細(xì)胞工程學(xué)專業(yè)復(fù)習(xí)資料

1、緒論一細(xì)胞工程（Cell Engineering）：（定義）是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。分類（包括）:（填空）植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程：（定義） 以植物細(xì)胞組織為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物新個(gè)體，或獲得有用物質(zhì)的過程。動(dòng)物細(xì)胞工程：（定義）是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理，定向改變動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)從而獲得新型生物或特種細(xì)胞產(chǎn)品的

2、一門技術(shù)。2 （填空）細(xì)胞學(xué)說的提出：施旺，施萊登（1838年）3 1902年，H aberlandt提出了細(xì)胞全能性學(xué)說。第1章 基本技術(shù)1 濕熱滅菌：103-137kPa(121-126°C),15-30min.2 干熱滅菌：利用烘箱加熱到位60-180°C3 培養(yǎng)基基本成分：無機(jī)鹽（大量元素，微量元素），有機(jī)成分（激素，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑），水常用有機(jī)成分：糖類（蔗糖），維生素，肌醇，腺嘌呤，氨基酸激素：生長(zhǎng)素（根），細(xì)胞分裂素（芽），赤霉素（細(xì)胞伸長(zhǎng)）4 基本培養(yǎng)基種類：MS,B5,N6,White(P26)（1）高鹽平衡培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、BL培養(yǎng)基、BM

3、培養(yǎng)基和ER培養(yǎng)基。特點(diǎn)：無機(jī)鹽濃度較高，元素間的比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性；營(yíng)養(yǎng)豐富；微量元素種類全，濃度高。（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基及SH培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：硝酸鉀的含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的鹽酸硫胺素。（3）中鹽培養(yǎng)基：H培養(yǎng)基、Nitsch培養(yǎng)基、Miller培養(yǎng)基和Blaydes培養(yǎng)基。特點(diǎn)：大量元素?zé)o機(jī)鹽約為MS的一般，微量元素種類減少而含量增高，維生素種類比MS多。（4）低鹽培養(yǎng)基：White培養(yǎng)基、WS培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、改良Nitsch培養(yǎng)基及HB培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：無機(jī)鹽含量低，有機(jī)成分含量相對(duì)也很低。5 培養(yǎng)基配制：1000ml母液需10

4、0ml大量元素(10*),10ml微量元素(100*)1 培養(yǎng)基母液配制無機(jī)鹽按大量元素、微量元素和鐵鹽3部分分別配制。大量元素一般配制成（1020）×母液，微量元素和鐵鹽則配制成（100200）×母液。有機(jī)成分最好單獨(dú)配制。配好的母液需貯存于24冰箱中。植物激素使用的濃度很低，因此，一般分別配制成0.1-1mg/L濃度的溶液。2 培養(yǎng)基制備制備培養(yǎng)基時(shí)是根據(jù)實(shí)際需要配制，首先按大量元素、微量元素、鐵鹽及有機(jī)成分的順序，依次吸取各母液的需要量，加入一適當(dāng)體積的燒杯或其它配制培養(yǎng)基的容器中，再加入適當(dāng)體積的蒸餾水，并稱取相應(yīng)量的蔗糖放入其中溶解，調(diào)節(jié)pH值，加入瓊脂，加熱使其

5、完全融化，最后用蒸餾水定容并分裝。6 外植體：指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織，器官等材料。三種來源：1.生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物 2.在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物 3.無菌環(huán)境下培養(yǎng)的植物（最優(yōu)）。第2章 細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生一細(xì)胞全能性：（定義）一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整個(gè)體的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。 細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。2 細(xì)胞脫分化（cell dedifferentiation ）：（定義）培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化。分化細(xì)胞

6、 脫分化 分生細(xì)胞 再分化 分化細(xì)胞靜止細(xì)胞啟動(dòng)分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。蛋白體的出現(xiàn)和細(xì)胞質(zhì)密度增加被認(rèn)為是細(xì)胞開始脫分化的標(biāo)志。3 細(xì)胞分化（Differentiation）：（定義）是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。4 極性（polarity）：（定義）是指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。5 激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素。先用生長(zhǎng)素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時(shí)處理，則可促使分化頻率的提高。6 （簡(jiǎn)答）植物

7、的離體器官發(fā)生：是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。不定根、不定芽：是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織上發(fā)生的根或芽。器官發(fā)生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部長(zhǎng)出根進(jìn)而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽進(jìn)而形成完整植株。3）在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。七愈傷組織：實(shí)質(zhì)上是一團(tuán)無序生長(zhǎng)的細(xì)胞，這些細(xì)胞大多處于隨機(jī)分裂的狀態(tài)。（器官、組織培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞分裂首先發(fā)生在傷口部位）八體細(xì)胞胚或胚狀體（定義）：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形

