單核細胞增生李斯特氏菌的研究進展

1、單核細胞增生李斯特氏菌的研究進展摘要：單核細胞增生性李斯特氏菌是人類一種重要的食源性致病菌，單核增生李斯特氏菌的危害近 年來引起世界各國食品和衛(wèi)生部門的廣泛關(guān)注.本文主要闡述了單核細胞增生性李斯特氏菌的生長 特性，包括生物學特性、流行病學、致病性的一些研究，以及對該菌的傳統(tǒng)分離方法、免疫學檢 測方法、核酸檢測等方法的最新進展進行了綜述，為進行該菌的準確、快速檢測奠定了基礎(chǔ).關(guān)鍵詞：單核細胞增生性李斯特氏菌，生物學特性，檢測方法research advance on listeria monocytogenesdong qiancollege of food science, southwest

2、 university, chongqing 400715, chinaabstrac t: listeria monocytogenes is one of the important food-derived pathogens for human, and listeria monocytogenes have been paid close attention by public health and food bureaus the world over. the growth characteristic including biological characteristics,

3、epidemiological, pathogenic, epidemiology, and recent advances of listeria monocytogenes detection methods, including traditional detection procedures, immunity detection patterns and nuclear acid assays were reviewed thus, a foundation of rapid and accurate detection methods of the bacteria were la

4、id.key word: listeria monocytogenes , biological characteristics , detection method由近年來關(guān)于單核増生李斯特氏菌的相關(guān)消息可知，李斯特菌病尤其是由單核增生李斯特氏菌引起的各類疾病已日益成為全球性疾病，引起了國際上的高度重視。更是 將其列為21世紀90年代食品中四大致病菌之一。因此對其特性的了解及研究在食 品安全方面是十分必要的?，F(xiàn)針對單核增生李斯特氏菌的基本特性，檢驗方法，以及研 究前景進行簡單闡述。李斯特氏菌屬的基本簡介目前國際上公認的李斯特氏菌屬共有7個菌種，除單核細胞增生李斯特氏菌外，還 有綿羊李斯特氏菌

5、(l. ivanvii)、英諾克李斯特氏菌(l. innocua)、威爾斯李斯特氏菌 (l.welshimeri)西爾李斯特氏菌(l. seeligeri)、格氏李斯特氏菌(l. grayi)以及墨氏李斯 特氏菌(l. murrayi),只有單核細胞增生李斯特氏菌與人的疾病密切相關(guān)。單核細胞增生李斯特氏菌革蘭氏陽性、無芽胞，為較小的桿菌或球桿狀菌，生長 溫度20°c50°c ,具周身鞭毛，有動力。在肉湯培養(yǎng)基中生長呈桿狀、球桿狀、鏈狀 等多種形態(tài)，該菌為兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基上生長良好。血瓊脂平板上的菌落小而 圓，凸起且光滑，直徑12mm,周圍有一窄小的b溶血環(huán)，卵育48

6、h后更清晰可見。 對血瓊脂平板的血源(兔、馬、羊或人)無特殊要求。木菌耐堿不耐酸，對熱較為敏感, 加熱50°c lomin可死亡。單核細胞增生李斯特氏菌可產(chǎn)生一種溶血作用的外毒素，致病性強，但不產(chǎn)生內(nèi)毒 素。該菌為一種胞內(nèi)菌，侵犯宿主后被巨噬細胞吞噬，并在其屮寄生繁殖。單核細胞增 生李斯特氏菌可分成16個血清型，4b和lb常見，致病性最強，其中l(wèi)b與hiv感染有 關(guān)。2生物學特性2.1形態(tài)與染色該菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小約為o.5umxl.o直或稍彎，兩端鈍圓, 常呈v字型排列，偶有球狀、雙球狀，在染色過重的玻片上菌體有柵欄狀排列的趨勢, 易誤認為白喉菌而錯判。兼性厭氧、無芽胞，一

