毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥指紋圖譜中的研究

1、毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥指紋圖譜中的研究摘要：通過指紋圖譜建立療效與化學(xué)成分的關(guān)聯(lián)，探索指紋圖譜與藥效的聯(lián)系，闡明色譜圖中指紋峰、特征峰與中藥功效的關(guān)系，可從中藥療效的角度出發(fā)，全面地研究中藥的各種活性成分，建立“譜”“效”關(guān)系，毛細(xì)管電泳技術(shù)無疑是一種很有應(yīng)用前景的方法，它可以從整體上表征中藥組分的特征,同時可以從整體上表征中藥組分與受體發(fā)生相互作用前后組分種類與數(shù)量的變化, 全面評價其質(zhì)量的優(yōu)劣，是一種科學(xué)的中藥質(zhì)量控制的新模式。關(guān)鍵詞：功能化；中藥指紋圖譜；毛細(xì)管電泳技術(shù)1 毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥指紋圖譜的意義1.1 功能化中藥指紋圖譜功能化中藥指紋圖譜1(TCM-FP)指中藥材經(jīng)

2、過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，獲得其中的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用現(xiàn)代分析技術(shù)，對物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)信息的表達(dá)，并與這些化學(xué)物質(zhì)的藥理學(xué)參數(shù)或藥效學(xué)表達(dá)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，通過能夠表示該中藥材特性的共有峰的圖譜和相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行“譜”“效”關(guān)系的表征。1.2 藥效學(xué)表達(dá)或藥理學(xué)參數(shù)在現(xiàn)代生理學(xué)、藥理學(xué)研究中，常常選用一些指標(biāo)對藥物的療效以及機(jī)體對藥物的反應(yīng)進(jìn)行定性定量的描述。藥物分子與生物大分子的結(jié)合常數(shù)Kb可評價藥物與受體的結(jié)合程度、強(qiáng)度，可用于活性成分的初步篩選。藥物在體內(nèi)各種pH值環(huán)境下存在狀態(tài)的解離常數(shù)pKa在藥理學(xué)上可以為在分子水平上研究藥物的吸收、傳送及與受體結(jié)合提供重要的信息。此外，藥物在體內(nèi)的油水分配系數(shù)logPo

3、w，可為化合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力提供有益的參考。亦可利用對復(fù)雜樣品中未知化合物的某種官能團(tuán)的識別，從一定程度上評價該復(fù)雜樣品的某種活性。1.3 毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)勢毛細(xì)管電泳技術(shù)2（Capillary Electrophoresis，CE）是離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力，在毛細(xì)管中按其淌度、分配系數(shù)不同進(jìn)行高效、快速分離的一種電泳技術(shù)。CE的特點(diǎn)：1、多分離模式多，使得其分離對象范圍廣，幾乎涵蓋了中藥中存在的所有組分；2、快分析速度快，分析時間一般為幾十秒到幾分鐘；3、好分離效能好，每米理論塔板數(shù)在105以上； 4、省分析費(fèi)用省，進(jìn)樣體積小，一般為納升級。一種中藥材通常含有多種有效成分,其化學(xué)組分

4、結(jié)構(gòu)復(fù)雜,種類繁多，而且在藥材中含量往往不高,采用普通的分離分析方法難以實(shí)現(xiàn)完全的分離和定量測定；要想整體地研究中藥的各種活性化學(xué)成分，建立“譜”“效”關(guān)系，CE則不失為一種對中藥復(fù)雜多組分進(jìn)行同時分離分析的有效手段，同時可以從整體上表征中藥組分與受體發(fā)生相互作用前后組分種類與數(shù)量的變化,初步反映中藥組分的藥理作用機(jī)制。2 毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥指紋圖譜中的應(yīng)用2.1 CE在中藥活性成分研究中的應(yīng)用據(jù)報道，目前主要研究的中藥活性成分有以下六大類：生物堿類、黃酮及黃酮苷類、有機(jī)酚酸類、蒽醌類、香豆素類及皂苷類 2。2.11 生物堿類（Alkaloids）生物堿在自然界中分布很廣，一般都具有強(qiáng)

