免疫電子顯微鏡操作方法

1、免疫電子顯微鏡操作方法(Pre-embedding法)所用溶液的配制方法0.4M PB貯存液注意：用超純水（milliQ水）配制。 pH=7.3-7.4Na2HPO420.6g41.2gNaH2PO42H2O5.2 g10.4 g500 ml1000 mlNa2HPO412H2O52 g104 gNaH2PO42H2O7.2 g14.4 g500 ml1000 ml流程1. 組織的固定2. 固定液洗凈（梯度蔗糖置換）3. 冰凍切片制作4. 抗原抗體反應（一抗、二抗）5. 前固定 1-2.5% glutaraldehyde （戊二醛）6. 銀增感反應（暗室）7. 后固定（鋨酸）8. 包埋塊染色

2、（醋酸鈾）9. 酒精系列脫水10. 樹脂包埋 聚合11. 修塊12. 超薄切片13. 電子染色14. 觀察冰凍切片1. 制作冰凍切片。厚度通常是10um2. 冰凍切片放入切片架，用吹風機吹干（冷風）。3. 取出余下的冰凍包埋塊，用鋁箔紙包好，放-80度保存。4. 吹風機30分鐘以上吹干。之后開始進入抗原抗體反應步驟5. 暫時不用的冰凍切片，放入硅膠（干燥用），完全密閉（自封袋，封口膜等）后置于-80度保存。下次使用前，升至室溫后再開封（防止生成水氣）?？乖贵w反應1. 用鑷子將多余的冷凍包埋劑剔除。2. 用免疫組化筆圈住組織3. 放入0.1MPB中浸洗，室溫，5分鐘4. Blocking so

3、lution, 室溫，20分鐘 1% BSA， 10%正常血清（與二抗同種動物），0.005% saponin， 0.1M PB或 5% 正常血清 + 0.2% Triton X-100 + 0.1M PB5. 一抗用blocking solution稀釋（約1-2ug/ml），室溫孵育1h后，4度下2-3夜。6. 0.1M PB 4次x10分鐘7. 金標二抗in blocking solution（1.4 nm colloidal gold，nano probe公司，50-100倍稀釋），室溫孵育1h后，4, 2夜。（參考文獻附后）8. 下面進入銀加強反應。銀加強反應-包埋試劑準備：1. s

4、ilver enhancement kit（購自Nanoprobes）。放入-20度保存前，tube內(nèi)分裝保存。使用當天早上從-20度冷柜中取出，至室溫后使用。全程遮光。2. 25 % gultaraldehyde (戊二醛)/0.1 M PB， 貯存使用。洗凈二抗：0.1M PB 10min X 4次 （PB絕對要使用MilliQ水。銀反應過程中有Cl-不可。）前固定：a) 1 % gultaraldehyde (GA，戊二醛)/0.1 M PB， RT 510 min （25%GA 40ul + 0.1M PB 960ul）b) 洗凈 0.1M PB 10min X 2次c) 洗凈 Mil

5、liQ水（超純水），5min x 3次銀加強反應：要準備的試劑、物品等² 已經(jīng)從-20度升到室溫的silver enhancement kit² 暗室（現(xiàn)在的顯微鏡室，門上遮擋，注意反鎖）² 桌上型漩渦儀（vortexer）² 紙毛巾（吸水，不易破）² 15ml試管² 1ml的移液器和槍頭² 大的玻璃瓶（裝廢水用）² 玻璃瓶或燒杯（裝MilliQ水或超純水 500ml-1000ml）銀加強反應（暗室內(nèi)進行）1. 桌上鋪上紙質(zhì)毛巾（吸水性強）、注意sliver enhancement kit試劑各瓶的編號。2. 打開