7、般不形成莢膜，無芽胞，但在在營養(yǎng) 豐富的環(huán)境中如含血清的葡萄糖蛋白腺水中能形成粘多糖莢膜。在陳舊培養(yǎng)中的菌體可 呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。在2025°c環(huán) 境屮形成4根鞭毛，故在25%肉湯培養(yǎng)液中運動活潑，用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡 或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋 轉(zhuǎn)或翻滾樣的運動。2.2培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求不高，在2025°c培養(yǎng)24h可形成4根小鞭毛，有動力，36°c培養(yǎng) 時無鞭毛，動力消失。穿刺培養(yǎng)25天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可 見翻跟斗運動。該菌的生長范圍為242°c,最適培養(yǎng)溫度為3537

8、°c,在ph中性至 弱堿性(ph9.6)、氧分壓略低、二氧化碳張力略高條件下該菌牛長良好，在ph38能 緩慢生長，在6.5% nacl肉湯中生長好。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上36培養(yǎng)24 h呈細小、 半透明、微帶珠光的露水樣菌落，直徑約0. 2mm0. 4ram,在斜射光下，菌落呈典 型的藍綠色光澤。在固體培養(yǎng)基上菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著 菌落的增大，變得不透明。在57%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平 板培養(yǎng)后可產(chǎn)牛窄小的b 溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(tsaye)和改良 mcbride(mma)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，通

9、過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、 灰色或蘭灰色。2.3生化特性2.3.1?；匦越Y(jié)果總結(jié)該菌觸酶陽性，氧化酶陰性，能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、 水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉昔、蔗糖(遲發(fā)酵)、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵 木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖，不利用枸 椽酸鹽，40%膽汁不溶解，眄i口朵、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥 氨酸均陰性，vp、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。2.3.2具體生化鑒定方法(1) 過氧化氫酶試驗挑取tsa-ye平板上的菌落于潔凈的載玻片上，滴加1滴3%的過氧化氫溶液，30s 內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽性。(

10、2) 三糖鐵試驗將tsb-ye肉湯培養(yǎng)物分別接種于三糖鐵瓊脂(tsi, 35°c培養(yǎng)5d變黃為陽性， 變黑為產(chǎn)硫化氫(h?s) o(3) mr-vp 試驗將tsb-ye肉湯培養(yǎng)物接種于mr-vp肉湯中，35 °c培養(yǎng)48h。移取lml,培養(yǎng)物 于潔凈的試管屮，加5%荼酚溶液6ml,再加40%的氫氧化鉀溶液0.2ml,輕輕搖動試 管約lmin,靜置約20min,出現(xiàn)紅色為vp陽性反應;將剩余培養(yǎng)物35°c繼續(xù)培養(yǎng)48h, 加甲基紅指示劑5滴于試管中，出現(xiàn)紅色為mr陽性反應。(4) 尿素酶試驗用tsb-ye肉湯培養(yǎng)物穿刺接種于尿素瓊脂斜面上，35°c培養(yǎng)5d

11、逐日觀察。尿素 酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。(5) 硝酸鹽還原試驗用tsb-ye肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35°c培養(yǎng)5d后加入0.2ml甲液(08g /ml對氨基苯磺酸乙酸溶液，再加入乙液(0.5g/ml甲蔡胺乙酸溶液)，輕輕搖動混 合。如在12min內(nèi)出現(xiàn)紅色，判斷為陽性反應；如果沒有顏色反應，在含有甲液和 乙液的試管屮再加入少量鋅粉，放置lh如出現(xiàn)紅色，表示仍有硝酸鹽存在，未被細菌 還原，判斷為陰性。(6) 糖發(fā)酵試驗將tsb-ye肉湯培養(yǎng)物分別接種于含有0.5%七葉昔、甘露醇、鼠李糖、木糖的發(fā) 酵管中，35°c培養(yǎng)2448h ,陽性者由于發(fā)酵糖類產(chǎn)酸使培