5、烈的生理活性，有些甚至有巨毒（如烏頭中所含的烏頭堿）。因此建立生物堿的分析方法就顯得十分重要。在中草藥的毛細(xì)管電泳分析中，它是被研究得最多的一類標(biāo)志性化合物。由于生物堿在低pH下通常荷正電，所以生物堿常常能在pH低于7的緩沖溶液中得到分離分析。目前多采用CZE模式來分析中藥中的生物堿。李琴韻等3采用CZE法對中國藥典收載的3個不同品種的14個吳茱萸樣品(不同產(chǎn)地)中所含吳茱萸堿進(jìn)行含量測定,同時還在兩種波長下,建立了吳茱萸樣品的高效毛細(xì)管電泳色譜指紋譜,能將3種不同品種的吳茱萸明顯地區(qū)分,揭示了其內(nèi)在質(zhì)量,方法準(zhǔn)確、簡便。2.1.2 黃酮（Flavonoids）及黃酮苷類（Flavonoid

6、Glycosides）黃酮類化合物大多是中性分子，多采用MECC及CZE兩種模式分離，而其中以MECC為多。臺灣的Lin Yingmei4等報道用MECC模式分析黃芩中黃酮成分，并將黃芩中6種主要黃酮類化合物進(jìn)行了分離，線性關(guān)系較好。2.1.3 有機(jī)酚酸類（Organo - Phenolic Acids）有機(jī)酚酸類成分解離后帶負(fù)電荷，以CZE模式分析時在中性成分后出峰，分析時間較長?？稍诰彌_液中加入陽離子表面活性劑CTAB(十六烷基二甲基季胺溴)等，將電滲流(EOF)改向，稱逆電滲流(Reversed EOF)，使出峰順序先后依次為負(fù)離子，中性分子、正離子，可縮短分離時間。范國榮等5進(jìn)行了四倍

7、體板藍(lán)根中五種有機(jī)酸成分的毛細(xì)管電泳分離分析。此方法大改善了HPLC法的分析成本高，溶劑有毒等缺點(diǎn)，并且提高了靈敏度。2.1.4 蒽醌類（Anthraquinones）蒽醌類成分是許多中藥的有效成分，尤以二元或三元羥基蒽醌及它們的衍生物廣泛存在于植物性的瀉藥中，可用CZE及MECC模式來分析。宗玉英等6用CZE及MECC分離了大黃中5種蒽醌類化合物，還測定了掌葉大黃、唐古特大黃和藏邊大黃中的蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸。2.1.5 香豆素類（Coumarins）據(jù)文獻(xiàn)報道7，以CZE分離模式可分離野菊花中7種香豆素類化合物，還分析測定了獨(dú)活中9種香豆素類成分等。2.1.6 皂苷類（Saponin

8、s）藥材中的皂苷類化合物不帶電荷,一般采用MECC分離模式。巖上等8采用MECC分離了人參甲醇提取液中的7種人參皂苷Rbl、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg，重現(xiàn)性好。2.2 微乳液毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥指紋圖譜中的應(yīng)用微乳液毛細(xì)管電泳技術(shù)(MEEKC)作為常規(guī)毛細(xì)管電泳的補(bǔ)充，它的優(yōu)勢在于對于復(fù)雜組分的分離分析，特別是對于疏水性物質(zhì)的增溶作用，使其在多組分分離分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。2.2.1 藥物分子與生物大分子的結(jié)合常數(shù)Kb顏磊9等利用MEEKC對天麻提取物與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用進(jìn)行了動態(tài)的表達(dá)，對建立具有藥物與生物大分子相互作用表達(dá)能力（Kb）的指紋圖譜的方法進(jìn)行

9、探索，建立表達(dá)相互作用的功能化指紋圖譜，評價藥物與受體的結(jié)合程度、強(qiáng)度，為篩選中藥提取物中的活性成分提供了一種研究的思路。2.2.2 藥物在不同pH值環(huán)境下的解離常數(shù)pKa陶然10等以模擬人體胃腸道內(nèi)生物環(huán)境10mmol/L的磷酸緩沖液（pH分別為4.0、5.4、6.2、7.0、8.5、9.3）為MEEKC電泳行為的緩沖液，研究各種pH值狀態(tài)下的pKa，得到刺五加提取物的不同電泳行為，并將刺五加提取物電泳行為的變化作為指紋圖譜對其在機(jī)體消化道內(nèi)的解離情況進(jìn)行了闡述、并說明了其吸收狀況。2.2.3 藥物的油水分配系數(shù)logPow蔣雪梅11等利用MEEKC對女貞子中齊墩果酸的油水分配系數(shù)logPo