6、安全燈。3. 按照每張切片kit內(nèi)每種液體50-100ul的量，按紅、白順序放入15ml食管，vortex。4. 將切片上多余的水分吸干后，將切片鋪在紙質(zhì)毛巾上（注意防止切片干燥）5. 步驟3的試管內(nèi)加入kit內(nèi)的藍色液體，vortex。6. 將混好的反應液4-5滴加在切片上（覆蓋全組織）。反應時間各季節(jié)有所差別：冬季（室溫15度以下）14-16min； 春秋季（RT15-20度）12-14min； 夏季（RT20度以上）8-10min。暗室中的溫度一般情況下比較高，冬天7-10min，夏天3-5min即可。7. 用超純水洗 3-4分8. 鏡檢。染色較淡的情況下，再進行一次增感反應。接下來的步

7、驟需要在電鏡室完成（要準備1ml移液器和槍頭）。事先配制3%鋨酸stock和0.2M PB stock，放入4度冰箱內(nèi)保存。后固定（準備濕盒）：1. 排風櫥內(nèi)。1.5ml EP管。3%鋨酸stock和0.2M PB stock以1：1混合，制成1.5%鋨酸/0.1M PB。1張切片100ul的量。2. 密閉的濕盒內(nèi)4度，1小時。完全密閉（parafilm封閉濕盒，再用密封袋封閉）。3. MilliQ水（超純水）洗凈。5min x 2次。Block staining（事先配制醋酸鈾和乙醇）4%醋酸鈾/50%乙醇（超純水），濕盒內(nèi)4度，30min。乙醇系列脫水（50%，70%和80%乙醇事先放入冰

8、箱內(nèi)）50%-70%- 80%（4度下，5-10min each）-90%-95%-無水I-無水II-無水III（室溫， 5-10min each）*此步驟非常重要，脫水不充分極易導致樹脂剝離時的失敗。環(huán)氧樹脂包埋（配制方法見后）1. -20度保存的Epon，先待升至室溫后使用。注意遮光、防濕。2. 剪掉Beem-capsule（SPI Supplies and Structure Probe, Inc.）的蓋，用Epon填充。3. 將切片放置在紙質(zhì)毛巾上，擦掉切片上的乙醇。4. 乙醇完全干燥后，向切片滴下幾滴Epon，注意防止切片干燥（切片上絕對不可殘留乙醇）。5. 此步驟重要：將填充Epo

9、n的Beem-capsule倒立于切片上，迅速立起來。注意避免Epon溢出。6. 聚合儀內(nèi)鋪上鋁箔，將切片鋪好，60度，48hr。7. Epon的配制方法。² 在通風櫥內(nèi)先稱量Epon812 RESIN（樹脂），DDSA EM grade（硬化劑，量越多，樹脂越軟），MNA（量越多，樹脂越硬，與DMP-30一樣）。塑料容器內(nèi)攪拌（封閉，加蓋）。攪拌好后，加入DMP-30，繼續(xù)攪拌，約3分鐘。² 特點：Epon812可以根據(jù)樣品的不同調(diào)節(jié)硬度。收縮幅度很小，對染色的效果影響很小。² 保存：遮光、干燥環(huán)境下。使用后用parafilm封口，放入自封袋，-20度冰箱內(nèi)保存

10、。解凍時特別要注意遮光。完全達到室溫后取所需的量后，繼續(xù)放入-20度保存。² 注意：Epon812對皮膚有害。注意防護。環(huán)氧樹脂（EPON）組成硬組織用 (100 g) (50 g)Epon812 RESIN 54.12 g 27.06 gDDSA EM grade 12.48 g 6.24 gMNA 33.40 g 16.70 gDMP-30 1.00 g 0.50 g軟組織用 (100 g) (50 g)Epon812 RESIN 50.97 g 25.48 gDDSA EM grade 29.37 g 14.68 gMNA 19.66 g 9.83 gDMP-30 1.00 g