12、養(yǎng)基變黃；陰性者繼續(xù)培 養(yǎng)到第5天。(7) 動力試驗將tsb-ye肉湯培養(yǎng)物垂直中心穿刺接種于半固體動力培養(yǎng)基，室溫(2025°c) 培養(yǎng)25d,逐fl觀察。李斯特氏菌，如在半固體培養(yǎng)基中呈典型的倒傘狀生長，底部 為彎月牙形，則表明有動力。(8) 溶血試驗將7%羊血平板底面劃分為2025個小格，每格刺種1個菌落。從每個tsb-ye 平板上至少挑取2個菌落刺種血平板，并刺種陽性對照菌和陰性對照菌，355°c培養(yǎng) 2448h。于明亮處觀察，單核增牛李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點周圍產(chǎn)牛狹 窄透明的b 溶血環(huán)；綿羊李斯特氏菌有大的透明b 溶血環(huán)；而其他李斯特氏菌不產(chǎn)生 溶血環(huán)

13、，為陰性。2.4血清學特征根據(jù)菌體(o)抗原和鞭毛(h)抗原,將單增李氏菌分成13個血清型，分別是l/2a、l/2b、 l/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab> 4c、4d、4e 和 “7” 13 個血清型。致病菌株的血清 型一般為 l/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a> l/2a 和 4b,后兩型尤多。2.5抵抗力該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和干草內(nèi)能長期存活，對堿 和鹽抵抗力強，在含1%4%nac 1的tsb2ye肉湯中生長良好；在含有 8% 12%nacl的tsb2ye肉湯中生長停滯；在含16%20%nacl的tsb2ye肉湯中菌數(shù) 有所下降

14、，但仍有部分殘存。但對熱的抵抗力較弱，60°c 30 rain. 80°c 1 rain即可全部 滅活。6070°c經(jīng)520min可殺死，70%酒精5min. 2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5% 福爾馬林20min可殺死此菌。對慶大霉素、萬古霉素、卡那霉素、頭孑包卩塞吩、頭飽瞠 咻、諾氟沙星、氧氟沙星、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素敏感；對依諾沙星和咲喃妥因耐藥 卩朔。3流行病學單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓, 在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動物很容 易食入該菌，并通過口腔糞便的途徑進

15、行傳播。據(jù)報道，健康人糞便中單增李氏菌的 攜帶率為0.616%,有70%的人可短期帶菌，48%的水產(chǎn)品、510%的奶及其產(chǎn)品、 30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加 熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜 色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占8590%的病例是由被污染的 食品引起的。該菌可通過眼及破損皮膚、粘膜進入體內(nèi)而造成感染，孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道 感染胎兒或新牛兒，棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是木病傳播的可 能途徑，且有上升趨勢。近十幾年來，單核細胞增生李斯特氏菌引起的發(fā)病率

16、日趨上升，國外有報道巴氏消 毒奶和墨西哥式奶酪曾引起單核細胞增生李斯特氏菌暴發(fā)性食物屮毒分別感染了 49人 和142人，病死率為28.16%33%。在美國和加拿大曾多次引起食物中毒，并確認該 菌和許多其他細菌一樣，是病死率較高的暴發(fā)性食物中毒的重要原因之一04致病性4.1致病物質(zhì)4.1.1溶血素o目前已知溶血素o與單核細胞增生李斯特氏菌毒力有關(guān)，由hly基因編碼，為單核 細胞增生李斯特氏菌的一種基本毒力因子，其最主要的作用為介導細菌溶解。溶血是單 核細胞增牛李斯特氏菌致病的一個重要標志，臨床分離的單核細胞增牛李斯特氏菌全部 溶血，不溶血的無毒性o4.1.2 acta 蛋白系由acta基因編碼的

17、表面蛋白，通過誘導細胞肌動蛋白分子的聚合作用促使細菌 在細胞與細胞之間的傳遞，同時也與細菌被宿主細胞內(nèi)化有關(guān)o4.3 p60蛋白p60蛋白是一種胞壁質(zhì)水解酶，由iap基因編碼。通常p60蛋口于細胞表面產(chǎn)生， 并大量分泌到生長介質(zhì)屮，對于細胞的分裂是必不可少的。分析p60蛋白編碼基因的突 變體顯示，對于單核細胞增生李斯特氏菌的吞噬細胞溶解作用以及對機體的感染過程， p60蛋白是一個重要的因素"273】。4.1.4磷脂酶c由plcb基因編碼，具有鋅依賴性，分為性質(zhì)不同的兩類，即磷脂酰肌醇磷脂酶c(pi plc)和磷脂酰膽堿磷脂酶(pcplc)。piplc系以活化的形式合成，而pcplc