10、w進(jìn)行研究，藥物的logPow可用于預(yù)測其腸道吸收情況,一般認(rèn)為logPow 為2 3 的藥物在腸道中較易被吸收12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明齊墩果酸的logPow為3.90，脂溶性較強(qiáng),這與其不溶于水、略溶于氯仿的性質(zhì)相符。同時推測齊墩果酸口服不易吸收, 從而為制備有效的齊墩果酸制劑提供了依據(jù),可通過在齊墩果酸中添加適當(dāng)?shù)奈沾龠M(jìn)劑、或制成相應(yīng)的鹽以提高溶解度,改善其在腸道的吸收。2.2.4 對藥物功能團(tuán)的篩選陶然13等在MEEKC分離分析條件下，利用大黃中-羥基蒽醌類物質(zhì)與醋酸鎂反應(yīng)很可能生成了在電泳緩沖液中能穩(wěn)定存在的產(chǎn)物。因此，在沒有標(biāo)準(zhǔn)對照品以及提取物成分未知的情況下，便可實(shí)現(xiàn)對大黃中-羥基蒽醌

11、類物質(zhì)的識別和篩選。3 毛細(xì)管電泳技術(shù)在功能化中藥材指紋圖譜中存在的問題與展望以CE為技術(shù)手段，針對目前中藥質(zhì)量控制存在的不足以及現(xiàn)行中藥指紋圖譜研究的局限性，提出了功能化中藥指紋圖譜的概念。以MEEKC測定藥物的油水分配系數(shù)logPow14為例，首先，測定是基于藥物在微乳液滴相和水連續(xù)相中的分配作用。若分析物不呈電中性，那么它除了存在分配作用之外，自身還具有有效淌度，其分離機(jī)理并不僅僅歸因于分配的作用，在此情況下獲得的logPow值是不準(zhǔn)確的。因此，MEEKC測定中藥logPow值的前提是：標(biāo)準(zhǔn)化合物及待測藥物在所存在的溶液中保持電中性。但是，人體的生理環(huán)境可能使原本不帶電荷的藥物帶上不同的

12、電荷，并非呈現(xiàn)簡單的電中性狀態(tài)。因此，研究荷電藥物在細(xì)胞膜中的分配，了解其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程及快慢，具有實(shí)際的研究意義。其次，歷年來人們采用標(biāo)記法得到微乳液的遷移時間tme值，但是采用標(biāo)記tme需要用疏水性極強(qiáng)（完全不溶于水）的化合物作為乳液相標(biāo)記物，以降低待測藥物的濃度、進(jìn)樣量、以及高電場對其遷移行為的影響，但是不可能存在完全溶于微乳油相而不在水相中有任何分配的化合物。另外，也很難將這樣的化合物溶于水相體積分?jǐn)?shù)占多數(shù)的試樣中，如果tme標(biāo)記物在水相中有一點(diǎn)溶解，最后測得的藥物的logPow值就會偏大。并且，微乳相標(biāo)記物的疏水性較強(qiáng)，其出峰往往很慢，一般需要30min以上，使分離進(jìn)程耗時。因此，對

13、現(xiàn)行MEEKC測定logPow所存在的問題，建立改進(jìn)型微乳液毛細(xì)管電泳技術(shù)，對中藥的活性成分、作用機(jī)制及藥效作出準(zhǔn)確的預(yù)測和評價，成為亟待解決的問題。參考文獻(xiàn)1 喻錄容.建立中藥指紋圖譜方法的研究現(xiàn)狀J.華夏醫(yī)學(xué), 2004 ,17(4):645-647.2 陳靜,林慧瓊,鄧小煌.毛細(xì)管電泳技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用J.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2003,19(1):72.3 李琴韻,洪筱坤,王智華,等.高效毛細(xì)管電泳法測定吳茱萸中吳茱萸堿的含量J.藥物分析雜志，2004,20(6):370.4 Liu YM et al. J Chromatogr，2003,639:3235 范國榮,胡晉紅,李博華，等

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