黃連HPLC數(shù)字化指紋圖譜探究和7種生物堿含量測定

1、連hplc數(shù)字化指紋圖譜探究和7種生物堿含量測定摘要該文建立了峨眉地區(qū)道地藥材黃連的hplc 數(shù)字化指紋圖譜，并將其在全國不同主產(chǎn)區(qū)的黃連測定中進 行了應(yīng)用，同時測定黃連中7種季胺型生物堿的含量，為科 學(xué)評價與有效控制黃連質(zhì)量提供依據(jù)。采用diamonsil c18 色譜柱(4、6 mmx250 mm, 5 um),流動相乙睛-0、025mol l-1kh2p04 溶液(磷酸調(diào) ph 3、0) (40 : 60),內(nèi)含 sds 1、 7 g l-1,流速 1、2 ml min-1,檢測波長 345 nm,柱溫 40 °co運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典 委員會)進行分析

2、，10批次峨眉產(chǎn)黃連樣品得到的指紋圖譜 相似度均大于0、99,標(biāo)定共有峰10個，并對其中8個色譜 峰進行了歸屬。全國5個黃連主產(chǎn)區(qū)樣品與峨眉產(chǎn)黃連進行 相似度分析比較，整體相似度高。同時對黃連藥材中 groenlandicine,非洲防己堿，藥根堿，表小槃堿，黃連堿, 巴馬汀，小漿堿7種主要生物堿進行了含量測定。該方法靈 敏度高、專屬性強，hplc指紋圖譜結(jié)合生物堿含量測定能全 面反應(yīng)其內(nèi)在質(zhì)量，為黃連的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞黃連；hplc；指紋圖譜；含量測定收稿日期2013-05-03基金項目科技部國家科技支撐計劃重點項目(2007ba140b05)；中國博士后科學(xué)基金第6批特別資助項

3、 目(2013t60863)通信作者*張浩，教授，博士生導(dǎo)師，tel: (028) 85503037, e-mail： zhanghhxvip、sina、com 黃連為毛萇 科植物黃連copt is chinensis franch、的干燥根莖，常用 中藥材，主產(chǎn)于四川峨眉、洪雅、彭州，重慶石柱、巫山， 湖北利川等地1,其中峨眉?xì)v來是黃連的道地主產(chǎn)區(qū)，栽 培歷史悠久，在歷代本草名醫(yī)別錄、唐本草、本草綱 目等中均有記載2。黃連中所含的生物堿主要有小漿堿、 巴馬汀、黃連堿、表小漿堿、藥根堿等3-4季胺型生物堿。 小樂堿及其衍生物除了具有抗炎抗菌5-6的作用外，還在 治療腫瘤7-10、糖尿病11-1

4、4,心血管疾病15-16、高 血脂17、腦缺血性損傷18等多方面具有藥理作用。中藥 的化學(xué)成分復(fù)雜，在質(zhì)量控制中采用單一成分或某幾個成分 難以反映中藥材的整體特征，建立簡便可行的指紋圖譜方 法，確定其特征的共有峰圖譜，是從整體上控制其質(zhì)量已成 為普遍運用的方法19-21 o本文采用hplc,選擇了四川峨 眉地區(qū)具代表性的10批次黃連藥材樣品進行了分析測定， 以生物堿類成分作為評價指標(biāo)，建立了峨眉山地區(qū)黃連藥材 的生物堿指紋圖譜，確定了 10個共有峰，其分離度和重現(xiàn) 性均較好，同時測定了7種季胺型生物堿的含量。并且為了 準(zhǔn)確反應(yīng)與評價生物堿類成分在黃連內(nèi)的形成、積累等與環(huán) 境影響因素的關(guān)系，本文

5、將所建立的方法在全國不同主產(chǎn)區(qū) 進行了應(yīng)用，結(jié)果表明整體相似度均在0、99以上，但在生 物堿的含量上存在較大差異。1材料shimadzu lctoatvp 高效液相色譜儀（lc-10atvp 泵、 spd-loavp 紫外檢測器、cto-olasvp 柱溫箱、scl-loavp 系 統(tǒng)控制器、class-vp色譜工作站）；diamonsil c18色譜柱（4、6 mmx250 mm, 5 um）；中藥色譜指紋圖譜相似度評 價系統(tǒng)（中國藥典委員會2004a）； bp211d 1/10萬電子天 平（德國sartorius公司）；kq3200超聲波清洗器（昆山超 聲儀器有限公司，工作頻率40 khz