18、則先以非活化的前肽被分泌出來，然后在胞外由mpl的基因產(chǎn)物mpl蛋白酶加工。p1 plc可輔助細菌逸出初級吞噬體，而細菌在細胞與細胞之間的擴散過程中，pc-plc 則表現(xiàn)出一定的活性作用o angelika grund 1.ing等通過利用誘導pcplc表達系統(tǒng)證明，缺乏llo的lm, pcplc的活性不僅 對在人類上皮細胞屮初級吞噬體的溶解是必需的，而且對細胞與細胞z間的擴散也是必 需的o4.1.5 prfa 蛋白系由prfa基因編碼，是一種轉(zhuǎn)錄因子，是李斯特菌所有基因簇(包括prfa本身) 轉(zhuǎn)錄激活所必需，是迄今鑒定岀的李斯特菌的唯一毒力調(diào)節(jié)蛋口 1161;在感染宿主細胞 的過程屮，對許多

19、毒力因子的等位表達起到關(guān)鍵調(diào)控因子的作用。4.2致病力與致病機理單核細胞增牛李斯特氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，寄牛物介導的細胞內(nèi)增牛，使它 附著及進入腸細胞與巨噬細胞；抗活化的巨噬細胞，單增李氏菌有細菌性過氧化物歧化 酶，使它能抗活化巨噬細胞內(nèi)的過氧物(為殺菌的毒性游離基團)分解；溶血素，即李 氏桿菌素6可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，為sh；活化的細胞溶素，有c（和b兩種， 為毒力因子【。4.3不同人群的臨床癥狀單核細胞增生李斯特氏菌進入人體是否得病與菌的毒力和宿主的年齡免疫狀態(tài)有 關(guān)，因為該菌是一種細胞內(nèi)寄生菌，宿主對它的清除主要靠細胞免疫功能，因此，易感 者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人，免疫

20、功能缺陷者。已知在下述條件下容易誘發(fā)成 人李斯特氏菌病，而且發(fā)病的死亡率極高：患腫瘤、艾滋病、灑精中毒、糖尿?。ㄓ绕?是i型）、心血管疾病、腎臟移植者和可的松皮質(zhì)激素治療者健康成人可出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，有患病嫌疑的成人，群毆主要癥狀是，發(fā)熱， 呼吸急促，岀血性皮疹，化膿性結(jié)膜炎，抽搐，昏迷，宮頸炎，常規(guī)淋巴結(jié)炎，膿血癥, 劇烈頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、敗血癥、腦膜炎甚至死亡。其屮，腦膜炎和膿血癥是最 常見的癥狀】。感染此病的孕婦（她們胎兒常被天牛感染）可能不會呈現(xiàn)任何癥狀，即使呈現(xiàn)癥狀 時，其癥狀也比較溫和，與流感的癥狀類似，其結(jié)果常有流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎。出生時被感染的新生兒患此病的典型癥狀是腦

21、膜炎，典型發(fā)病時間是在岀生后14 周5防治措施食品中分離到的單核細胞增牛李斯特氏菌均具有毒力基因，對人體健康有潛在威脅 及出現(xiàn)暴發(fā)感染危險，應引起衛(wèi)生部門的高度警惕。冷凍食品、生鮮奶、生畜禽肉和蔬 菜類是主要的危險食品，應加強監(jiān)測與管理。生鮮奶是細菌繁殖的良好基質(zhì)，其擠奶、 運輸環(huán)節(jié)的冷鏈條件無法有效抑制李斯特菌的繁殖，故其帶李斯特菌及單核細胞增生李 斯特氏菌的比率較高。單核細胞增生李斯特氏菌具有一定的熱抵抗能力，耐受巴氏消毒, 在6o°c下需20 min或70°c下需5 min才能殺死，一旦牛鮮奶巴氏殺菌不徹底，就有食 源性單核細胞增生李斯特氏菌病暴發(fā)的危險。冷藏肉類產(chǎn)品