8、成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。界定：1）體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚。2）體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚。3）體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑。研究體細(xì)胞胚的模式植物：胡蘿卜。九體細(xì)胞胚的形成途徑：（簡(jiǎn)答）1. 體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生：誘導(dǎo)階段;胚胎發(fā)育階段2. 間接發(fā)生：A.經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚的形成：誘導(dǎo)愈傷組織的形成誘導(dǎo)愈傷組織胚性化體細(xì)胞胚的形成 2，4-D(濃度高)2，4-D(濃度低) 2，4-D(濃度更低) B.經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚的形成：誘

9、導(dǎo)愈傷組織的形成誘導(dǎo)愈傷組織胚性化懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)體細(xì)胞胚的形成。十植株再生的兩種方式：器官發(fā)生，體細(xì)胞胚發(fā)生。第三章 體細(xì)胞遺傳變異一體細(xì)胞無性系：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無性系。體細(xì)胞無性系變異：由體細(xì)胞無性系表現(xiàn)出來的變異。從對(duì)生物遺傳的影響而言，細(xì)胞工程技術(shù)本身即包含了雙重性：遺傳穩(wěn)定性和變異性。基因表達(dá)（生長(zhǎng)素自養(yǎng)型變）異外遺傳變異：二離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性；變異的普遍性；變異的局限性；嵌合性三非遺傳變異生理適應(yīng)性變異四體細(xì)胞無性系變異的誘導(dǎo)與選擇：（愈傷組織>再生植株（變異）誘變起始材料的選擇原則：目標(biāo)性狀的可行性；試驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)技

10、術(shù)水平；適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型七設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)抗紋枯病的水稻突變體的選擇：（1）直接選擇（2）間接選擇：第四章 植物組織細(xì)胞培養(yǎng)一植物脫毒：利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)脫出植物細(xì)胞中侵染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。二脫毒 基本原理：病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性。三脫毒苗制備流程：索取材料的病毒檢測(cè) 外植體的選擇及預(yù)處理莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株 脫毒效果檢測(cè) 脫毒苗的保存與繁殖四（填空、簡(jiǎn)答）培養(yǎng)物的增殖方式：1.腋芽增殖2. 不定芽增殖3. 體細(xì)胞胚增殖4. 愈傷組織增殖五花藥培養(yǎng)（定義）：把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成為植株的過程。從培養(yǎng)類型來講，花藥培養(yǎng)仍然屬于器官培養(yǎng)的范

11、疇。花粉培養(yǎng)（定義）：又叫小孢子培養(yǎng)，是從花藥中分離除花粉粒，使之成為分散的或游離的狀態(tài)，通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化，進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程。花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。花粉培養(yǎng)取材時(shí)期：四分體小孢子時(shí)期；花藥培養(yǎng)取材時(shí)期：?jiǎn)魏送砥冢p核早期。六花藥培養(yǎng)的基本程序：外植體選擇外植體預(yù)處理外植體消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)分化培養(yǎng)。七花粉分離方法：（1）機(jī)械分離法：將花藥置于盛有少量液體培養(yǎng)基或與培養(yǎng)基等滲的蔗糖溶液的培養(yǎng)皿中，用平頭的玻璃棒或注射器內(nèi)管輕輕擠壓花藥，使其散出花粉。（2）花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：將經(jīng)過一定時(shí)間低溫處理的花藥，接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)天后，花藥開裂，釋放出花粉粒。（3）

12、磁拌法:將花藥接種于含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力攪拌器上，低速轉(zhuǎn)至花藥呈透明狀。八根據(jù)在培養(yǎng)中所取的外植體的部位不同，植物胚胎培養(yǎng)包括：胚培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)，胚珠培養(yǎng)，子房培養(yǎng)。九幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時(shí)期：多為球形胚至魚雷形胚階段。十幼胚離體培養(yǎng)的常見的生長(zhǎng)發(fā)育方式：胚性發(fā)育，早熟萌發(fā)，愈傷組織。十一懸浮培養(yǎng)：是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。應(yīng)用：1.愈傷組織誘導(dǎo)：要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。誘導(dǎo)愈傷組織選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植

13、體。誘導(dǎo)愈傷組織選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。2.懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)：一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件（簡(jiǎn)答）：A 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30-50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少會(huì)有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮體系。B 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮體系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白色或淡黃色。C 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2-3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。3. 懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)：P89圖5-6 （填空五個(gè)時(shí)期）延滯期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直線生長(zhǎng)期，減慢期，靜止期。（在減慢期進(jìn)行繼代培養(yǎng)）4.

