀酚羥基，可與米倫試劑反應(yīng)先生成白色絮狀沉淀，繼續(xù)反應(yīng)生成紅色沉淀。沉淀，繼續(xù)反應(yīng)生成紅色沉淀。 蛋白中還含有含硫氨基酸（胱氨酸、半蛋白中還含有含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸），在堿性溶液中水解胱氨酸和蛋氨酸），在堿性溶液中水解后可與醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的鉛鹽后可與醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的鉛鹽 三、操作步驟三、操作步驟（一）酪蛋白的制備（一）酪蛋白的制備新鮮牛奶、醋酸納緩沖液各新鮮牛奶、醋酸納緩沖液各5ml5ml 4040 分別加熱至同樣溫度分別加熱至同樣溫度 上清液：上清液：保留做鑒定（燒杯）（保留做鑒定（燒杯）（三）三）邊加邊搖混勻邊加邊搖混勻

4、 5min 5min 沉淀沉淀 加加4ml95%4ml95%的乙醇的乙醇 離心離心5 5分鐘分鐘 上清液：棄去上清液：棄去 沉淀：做鑒定沉淀：做鑒定3000r/min離心離心（二）酪蛋白的性質(zhì)鑒定（二）酪蛋白的性質(zhì)鑒定1 1、溶解度、溶解度 取取3 3支試管支試管+ 0.1m naoh+ 0.1m naoh、 0.2m 0.2m hclhcl、 10%nacl10%nacl各各2ml+2ml+少許酪蛋白少許酪蛋白振蕩振蕩觀察溶解快慢。觀察溶解快慢。2 2、米倫反應(yīng)、米倫反應(yīng) 1ml h2o 少許酪蛋白少許酪蛋白 觀察觀察 10滴米倫試劑。加熱滴米倫試劑。加熱（三）乳清中可凝固性蛋白質(zhì)鑒定：（三

5、）乳清中可凝固性蛋白質(zhì)鑒定： 將第一次離心所得的上清液徐徐加熱，出現(xiàn)蛋白將第一次離心所得的上清液徐徐加熱，出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀（球蛋白、清蛋白）。質(zhì)沉淀（球蛋白、清蛋白）。 四、實驗結(jié)果四、實驗結(jié)果 五、討論五、討論二、常用生化儀器使用二、常用生化儀器使用 離心機(jī)離心機(jī) 離心技術(shù)離心技術(shù)（centrifugal techniquecentrifugal technique）：根據(jù)顆粒作勻速圓周）：根據(jù)顆粒作勻速圓周 運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來 的一種分離技術(shù)。的一種分離技術(shù)。 離心技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的離心技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離

6、出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物沉淀物，天然的生物大分子、無機(jī)物、有機(jī)物，在生物化學(xué)以及其它天然的生物大分子、無機(jī)物、有機(jī)物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子物質(zhì)。的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細(xì)胞、細(xì)胞器及生物大分子物質(zhì)。離心機(jī)種類離心機(jī)種類按按用途用途： 有分析用、制備用及分析有分析用、制備用及分析- -制備分；制備分； 按按結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點： 有管式、吊藍(lán)式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等；有管式、吊藍(lán)式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等； 按按轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速： 有為常速（低速）、高速和超速三種。有為常速（低速）、高速和超速三種。實驗室用普通低速離心機(jī)實驗室用普通低速離心機(jī)實驗室普通離心機(jī)使用方法實驗室普通離心機(jī)使

7、用方法1.1.將離心機(jī)放在堅實而平整的工作臺上；將離心機(jī)放在堅實而平整的工作臺上；2.2.在適用的離心管中加入樣品，在適用的離心管中加入樣品，必須必須對稱配重，否則會對稱配重，否則會損壞離心機(jī)；損壞離心機(jī)；3.3.按離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管位置刻度所對應(yīng)孔插入，放下按離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管位置刻度所對應(yīng)孔插入，放下離心機(jī)頂蓋；離心機(jī)頂蓋；4.4.檢查確認(rèn)調(diào)速鈕處于最低速位置；檢查確認(rèn)調(diào)速鈕處于最低速位置；5.5.打開電源開關(guān)，調(diào)速到需要的轉(zhuǎn)速；打開電源開關(guān)，調(diào)速到需要的轉(zhuǎn)速；6.6.選擇工作時間，調(diào)選擇工作時間，調(diào)“選時選時”鈕到需要的位置。鈕到需要的位置。7.7.離心完成，離心機(jī)自然停止。離心完成，離心機(jī)自然停止。 2、離心機(jī)使用離心機(jī)使用注意事項注意事項 (1）嚴(yán)禁各種液體和雜物進(jìn)入離心工作室，那）嚴(yán)禁各種液體和雜物進(jìn)入離心工作室，那樣會損壞主機(jī)；樣會損壞主機(jī)； （2）儀器電源線應(yīng)有良好的接地，以免發(fā)生意）儀器電源線應(yīng)有良好的接地，以免發(fā)生意外；外； （3）離心機(jī)工作時不要打開頂蓋；）離心機(jī)工作時不要打開頂蓋； （4）電壓