標記免疫技術

1、羅紅醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO四年三月標記免疫技術=抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術+標記技術標記免疫技術免疫測定技術免疫組化技術示蹤物及標記技術放射免疫技術熒光免疫技術酶免疫技術化學發(fā)光技術金免疫技術 第八章第八章 放射免疫技術放射免疫技術 類型：類型：l放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）l免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA） 廣義放射免疫技術還包括放射受體分析（使用受體測量抗原）和放射配體結合分析（使用配體研究受體）。 特點:靈敏度高(10-9-10-15g/L)、

2、特異性強、 重復性好等標記物:常用的核素有兩大類射線： 131I、125I、57Cr和60Co射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I 性質活潑、易制備標記物 對被標記物的免疫活性影響小 測量方法簡便、已推廣 半衰期較長、核素豐度高標記方法125I的標記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：l直接標記法 氯胺T法和乳過氧化物酶法l間接標記法 聯(lián)接標記法適用分子 原理特點缺點直接標記 肽類、蛋白質、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團操作簡便、易標記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標記間接標記 甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團,需添加可避免氧

3、化還原劑對被標記物活性的損傷等添加基團可能影響被標記物活性標記物純化 對游離的125I等試劑與標記物進行分離 方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）標記物鑒定l放射化學純度 單位標記物中結合在被標記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95。l免疫活性 標記過程中，被標記物活性損傷程度。B/T80， B/T 抗原損傷。l比放射性 單位化學量標記物中所含的放射性強度. 常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。 比放射性 方法更靈敏；過高 輻射自損傷大，對標記物免疫活性影響大，儲存穩(wěn)定性差 ?？寡彖b定 多克隆抗體的抗血清是

4、放射免疫分析的主要試劑之一，其質量直接影響方法的特異性和靈敏度。l親合力 選用親和常數(shù)K值大(1091012 L/mol)抗血清l特異性 其程度可直接影響結果的準確性 l滴度 最大稀釋度。在本技術方法中是指結合50標記抗原時的抗血清的稀釋度。放射免疫分析（ RIA ）基本原理 采用定量的標記抗原（Ag）和非標記抗原（Ag）競爭性結合有限量特異性抗體（Ab）的反應。 以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數(shù)關系。B/F 60() 50 40 30 20 10 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 Ag(ng/ml) 測定方法與步驟1.抗原抗體反

5、應：平衡法或非平衡法2.分離結合與游離標記物 沉淀劑沉淀復合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過程不影響反應平衡；操作簡便，重復性好且經(jīng)濟。 3.放射性測定及數(shù)據(jù)處理 晶體閃爍計數(shù)儀(射線)或液體閃爍計數(shù)儀( 射線) 繪制標準曲線，計算待檢抗原濃度。 免疫放射分析（IRMA）基本原理 單位點IRMA： 利用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物，反應平衡后，用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標記抗體并將其分離，測定上清液的放射量。l雙位點IRMA 先用固相抗體與抗原反應結合,然后再用過量的標記抗體與已結合于固相抗原的另一

6、抗原決定簇結合,形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物,洗棄反應液中剩余的標記抗體,測定固相上的放射性。IRMA與RIA的異同點 l標記物標記物 在RIA中 核素標記抗原，抗原有不同種類，根據(jù)其化學結構，標記時需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素標記抗體?？贵w為蛋白質，有利于碘化標記，不同抗體標記方法基本相同。標記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。l反應速率 反應速度與反應物的濃度呈正比，在IRMA中標記抗體是過量的，而且不存在競爭性結合復雜的反應，所以反應速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應用親和力較低的單克隆體也能得到滿意的結

7、果。l反應原理 RIA為競爭抑制，測得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競爭結合，劑量反應曲線為正相關的直線關系。l特異性 在雙位點IRMA中，一般均應用針對不同位點的單克隆抗體，其交叉反應率低于應用多克隆抗體的RIA。 l檢測范圍 通常RIA的工作范圍為2-3個數(shù)量級，而RIMA可達3個數(shù)量級以上。 l分析誤差 RIA中加入的抗體和標記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴重影響測定結果。IRMA中標記和固相抗體在反應中都是過量的，只有受檢標本的加樣誤差才會影響分析結果。因此，IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。l其他 RIA可以測定大分子量與小分子量的物質，雙位點IRMA只能測定在分子上具有2個