6、,超聲功率120 w）； ph 計（phs-3c型，上海雷磁）。乙月青（美國fisher公司）色譜純，水為超純水，其他 試劑均為分析純。黃連對照藥材、鹽酸小菓堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；黃連堿、表小樂堿、 非洲防己堿、groenlandicine.木蘭花堿由作者分離、純化 制備，并經(jīng)紅外、紫外、核磁、質(zhì)譜鑒定，純度均達(dá)99% （相 對純度）以上。黃連藥材由作者采集及四川大學(xué)華西藥學(xué)院標(biāo)本室提 供，經(jīng)四川大學(xué)華西藥學(xué)院生藥教研室張浩教授鑒定為黃連 c、chinensis的干燥根莖，見表1。表1黃連藥材樣品table 1 samples of coptidis

7、rhizomano、采集地點no、采集地點1四川峨眉山市龍池鎮(zhèn)高萬 村9四川峨眉山市川主鄉(xiāng)荷葉村2四川峨眉山市龍池鎮(zhèn)陶淵 村10四川峨眉山市大為鎮(zhèn)中山村3四川峨眉山市龍池鎮(zhèn)金 川村11四川彭州白鹿鎮(zhèn)4四川峨眉山市龍池鎮(zhèn)富友村12四 川峨眉山市洪雅高廟5四川峨眉山市沙溪鄉(xiāng)林壩村13湖北 利川6四川峨眉山市高廟鎮(zhèn)黃茅村14四川巫山7四川峨眉 山市高橋鎮(zhèn)張溝村15重慶石柱8四川峨眉山市龍門鄉(xiāng)楊林 村2方法與結(jié)果2、1色譜條件流動相為乙月青-0、025 mol - l-1kh2p04溶液（磷酸調(diào) ph 3、0） （40 : 60）,內(nèi)含十二烷基硫酸鈉（sds） 1、7 g l-1 ；檢測波長 345

8、nm ；流速 1、2 ml min-1 ；柱溫 40 °c ； 進樣量5 ulo2、2對照品溶液的制備分別精密稱取鹽酸小葉堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、 黃連堿、表小漿堿、groenlandicine非洲防己堿適量于10 ml量瓶中，加甲醇-鹽酸（100 : 1）溶解并稀釋至刻度，其 質(zhì)量濃度分別為 1、772, 0、193, 0、384, 0、300, 0、300, 0、261, 0、234 g - l-1,作為對照品儲備液。2、3供試品溶液的制備取黃連根莖細(xì)粉（過40目篩，干燥至恒重）約0、lg, 精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇-鹽酸（100 ：1）溶液 50 ml,稱定總質(zhì)量，

9、冷浸過夜，超聲提取60 min,補足失 重，搖勻，0、45u m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。2、4黃連藥材hplc指紋圖譜的建立2、4、1精密度試驗 取同一供試品溶液（s1）連續(xù)進 樣5次，記錄色譜圖，以小樂堿色譜峰為參照峰，計算指紋 圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有 峰的相對保留時間的rsd表6各對照品線性回歸方程（n=6）table 6 the linear equations for alkaloids ofcoptidis rhizoma (n=6)對照品回歸方程r線性范圍/ u ggroenlandiciney=3365 646x+2 2320、999 90、01

10、3 65 1、305 非洲防己堿y=2 313 531x+3 0220、 999 80、 01170 1、 170鹽酸藥根堿 y二3 250 482x-24 1300、999 80、019 20 1、920表小槃堿 y=3 167 575x-5320. 999 90、015 00 1、500黃連堿 y=3 087 858x-8 3810、999 80、015 00 1、500鹽酸巴馬汀 y=2 632 197x-27 1580、999 60、009 65 0、965 鹽酸小漿堿 y二3 043 733x-150 3550、999 70、088 60 8、0、47%, 1、04%, 2、65%,

11、 1、89%, 8、65%； rsd 分別 為 1、0%，1、6%, 0、92%, 0、55%, 1、6%, 0、73%, 2、3%o 表明本方法的重復(fù)性良好。2、5、4穩(wěn)定性試驗取藥材細(xì)粉（s1,過40目篩，干 燥至恒重）約0、lg,精密稱定，按2、3項下操作，制得供 試品溶液，分別于制備后0, 2, 4, 6, 8, 10, 24 h,取樣 測定，結(jié)果顯示樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。測得 groenlandicine非洲防己堿、藥根堿、表小漿堿、黃連堿、 巴馬汀、小糜堿的rsd分別為1、2%, 2、1%, 1、7%,1、9%, 1、6%, 1、6%, 2、7%o表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定

12、。2、5、5加樣回收試驗 取藥材細(xì)粉（s1,過40目篩， 干燥至恒重）約0、05g,精密稱定，分別精密加入小漿堿、 巴馬汀、藥根堿、黃連堿、表小樂堿對照品高、中、低加入 量各3份，按2、3項下方法測定，并計算加樣回收率。測 得高加入量時，groenlandicine非洲防己堿、藥根堿、表 小樂堿、黃連堿、巴馬汀、小樂堿的回收率分別為100、2%, 99、 7%, 100、 2%, 100、 1%, 102、 4%, 100、 0%, 102、 1%, rsd 分別為 0、5%, 0、7%, 0、5%, 0、1%, 0、6%, 0、7%, 0、8% （n=3）；中加入量時，groenlandic

