第14章色譜技術(shù)

1、2021-11-231概述概述v1.21.2特點：特點：（1 1） 純化倍數(shù)高純化倍數(shù)高（2 2） 操作規(guī)模小，放大困難操作規(guī)模小，放大困難（3 3） 終產(chǎn)品純化終產(chǎn)品純化（4 4） 適用于價格昂貴的產(chǎn)品適用于價格昂貴的產(chǎn)品2021-11-2321.3色譜的分類色譜的分類1.根據(jù)溶質(zhì)分子與固定相相互作用的機理不同機理不同的分類凝膠色譜親和色譜離子交換色譜分離法吸附色譜法分配色譜法2021-11-2332.2. 根據(jù)固定相的形狀不同的分類：根據(jù)固定相的形狀不同的分類： 柱色譜法柱色譜法薄層色譜法薄層色譜法2021-11-2343 3 根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類 ： 液相

2、色譜（lc）：llc、lsc反相色譜：固定相極性小于流動相4 4 根據(jù)流動相與固定相的極性分類根據(jù)流動相與固定相的極性分類 ： 正相色譜：固定相極性大于流動相氣相色譜（gc）：glc、gsc2021-11-235任何色譜分離過程實任何色譜分離過程實質(zhì)上都是質(zhì)上都是溶質(zhì)隨流動溶質(zhì)隨流動相流動而遷移的過程相流動而遷移的過程，不同溶質(zhì)在流動相不同溶質(zhì)在流動相和固定相中的分配比和固定相中的分配比例不同，例不同，因而隨流動因而隨流動相遷移的速度不同，相遷移的速度不同，從而使不同物質(zhì)分離從而使不同物質(zhì)分離開來。開來。2021-11-236溶質(zhì)在固定相與流動相濃度比值溶質(zhì)在固定相與流動相濃度比值cqkd20

3、21-11-237遷移距離流動相在色譜系統(tǒng)中的溶質(zhì)的遷移距離fr2021-11-2382.2色譜圖及基本概念v（1）色譜圖：混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨）色譜圖：混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動相依次流出色譜柱進入監(jiān)測器，監(jiān)測器的響應(yīng)流動相依次流出色譜柱進入監(jiān)測器，監(jiān)測器的響應(yīng)信號時間（或流動相體積）曲線，稱為色譜圖或信號時間（或流動相體積）曲線，稱為色譜圖或色譜流出曲線。色譜流出曲線。v（2）基線：在操作條件下，色譜柱出口沒有組分流）基線：在操作條件下，色譜柱出口沒有組分流出，僅有流動相流過監(jiān)測器，此時流出的曲線。出，僅有流動相流過監(jiān)測器，此時流出的曲線。v（3）色譜峰：當(dāng)樣品中的組

4、分隨流動相流入監(jiān)測器）色譜峰：當(dāng)樣品中的組分隨流動相流入監(jiān)測器時，監(jiān)測器的響應(yīng)信號隨時間變化所形成的峰形圖時，監(jiān)測器的響應(yīng)信號隨時間變化所形成的峰形圖形。形。v（4）峰形：對稱于峰尖的正態(tài)分布曲線。）峰形：對稱于峰尖的正態(tài)分布曲線。v拖尾峰、前伸峰拖尾峰、前伸峰2021-11-239洗脫曲線返回返回2021-11-23102021-11-2311（6）保留值保留值2021-11-2312 (7)(7)分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組色譜峰分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組色譜峰峰底寬度平均值之比。峰底寬度平均值之比。峰寬（峰寬（w w）：兩側(cè)拐點處所作的切線與峰底相交于兩點，）：兩側(cè)拐點

5、處所作的切線與峰底相交于兩點， 此兩點的距離。此兩點的距離。（見圖見圖）半高峰寬（半高峰寬（w w1/21/2) )：1/21/2峰高處的峰寬。峰高處的峰寬。峰高：峰頂點與峰底的垂直距離。峰高：峰頂點與峰底的垂直距離。峰面積：峰與峰底之間的面積。峰面積：峰與峰底之間的面積。標(biāo)準(zhǔn)偏差（標(biāo)準(zhǔn)偏差（）：）：0.607h0.607h峰高處的峰寬的峰高處的峰寬的1/21/2區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖?、半高峰寬、?biāo)準(zhǔn)偏差）區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖?、半高峰寬、?biāo)準(zhǔn)偏差） w=4w=4 2/ ) 12(12wwttrrrr1完全分離2021-11-2313流動相與固定相平均濃度流動相與固定相平均濃度達(dá)傳質(zhì)平衡時的一段柱高達(dá)傳質(zhì)平衡