8、以上抗原表位的物質。在RIA中應用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來源豐富、特異性較高的單克隆抗體。 放射免疫技術的應用 常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標志物和藥物等微量物質的測定。 問題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長不易自動化儀器分析等。第九章 免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence technique)是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。 是將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種方法。 基本原理 利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本中的待檢抗原特

9、異結合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾色板發(fā)出一定波長的光，使結合在標本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀察底物片上熒光染色形態(tài)，來判斷有無待檢抗原或抗體。第一節(jié) 熒光的基本知識異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITCFITC） 為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為為黃色或橙黃色結晶粉末，分子量為389.4389.4，最，最大吸收光波長為大吸收光波長為490-495nm490-495nm，最大發(fā)射光波長，最大發(fā)射光波長520-520-530nm530nm，呈現(xiàn)明亮的，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光黃綠色熒光，是應用最廣泛的熒，是應用最廣泛的熒光素。光素。主要優(yōu)點：主要優(yōu)點：人眼對黃綠色較為敏感；人

10、眼對黃綠色較為敏感；通常切片通常切片標本中的綠色熒光少于紅色，標本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾 。四乙基羅丹明（四乙基羅丹明（RB200RB200） 為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波丙酮。性質穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為長為570nm570nm，最大發(fā)射光波長為，最大發(fā)射光波長為595595600nm600nm，呈，呈橘紅色熒光橘紅色熒光。常用于雙重標記或對比染色。常用于雙重標記或對比染色。 四甲基異硫氰酸羅丹明（四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITCTRITC） 最大吸引光波長為最大吸引光波長為550nm5

11、50nm，最大發(fā)射光波長，最大發(fā)射光波長為為620nm620nm，呈，呈橙紅色熒光橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。質結合，但熒光效率較低。 熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，一些化合物對熒光有猝滅作用，因此熒光物質的保存應注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光抗體的制備熒光抗體的制備 作為標記的熒光素應符合以下要求作為標記的熒光素應符合以下要求： 應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。 熒光效率高,與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。

12、 熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。 與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質，與蛋白質的結合物穩(wěn)定，易于保存。 標記方法簡單、安全無毒。熒光抗體是將熒光素（如FITCFITC）與特異性抗體以化學方式共價結合而成。 標記方法：攪拌法(適合大樣品) 透析法(適合小樣品)標記抗體的純化：透析法 層析分離法 F/PF/P比率： 將制備的熒光抗體稀釋至A A2802801.01.0，分別測讀A A280280（蛋白質特異吸收峰）和標記熒光素的特異吸收峰 F/PF/P值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以F/PF/P1.51.5為宜，用于活細胞染色的以F/

13、PF/P2.42.4為宜。 抗體效價：效價越大標記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價在1:16-1:32者較為理想 抗體特異性 ：免疫電泳和交叉免疫電泳觀察特異性沉淀線或沉淀峰，在紫外線照射下發(fā)出強烈熒光 第二節(jié) 免疫熒光顯微技術基本原理：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。 直接法直接法 熒光抗體染色直接法優(yōu)點：操作簡便、特異性高、非特異 熒光染色因素少，缺點：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體間接間接法間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也

14、可檢測抗體。免疫熒光技術在醫(yī)學檢驗中的應用l在細菌學檢驗中主要用于菌種的鑒定。l免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷常用方法之一。l用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。l在寄生蟲感染診斷中，間接免疫熒光試驗（IFAT）是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。 l免疫熒光法還是檢測自身抗體的好工具，在自身免疫病的實驗診斷中應用廣泛。其突出優(yōu)點是能以簡單方法同時檢測抗體和與抗體起特異反應的組織成分，并能在同一組織中同時檢查抗不同組織成分的抗體。l熒光抗體技術的一種特殊應用是流式細胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測細胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細胞亞群等的檢測。

15、 第十章第十章 酶免疫技術酶免疫技術 第一節(jié) 酶免疫技術概述基本原理 利用酶催化底物反應的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學反應的檢測敏感性的一種標記免疫技術。 基本特點： 標記后保留酶和抗原(抗體)的活性 酶促反應專一性，保證特異性 底物反應放大作用，提高敏感性 酶標試劑保存穩(wěn)定 操作簡便，安全易行主要試劑的制備與要求一、酶與酶作用底物（一）用于標記酶的要求：l酶活性高l標記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性l酶催化底物后信號易判定或測定l酶活性不受樣品中其他成分的影響l酶、輔助因子及底物理化性質穩(wěn)定，安全無害，價廉（二）常用酶及其底物1.辣根過氧化物酶（HRP） 常用底