13、ine非洲防己堿、 藥根堿、表小槃堿、黃連堿、巴馬汀、小篥堿的回收率分別 為 98、8%, 101、8%, 102、5%, 101、4%, 98、3%, 101、7%, 97、5%, rsd 分別為 0、2%, 0、8%, 0、3%, 1、3%, 0、3%, 0、5%, 1、4% （n=3）；低加入量時，groenlandicine、非洲 防己堿、藥根堿、表小菓堿、黃連堿、巴馬汀、小漿堿的回 收率分別為 100、1%, 98、3%, 100、7%, 104、1%, 99、2%, 98、2%, 102、5%, rsd 分別為 0、2%, 0、9%, 0、3%, 0、 4%, 1、3%, 1、2%

14、, 0、7% （n=3）o結(jié)果表明本方法符合分 析方法學(xué)要求。2、5、6含量測定結(jié)果在選定的色譜條件下，取各供 試品溶液5卩l(xiāng)注入高效液相色譜儀。計算各生物堿含量。 含量測定結(jié)果見表7。3討論3、1流動相的選擇黃連中所含生物堿屬于季鞍型生物堿，因此采用反相離 子對色譜法進行試驗。經(jīng)試驗測定，在甲醇-水混合溶液中 加入適量sds作為流動相時，巴馬汀和小糜堿的吸收峰難以 達(dá)到基線分離。而使用乙睛-水混合溶液系統(tǒng)，加入適量sds 作為離子對試劑，并加入適量kh2p04作為緩沖劑時，分離 效果較好。在此基礎(chǔ)上，分別考察了流動相中kh2po4濃度、 sds濃度和ph對分離的影響。3、1、1流動相中kh2

15、po4濃度的影響采用diamonsil c18柱，在乙睛-水（磷酸調(diào)ph為3、0）（40： 60）,內(nèi)含sds1. 7 g. l-1的溶液中，加入不同濃度（0、010、05 mol l-1） kh2p04作為流動相，345 nm檢測。分別取groenlandicine、 非洲防己堿、藥根堿、表小樂堿、黃連堿、巴馬汀和小糜堿 7種生物堿對照溶液進樣，測定tr,并以容量因子l的倒 數(shù)對kh2p04濃度作圖，結(jié)果見圖4。圖4流動相中kh2p04濃度對k，-1的影響fig、4 the influence of concentration of kh2p04 on capacity factor (kz

16、 -1)從圖4可以看出，當(dāng)kh2p04濃度大于0、03 mol l-1 時，藥根堿與表小漿堿的色譜峰完全分離，但藥根堿與非洲 防己堿的色譜峰出現(xiàn)部分重合，當(dāng)kh2p04濃度為0、05 mol l-12個色譜峰完全重合；當(dāng)kh2p04濃度小于0、025 mol l-1時，藥根堿、表小槃堿和非洲防己堿的色譜峰三者可 基本完全分離，但隨著kh2p04濃度的降低，小漿堿色譜峰 的保留時間也隨之延長。當(dāng)kh2p04濃度為0、01 mol l-1 時，小樂堿色譜峰的tr=94 mino在kh2p04濃度為0、025 mol -l-1時藥根堿、表小漿堿和非洲防己堿的色譜峰三者可基 本完全分離，小槃堿保留時間

17、也適當(dāng)，小樂堿吸收峰的tr=51 mino所以，確定0、025 mol lt為kh2p04的最佳濃度。 色譜圖見圖5。1.小樂堿；2.巴馬汀；3.黃連堿；4.表小樂堿；5.藥根 堿；6.非洲防己堿；7. groenlandicine ； 8.木蘭花堿。 圖5黃連藥材色譜圖fig. 5 the chromatograms of coptidis rhizoma3、1、2流動相中sds濃度的影響邱曉星，晁若冰等 21-22就sds濃度對黃連藥材中生物堿的分離度的影響進 行了詳盡的考察。在其研究基礎(chǔ)上，本文僅考察乙騰-0、025 mol l-1kh2p04 溶液（磷酸調(diào) ph 為 3、0） （40