14、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化：細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。（填空）同步化的方法：分選法；饑餓法；抑制劑法；低溫法P91十二。單細(xì)胞培養(yǎng)方法： 1、平板培養(yǎng) 2、看護(hù)培養(yǎng) 3、微室培養(yǎng) 4、雙層濾紙植板培養(yǎng)5、懸浮培養(yǎng)(簡(jiǎn)答)P86十三。培養(yǎng)條件下的植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累特性：1.生長(zhǎng)偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)成正比。如長(zhǎng)春花堿、煙堿的合成 2.中間型：產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長(zhǎng)下降時(shí)合成，細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期或停止生長(zhǎng)產(chǎn)物都不合成。如蒽醌類物質(zhì)合成的植物細(xì)胞 3.非生長(zhǎng)偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)停止以后。如 紫草寧的合成。第五章 原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜交一原生質(zhì)體（protop

15、last）：除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。二原生質(zhì)體的純化方法：（填空）1、沉降法：甘露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑，低速離心，原生質(zhì)體沉降于管底。2、漂浮法：蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑，離心，原生質(zhì)體漂浮于溶液表面。3、梯度離心法：利用比重不同的溶液，離心，原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間。三原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：（P118）1。液體淺層培養(yǎng)2。固體平板培養(yǎng)3。固液雙層培養(yǎng)4.瓊脂糖珠培養(yǎng)（搖床震蕩）5. 懸滴培養(yǎng)法：在培養(yǎng)皿蓋上滴懸浮液，皿底加入培養(yǎng)液，皿蓋翻過來蓋于皿底上，封口培養(yǎng)。6.微滴培養(yǎng)法：懸浮液滴于皿底，封口培養(yǎng)。7.飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：又稱看護(hù)培養(yǎng)。先制備飼養(yǎng)層，再在其上培養(yǎng)有活力的原生質(zhì)體。四原生質(zhì)體活力測(cè)定方法：

16、（P114）1.形態(tài)識(shí)別法 2.熒光素雙醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)生綠色熒光。3.酚藏花紅染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。4、熒光增白劑染色法：有活力的原生質(zhì)體隨著細(xì)胞壁的再生產(chǎn)生綠色熒光。5、伊凡藍(lán)染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。五植物體細(xì)胞雜交：又稱為原生質(zhì)體融合，是指將植物不同種、屬、甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞雜交的類型：1）體細(xì)胞雜交2）體細(xì)胞-配子雜交3）配子間細(xì)胞雜交4）微細(xì)胞雜交原生質(zhì)體融合的種類（完整程度）：1）對(duì)稱融合 2）非對(duì)稱融合六原生質(zhì)體的融合方法之一: PEG誘導(dǎo)融合法1）特點(diǎn)：優(yōu)

17、點(diǎn)是成本低；融合子產(chǎn)生的異核率高；不受物種限制。缺點(diǎn)是融合過程繁瑣，PEG對(duì)細(xì)胞有毒害。2）作用機(jī)理：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可與帶正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；PEG還鞥增加類脂膜的流動(dòng)性，使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。七原生質(zhì)體的融合方法之二：電融合的基本過程細(xì)胞膜的接觸：原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串。膜的擊穿：給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。優(yōu)點(diǎn)：1）不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題2）融合效率高3）融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便八（填

18、空）原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物：異核體（核未融合）、 同核體（同一親本融合 AA）、 未發(fā)生融合的雙親原生質(zhì)體。九雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與體細(xì)胞雜種植株的鑒定（P131-132）（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題）例：材料 月季（紅）玫瑰（白）培養(yǎng)月季式玫瑰分離原生質(zhì)體：純化、活力測(cè)定融合方法雜種選擇 雜種植株鑒定膜的融合-細(xì)胞質(zhì)融合（發(fā)生膜融合后的數(shù)小時(shí)）-核融合（可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也可能發(fā)生在第一次同步分裂過程中）。第六章 人工種子及種質(zhì)貯藏一人工種子（artificial seeds）：任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖體。根據(jù)包被的程度可將人工種子分為三大類：裸露的或休眠的繁殖體、人工種皮包被的繁殖體、水凝膠包埋再包被的繁殖體。二繁殖體的種類及其培養(yǎng)技術(shù)：體細(xì)胞胚、微型變態(tài)器官、微芽。三人工種子由以下三部分組成：繁殖體，人工胚乳，人工種皮。四包埋介質(zhì)的要求：1、要能對(duì)繁殖體起保護(hù)作用，要對(duì)繁殖體沒有毒害。2、要求具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。3、能夠提供類似于胚乳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供繁殖體發(fā)芽的需要。4、應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?。五理想的人工種皮：1具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失；2具有良好的透氣性，以保證繁殖體維持生理活性的需要；3有一定的堅(jiān)硬度，以加強(qiáng)人工種子的耐儲(chǔ)運(yùn)性和適于機(jī)械化操作；4無毒無害，能保證繁殖體順利穿透發(fā)芽。第七章動(dòng)