6、時的一段柱高（22/1)(54. 5wtnr2)(16brwtn nlh 2021-11-23142021-11-2315 pharmacia kta pharmacia kta 層析系統(tǒng)層析系統(tǒng) 2021-11-2316調(diào)糊調(diào)糊預(yù)裝一定量的溶劑或緩沖液預(yù)裝一定量的溶劑或緩沖液連續(xù)加入懸膠液連續(xù)加入懸膠液打開出口閥：層析劑沉降打開出口閥：層析劑沉降排除空氣排除空氣檢查均勻度檢查均勻度4.4.色譜分離操作色譜分離操作（1）裝柱與平衡）裝柱與平衡2021-11-2317（2）上樣（吸附）v樣品處理：樣品處理：v(1(1）溶解）溶解va. a. 調(diào)整濃度調(diào)整濃度vb. b. 鹽鹽vc. ph c.

7、ph v(2) (2) 過濾：除去不溶物過濾：除去不溶物v流速：流速：根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定v上樣量：上樣量：80%80%吸附容量吸附容量2021-11-2318（3）淋洗v鹽濃度鹽濃度vph ph v表面活性劑（表面活性劑（0.1-0.5%)0.1-0.5%)v淋洗體積：根據(jù)流出液雜蛋白濃度而淋洗體積：根據(jù)流出液雜蛋白濃度而定定v防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)2021-11-2319（4）洗脫方法v按操作方式按操作方式va a 恒定洗脫恒定洗脫 (isocratic elution)(isocratic elution)vb b 分步洗脫分步洗

8、脫 (stage elution)(stage elution)vc c 梯度洗脫梯度洗脫 (gradient elution) (gradient elution) 按洗脫機理按洗脫機理專一性洗脫（專一性洗脫（specific elutionspecific elution） 非專一性洗脫（非專一性洗脫（nonspecific elutionnonspecific elution） 添加劑：乙二醇添加劑：乙二醇, nacns, nacns 、脲素、鹽酸胍、脲素、鹽酸胍 洗脫體積：洗脫體積：5 5倍床體積倍床體積2021-11-2320（5）清洗與再生v弱酸：弱酸：hachacv堿：氨水堿：氨

9、水v促溶劑：促溶劑：1-3m kcns1-3m kcns， 6-8 m 6-8 m 尿素，尿素，6 m6 m鹽酸胍鹽酸胍v極性溶劑：極性溶劑：20% 20% 乙醇乙醇v表面活性劑：吐溫表面活性劑：吐溫-80-80v緩沖液平衡緩沖液平衡2021-11-2321v離子交換色譜離子交換色譜v凝膠過濾凝膠過濾v吸附色譜吸附色譜v親和色譜親和色譜v分配色譜分配色譜v疏水作用層析疏水作用層析2021-11-2322（1 1）離子交換色譜）離子交換色譜2021-11-2323常用的離子交換劑常用的離子交換劑2021-11-2324離子交換柱層析操作離子交換柱層析操作v樹脂的選擇樹脂的選擇v樹脂的預(yù)處理及轉(zhuǎn)型

10、樹脂的預(yù)處理及轉(zhuǎn)型v裝柱及平衡裝柱及平衡（要保持均勻、無氣泡和斷層）（要保持均勻、無氣泡和斷層） 首先加入首先加入1/3h的起始緩沖液或水；其次加入樹脂使樹的起始緩沖液或水；其次加入樹脂使樹脂借助水的浮力緩慢自然沉降；最后用水或緩沖液平衡到脂借助水的浮力緩慢自然沉降；最后用水或緩沖液平衡到所需要的條件，如特定所需要的條件，如特定ph、離子強度等。、離子強度等。 上樣上樣：將溶解在少量溶劑中的試樣加到柱上部：將溶解在少量溶劑中的試樣加到柱上部 洗滌與洗脫：洗滌與洗脫：改變改變ph或離子強度或離子強度 收集與檢測收集與檢測2021-11-2325elution (ml)protein (mg/ml