18、: 60）溶液 中，加入1、70, 3、40 g - l-l sds溶液的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 隨著sds濃度的增加，各生物堿的保留時間均有所減少，但 當(dāng)sds為3、4 g l-1時，藥根堿與非洲防己堿的色譜峰完 全重合。因此確定sds的最佳質(zhì)量濃度為1、7 g - l-lo3、1、3 ph的影響由于藥根堿含有酚務(wù)基，所以當(dāng)流 動相未加入酸時，藥根堿的色譜峰有拖尾現(xiàn)象。加入磷酸， 調(diào)節(jié)kh2p04溶液的ph至3、0時，藥根堿與非洲防己堿的 色譜峰峰形可明顯改善。3、2非洲防己堿色譜峰的歸屬非洲防己堿早在20世紀(jì)60年代就曾從黃連中分離得到 單體23,但未檢索到關(guān)于非洲防己堿含量測定的報道，也 未檢

19、索到關(guān)于在hplc圖譜中對非洲防己堿色譜峰歸屬的報 道，因此有學(xué)者認(rèn)為非洲防己堿是在提取分離過程中生成的 化合物。本文在考察hplc色譜條件時發(fā)現(xiàn)，在藥根堿色譜 峰的前面有一個與其峰面積相當(dāng)?shù)奈粗V峰（tr=27、5 min）,又未檢索到與此色譜峰相關(guān)的文獻(xiàn)報道。因此，就此 點本文對黃連藥材進行化學(xué)成分的提取分離及鑒定，得到了 高純度的非洲防己堿，達(dá)到非洲防己堿對照品的要求，并在 hplc指紋圖譜中對其色譜峰進行了歸屬和含量測定。經(jīng)測定 非洲防己堿在黃連藥材中含量在0、60%0、87%o另外，本 文所測定的藥根堿在0、52%0、74%,測定結(jié)果比以往文獻(xiàn) 22, 24所報道的藥根堿含量的1/

20、2左右，從圖5a與b的 比較中明顯可見a法測定的藥根堿的含量實際為藥根堿與非 洲防己堿的總和。因此本文所采用的方法更準(zhǔn)確地測定了黃 連藥材中藥根堿與非洲防己堿的含量，澄清了非洲防己堿是 在提取分離過程中生成的化合物這一觀點。4結(jié)論本文選取了四川峨眉山地區(qū)具有代表性的10個黃連的 主要產(chǎn)區(qū)的黃連藥材樣品，采用hplc進行測定，以生物堿 類成分為評價指標(biāo)，建立了黃連的指紋圖譜，其分離度和重 復(fù)性良好。通過比較確立了 10個共有峰；采用與對照品比 較的方法，確定了其中8個峰的歸屬，分別為小樂堿、巴馬 汀、黃連堿、表小漿堿、藥根堿、非洲防己堿 groenlandicine 和木蘭花堿。通過對黃連指紋圖

21、譜的研究，10批次黃連根莖 樣品的共有峰占總峰面積均大于98%,整體相似度均大于0、 99,在峨眉地區(qū)這一生長環(huán)境、氣候條件適合黃連的生長， 其生物堿類成分的種類及相對含量一致。本圖譜的應(yīng)用范圍 擴大到全國各黃連主要產(chǎn)區(qū)，整體相似度均在0、99以上， 表明同種黃連由于相同的遺傳背景決定了其生物堿的種類。 但是，相對含量上存在一定差異，表明生長環(huán)境對生物堿的 積累具有一定的影響。作者收集的道地產(chǎn)區(qū)峨眉山市不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)產(chǎn)10批次黃連 采用本方法進行分析，小樂堿、巴馬汀、黃連堿、表小藥堿 的含量高于藥典對其含量的規(guī)定，說明峨眉地區(qū)產(chǎn)黃連為優(yōu) 質(zhì)藥材。本實驗建立了黃連指紋圖譜研究方法，實驗方法簡便、 快捷

22、、重復(fù)性好，能夠較好地反映黃連藥材中化學(xué)成分的特 征，為深入研究黃連活性成分的積累及變化規(guī)律，全面評價 黃連藥材和含黃連制劑的質(zhì)量提供了一種有效手段。參考文獻(xiàn)1 徐國鈞，徐珞珊.常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究 m.福州：福建科學(xué)技術(shù)出版社，1992： 505.2 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草m. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999, 7： 213.3 park k d, lee j h, kim s h, et al. synthesis of 13- (substituted benzyl) berberine and berberrubine derivatives as ant

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34、uced in ef mei, and apply it in the determination of rhizoma coptidis herbs produced in main producing areas nationwide, while determining the content of seven quaternary ammonium alkaloids contained in coptidis rhizoma, in order to provide basis for scientific evaluation and effective control over quality of rhizoma coptidis、 diamonsil c18 column (4、6 mmx250 mm, 5 y m) was adopted and eluted with acetonitrile 0、 025 mol l1 kh2p04 solution (adjust ph to 3、0 with h3p04) (40 : 60) containing sds 1、7 g lt、 the f 1 ow rate was 1、2 ml min-1, the detective wavelength was 34