11、 0.50 gTAAB 公司推薦Epon812 48 gDDSA EM grade 19 gMNA 33 gDMP-30 2 g修塊1. 切片上用Beem-capsule包埋后，從恒溫箱內(nèi)取出后冷卻至室溫。2. 將加熱板（可用烤片機）加熱至50-60度。3. 將切片放置在加熱板上，逐漸加熱，從capsule的周圍將刀片插入切片和樹脂之間。4. Capsule的邊緣和切片之間有一定的空隙后，將Beem-capsule放倒，連續(xù)幾次重復放倒的動作，直至將capsule取出為止。注意溫度控制，過高或過低都不可。5. 將分開的Beem-capsule用臺虎鉗鉗住、將有組織的一面用線鋸切掉3mm，暴露組

12、織。余下的部分用裁紙刀將capsule拿掉。6. 用光學顯微鏡檢查，切片的位置用mark筆標記。要切掉的部分的用mark筆標記。7. 將多余的部分用剃刀、錘子的沿著事先畫好的線切掉。8. 用aron alpha強力膠水套裝（放在4度冰箱內(nèi)保存）將上面修好的切片固定在樹脂臺上。9. 注意標記好樣品編號。在解剖顯微鏡下繼續(xù)修塊。玻璃刀切片（暴露組織）鉆石到切片電子染色：通常染色 鈾20 min + 鉛 5-10 min。但是免疫電鏡的情況下，為了突出染色效果，通常只染一種（鈾或鉛）。觀察攝影Molecular Transmission Electron MicroscopyCryoelectron

13、 Microscopy1. Aoki, T.; Hagiwara, H., and Fujimoto, T.: Peculiar Distribution of Fodrin in Fat-Storing Cells; Exp. Cell. Res., 234, 313-320 (1997). 2. Boisset, N., Penczek, P., Pochon, F., Frank, J., and Lamy, J. Three-dimensional reconstruction of human alpha 2-macroglbulin and refinement of the lo

14、calization of thiol ester bonds with monomaleimido Nanogold;. Ann. NY Acad. Sci., 737, 229-44 (1994). 3. Boisset, N., Grassucci, R., Penczek, P., Delain, E., Pochon, F., Frank, J., and Lamy, J.N. Three-dimensional reconstruction of a complex of human alpha-2-macroglobulin with monomaleimido Nanogold

15、; (Au1.4nm) embedded in ice. J. Struct. Biol., 109;39-45 (1992). 4. Jeon, H., and Shipley, G. G. Localization of the N-Terminal Domain of the Low Density Lipoprotein Receptor. J. Biol. Chem., 275, 30465-30470 (2000). o Abstract (html) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). o Reprint (PDF

16、) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). o Manuscript as submitted (PDF) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). 5. Jeon, H., and Shipley, G. G. Vesicle-Reconstituted Low Density Lipoprotein Receptor: Visualization by Cryoelectron Microscopy. J. Biol. Chem., 275, 30458-30464 (

17、2000). o Abstract (html) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). o Reprint (PDF) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). o Manuscript as submitted (PDF) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). 6. Montesano-Roditis, L.; Glitz, D. G.; Traut, R. R., and Stewart, P. L.:

18、Cryo-electron microscopic localization of protein L7/L12 within the Escherichia coli 70S ribosome by difference mapping and Nanogold labeling. J. Biol. Chem., e-publication ahead of print. o Abstract (html) (courtesy of the Journal of Biological Chemistry). o Manuscript as submitted (PDF) (courtesy

19、of the Journal of Biological Chemistry). 7. Wagenknecht, T,; Berkowitz, J.; Grassucci, R.; Timerman, A. P., and Fleischer, S.: Localization of calmodulin binding sites on the ryanodine receptor from skeletal muscle by electron microscopy. Biophys. J., 67, 2286-2295 (1994). 8. Wilkens, S. and Capaldi

20、, R.A. Monomaleimidogold Labeling of the g subunit of the E. coli F1 ATPase examined by cryoelectron Microscopy. Arch Biochem. Biophys., 229, 105-109 (1992). 9. Woldin, C. N.; Hing, F. S.; Lee, J.; Pilch, P. F., and Shipley, G. G.: Structural studies of the detergent-solubilized and vesicle-reconstituted insulin receptor