22、單核細胞增生李斯特氏菌帶 菌率明顯高于其它產(chǎn)品，可能是由于單核細胞增生李斯特氏菌有嗜冷特性，在冷藏條件 下可生長繁殖，因此家庭貯藏于冰箱的食品不應存放太久，且在食用前應煮熟煮透。超 市等食品生產(chǎn)企業(yè)應定期對冷藏柜進行消毒。除此之外，美國cdc對一般人群推薦了降低李斯特氏菌病危險性的5條措施，ep： 生的動物性食品，如牛肉、豬肉和家禽，要徹底加熱；生食蔬菜食用前要徹底清洗；未 加工的肉類與蔬菜、已加工的食品和即食食品分開；不吃生奶（未經(jīng)巴氏消毒的）或用生 奶加工的食品；加工生食品后的手、刀和砧板要清洗。6檢測方法及對比討論6檢測方法6.1.1傳統(tǒng)檢測方法傳統(tǒng)檢測單核增生李斯特氏菌的方法是先需增菌

23、培養(yǎng)，再經(jīng)過分離及純化培養(yǎng)，然 后進行血清和生化方面的鑒定。6.1.2免疫學方法(1) 單克隆抗體檢測法該法是利用抗單核增生李斯特氏菌的特異單克隆抗體與菌特異表位抗原反應的原 理來進行檢測的。(2) 自動酶聯(lián)熒光免疫分析系統(tǒng)(vidas)法該方法【22辺3】是將免疫夾心法與熒光檢測法結(jié)合起來，即通過固定相吸附己知抗體, 已知抗體在捕捉目標生物體后與帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分洗脫，再通過激發(fā) 光源檢測，從而能自動讀出發(fā)光的陽性樣品。(3) 試劑盒法reveal試劑盒(241是一種利用側(cè)流式免疫色譜分析技術(shù)快速定性檢測李斯特氏菌的 方法。原理是特異性的抗單核增牛李斯特氏菌抗原的抗體被束縛在色

24、原載體上，樣品中 存在的抗原與藍色膠乳顆粒上的抗體結(jié)合形成抗原、抗體、色原復合物，此復合物穿過 側(cè)面流動膜時被i古i定在測試區(qū)的抗單核增生李斯特氏菌的硝酸纖維素膜捕獲并聚集，岀 現(xiàn)一條可見帶因而呈現(xiàn)陽性。6.1.3分子生物學技術(shù)檢測法(1) 基因探針法利用人工合成單核增生李斯特氏菌的某個基因(如溶血素o基因)的探針，并以32p 標記該探針，然后進行斑點雜交實驗進行檢測(2) pcr技術(shù)檢測法利用pcr技術(shù)檢測單核增牛李斯特氏菌的某個特異基因的方法，如編碼單核增牛 李斯特氏菌溶血素0的hly基因、編碼肌動蛋白聚集因子的acta基因、編碼內(nèi)化素b 的inlb基因等】。目前也有一些改進的pcr檢測技

25、術(shù)，女nims. pcr檢測技術(shù)】， 該方法是將免疫磁分離技術(shù)(immuno. magneticseparation, ims)與pcr技術(shù)相結(jié)合后來 進行檢測的。6.2方法對比經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌存在的問題是傳統(tǒng)方法耗時，工作量大，不適應當前對衛(wèi) 生微生物快速、準確、靈敏、特界檢測的要求。但在暴發(fā)流行病的檢測和污染源的追蹤 方而仍然不可替代，將作為黃金標準長期存在。免疫學方法檢測單增李斯特菌，也存在不少問題。制備針對單增李斯特菌單克隆抗 體很困難，需要專門的技術(shù)；商品化的單克隆抗體種類少，價格也較貴，使得免疫學檢 測成木相應增高。分子檢測與傳統(tǒng)方法相比，能大大減少工作量，一定程度上實現(xiàn)了靈敏、快速、特 異的檢