11、)nacl (mol/l)00.20.40.60.800.20.40.60.8104080120160200240na clprotein怛定洗脫怛定洗脫 2021-11-2326volume (ml)protein (mg/ml)nacl (mol/l)00.10.20.30.400.20.40.60.804080120160200240naclprotein分步洗脫分步洗脫 2021-11-2327volume (ml)protein（mg/ml)nacl (mol/l)00.10.20.30.40.50.600.10.20.30.40.50.60.704080120160200240pr

12、oteinnacl (c) (c) 梯度洗脫梯度洗脫2021-11-2328（2）凝膠過濾）凝膠過濾原理：原理： 凝膠過濾所用的基質(zhì)具有凝膠過濾所用的基質(zhì)具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，篩孔直篩孔直徑一致，且呈珠徑一致，且呈珠裝顆粒物質(zhì)，這種物質(zhì)裝顆粒物質(zhì)，這種物質(zhì)可以完全或部可以完全或部分排阻分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可讓其在篩孔中自由擴散和滲透。些小分子化合物，但可讓其在篩孔中自由擴散和滲透。因此，混合物分子大小不同，通過介質(zhì)所需阻力不同，因此，混合物分子大小不同，通過介質(zhì)所需阻力不同，從而被分離。從而被分離。流出

13、順序：流出順序：大分子大分子中等分子中等分子小分子小分子2021-11-23292021-11-23302021-11-2331v分配系數(shù)分配系數(shù)va.a.公式公式vb.b.大小排阻程度（大小排阻程度（0 0100%)100%)vvtvt( (床體積）床體積） rr2 2h h 外水體積（外水體積（v v0 0）+ +內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（v vi i）+ +顆粒實際占有體積顆粒實際占有體積(vg)(vg) (i) (i)完全排阻組分完全排阻組分 kavkav0 ve0 vev0v0（iiii）部分排阻組分）部分排阻組分 kavkav（0-10-1）（iiiiii）完全進入膠孔組分）完全進入膠孔

14、組分 kavkav1 ve1 vevtvt00vvvvkavte2021-11-2332凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)v葡聚糖凝膠（葡聚糖凝膠（sephadexsephadex） 由葡聚糖由葡聚糖+ +環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成 sephadexsephadex g 10 15 25 50 75 100 200 g 10 15 25 50 75 100 200v瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（sepharosesepharose）天然凝膠）天然凝膠 sepharosesepharose 2b 4b 2b 4bv聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（biobiogelgel） biobiogel p2 p

15、4 p100gel p2 p4 p100等（編號等（編號100100為排阻現(xiàn)）為排阻現(xiàn)）疏水性凝膠疏水性凝膠應(yīng)用：分離、濃縮；脫鹽；測定分子量應(yīng)用：分離、濃縮；脫鹽；測定分子量2021-11-2333（3）吸附色譜2021-11-2334柱色譜的操作柱色譜的操作吸附劑的選擇吸附劑的選擇v（1 1）依據(jù)）依據(jù)a.a.比表面積大比表面積大b.b.顆粒均勻顆粒均勻c.c.穩(wěn)定性強穩(wěn)定性強d.d.成本低成本低e.e.分辨率高（對不同的物質(zhì)有不同的解吸能力）分辨率高（對不同的物質(zhì)有不同的解吸能力）如：極性吸附劑易吸附極性化合物；但便于解吸，極性如：極性吸附劑易吸附極性化合物；但便于解吸，極性化合物，應(yīng)選

16、擇極性較小的吸附劑化合物，應(yīng)選擇極性較小的吸附劑2021-11-23352021-11-2336u柱色譜的操作柱色譜的操作2021-11-2337薄層吸附色譜2021-11-2338薄層吸附色譜（操作）v制板制板：硅膠：硅膠g g板，硅膠板，硅膠cmccmc板板v點樣點樣：少量多次、：少量多次、d d3mm、邊、邊 1.52cmv展開展開：密閉容器、提前配好展開劑；溶劑不能浸沒：密閉容器、提前配好展開劑；溶劑不能浸沒樣品點；展完后劃前沿及樣品移動距離樣品點；展完后劃前沿及樣品移動距離v檢測檢測：紫外線照射；噴霧顯色；碘蒸汽等：紫外線照射；噴霧顯色；碘蒸汽等2021-11-2339（4）分配色譜）分配色譜2021-11-23402021-11-2341（5）親和色譜 利用高分子化合物可以和與它們相對應(yīng)的配利用高分子化合物可以和與它們相對應(yīng)的配基，進行特異并可