16、物：l鄰苯二胺（OPD）：反應顯橙黃色，應避光，致癌性l四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應后呈藍色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。2. 堿性磷酸酶（AP） 常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。 * AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標記物收率 低于HRP，且價高，故應用不如HRP普及。二、酶標記抗體或抗原l基本要求： 酶標記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化l 酶標記方法 1.交聯(lián)法 以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法 用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體

17、（抗原）結合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標記物制備。三、固相載體l基本要求 結合容量高，結合穩(wěn)定；可與抗原抗體復合物等大分子蛋白結合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟。l固相載體的種類與選擇1.塑料制品 材料經(jīng)濟，操作簡便，易于自動化，最常用。2.微顆粒 結合容量大，反應迅速，逐漸普遍用于自動化分析。3.膜載體 硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應用于定性或半定量的斑點ELISA。四、免疫吸附劑原理：非共價鍵吸附或共價鍵化學偶聯(lián)（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：15牛血清白蛋白或520小牛血清。 酶免疫技術的分類

18、 酶免疫組化 用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體用于檢測組織切片或細胞涂片中的抗原和抗體 酶免疫技術 均相酶免疫測定 酶免疫測定 固相酶免疫測定 異相酶免疫測定 （ELISA） 液相酶免疫測定l 均相酶免疫測定Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E 基本原理：利用酶標抗體結合抗原形成復合物后，標記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復合物與游離酶標抗體分離的情況下，直接測定系統(tǒng)中總的標記酶活性的改變，進而推算出待檢樣品中的抗原量。l異相酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA） 基本原理：在抗原抗體反應后，先將抗原抗體復合物與游離的酶標抗體分離，再測定酶標記的復合物催化底物

19、顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結合的標記物。固相EIA：固相載體結合酶標復合物，經(jīng)洗滌去除游離的酶標抗體。如ELISA。Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) l使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性持其免疫活性 l在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起

20、反應體表面的抗原或抗體起反應l用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。中受檢物質的量成一定的比例。 l加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析顏色反應的深淺進行定性或定量分析ELISAELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗可用于測定抗原，也可用于測定

21、抗體，在這種測定方法中有體，在這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑：v固相的抗原或抗體，固相的抗原或抗體，v酶標記的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，v酶作用的底物。酶作用的底物。 1雙抗體夾心法特點：l非競爭結合反應l常用于抗原的檢測l適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測l所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇 2間接法3.競爭法特點：l用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進行測定。l酶標Ag（Ab）與樣品或標準品中的非標記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結合的能力。l反應體系中，固相Ab（Ag）和酶標Ag（Ab）是固定限

22、量的，且前者的結合位點少于酶標記與非標記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。l反應后，結合與固相載體上復合物中被測定的酶標Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標記Ag（Ab）的濃度成反比。4.捕獲法（反向間接法） 主要用于 血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。 基本原理： 固相抗IgM待檢標本(IgM)抗原(與特異抗體結合)E酶標抗體底物 第三節(jié) 膜載體的酶免疫測定 固相膜免疫測定與ELISA相類似,其特點是以微孔膜作為固相.標記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素膜。類型：免疫滲濾試驗：穿流形式 免疫層析試驗：橫流形式 斑點酶免疫吸附試驗（dot-ELISA）

23、免疫印跡法 (Western blot) 免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT） 亦被稱為Western blot分三個階段進行 :lSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）l電轉移 l酶免疫定位 lSDS-PAGE 抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶） l電轉移 將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉移即可完成。此分階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見。 l酶免疫定位 將印有蛋白質條帶的硝

24、酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區(qū)帶染色。陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA-PAGE加入的分子量標準，確定各組分的分子量。 第四節(jié) 酶免疫測定的應用病原體及其抗體廣泛應用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、病原體及其抗體廣泛應用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如鏈球菌、結核分風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如鏈球菌、結核分枝桿菌、幽門螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲如弓形體、阿米枝桿菌、幽門螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲如弓形體、阿米巴、瘧原蟲等。巴、瘧原蟲等。蛋白質如各種免疫球蛋白、補體組分