清熱降壓膠囊干預(yù)SHR海馬區(qū)組織代謝組學(xué)探究

1、清熱降壓膠囊干預(yù)shr海馬區(qū)組織代謝組學(xué)探究摘要選取30只shr大鼠隨機(jī)分為3組模型組， 卡托普利組，清熱降壓膠囊組，wistar大鼠10只作為正常 對照組，連續(xù)給藥14 d后取海馬組織，采用核磁共振 (1h-nmr)代謝組學(xué)方法探討高血壓大鼠的海馬組織損傷以 及清熱降壓膠囊的保護(hù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡托普利組海馬 區(qū)代謝輪廓明顯異于其余3組，另3組大鼠樣本分類的趨勢 非常明顯，提示清熱降壓膠囊能顯著改善大鼠海馬組織的代 謝，鑒定4種代謝產(chǎn)物為二甲基甘氨酸、甘油磷酸膽堿、醛 固酮和去甲腎上腺素。高血壓大鼠機(jī)體代謝異常主要表現(xiàn)在 酪氨酸代謝、血管平滑肌收縮以及醛固酮控制的鈉鹽再吸收 失常，清熱降壓

2、膠囊在有效降壓的同時(shí)通過影響這些代謝產(chǎn) 物來改善高血壓的海馬區(qū)損傷。關(guān)鍵詞高血壓??；清熱降壓膠囊；代謝組學(xué)；海馬收稿日期2013-07-07基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273700)； 國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81102549)通信作者*李運(yùn)倫，tel: e-mail： li.yunlun 高血壓病(essential hypertension) 是臨床常見病，多發(fā)病，高血壓所導(dǎo)致的小動(dòng)脈病變可造成 腦內(nèi)血流減少，供血區(qū)腦組織缺血缺氧，從而影響學(xué)習(xí)和記 憶能力1。因此對于高血壓的治療不僅是血壓達(dá)標(biāo)，更多 的是對腦組織損傷的保護(hù)。在長期高血壓的情況下，中

3、樞神 經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)發(fā)生改變，研究表明自發(fā)性高血壓大 鼠4月齡時(shí)海馬ca1區(qū)和齒狀回區(qū)白質(zhì)容積減少，6月齡時(shí) 海馬ca1區(qū)和齒狀回區(qū)灰質(zhì)容積及神經(jīng)元數(shù)目減少2。因 此，高血壓大鼠海馬區(qū)可能存在相應(yīng)的損傷，在高血壓治療 的同時(shí)具有保護(hù)海馬區(qū)功能的制劑可能具備良好的開發(fā)前 景。清熱降壓膠囊作為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的醫(yī)療機(jī) 構(gòu)制劑，適用于高血壓病肝火上炎證，其藥味包括黃連、鉤 藤、澤瀉和蘆薈，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗高血壓作用， 其機(jī)制與降低血漿renin和angll含量、提高血漿camp 濃度和降低血容量有關(guān)3,能夠干預(yù)高血壓大鼠血漿代謝 組整體代謝模式向正常模式轉(zhuǎn)化4,因此本實(shí)驗(yàn)采用核

4、磁 共振代謝組學(xué)技術(shù)，從海馬組織小分子代謝物層次研究清熱 降壓膠囊對高血壓大鼠海馬區(qū)的保護(hù)和逆轉(zhuǎn)損傷作用，應(yīng)用 模式識(shí)別技術(shù)分析海馬區(qū)的潛在代謝標(biāo)志物，結(jié)合相應(yīng)代謝 途徑，從高血壓大鼠海馬區(qū)損傷入手，分析清熱降壓膠囊的 靶器官保護(hù)作用。1材料與方法1. 1動(dòng)物 8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat, shr） 30 只，購自北 京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證書scxk （京） 2006-0009； 8周齡雄性wistar大鼠10只，購自山東中醫(yī)藥 大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證書scxk （魯）2005-1015o1.2儀器及試劑avanc

5、eii600mhz型超導(dǎo)傅立葉變換nmr譜儀，瑞士 bruker公司產(chǎn)品。清熱降壓膠囊（魯藥制字 z20120009）；卡托普利片（濟(jì)南東風(fēng)制藥有限公司，批號(hào) 0608023）；重水（d20）為美國cil公司產(chǎn)品，2, 2, 3, 3- 三甲基甲硅烷基丙酸（3-trimethylsilyl-2 , 2 , 3 , 3d4-propionate, tsp）,美國 aldrich 公司產(chǎn)品。1. 3分組及給藥方法將shr大鼠隨機(jī)分成3組，每組 10只，即清熱降壓膠囊組、卡托普利組和模型組，并設(shè)wistar 大鼠10只作為正常對照組。清熱降壓膠囊組給與1& 336生藥g kg-1 （相當(dāng)于6

6、0 kg成年人每日劑量的20倍），卡托 普利加生理鹽水適量2. 08 g l-1混懸液，對照組給與卡托 普利24. 96 mg kg-1,模型組和正常對照組給與等量的生理鹽水，按等容積不同濃度的原則灌胃給藥，每天1次，連續(xù) 用藥14 do1.4海馬組織的采集及處理10%水合氯醛（0.35 ml - 100 g-1）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，迅速斷頭取腦, 剪開頭皮，用止血鉗沿大鼠頭顱中央骨縫撬開，迅速分離腦 組織，于冰上分離出海馬組織，將體積比為2 ： 2 ： 1的甲醇、 氯仿和水(4 °c)按(3 ml g-1組織)加入到冷凍的組織 中，置組織勻漿管中勻漿3 min,重復(fù)提取2

7、次，合并提取 勻漿，將樣品置于4 °c的冷凍離心機(jī)中以3 000 r - min-1 離心20 min,取上清液置多通道旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，以重水 600卩l(xiāng)溶解，加入適量tsp作為內(nèi)標(biāo)，取上層清液550 u l 置于5 mm核磁管中，使用avanceii600 mhz型超導(dǎo)傅立葉 變換nmr譜儀進(jìn)行測量。1.5nmr數(shù)據(jù)采集和處理 在超導(dǎo)傅立葉變換nmr譜儀上 調(diào)用cpmgprld脈沖序列，該序列可以較好地去除血液中大 分子的干擾，以tsp為化學(xué)位移參考峰位置，設(shè)為0,校正 化學(xué)位移，對圖譜進(jìn)行相位校正和基線校正，將1h譜按默 認(rèn)值，從5 10.00,以每段為0.04進(jìn)行分段并積分，扣

8、 除§ 4. 55處重水中殘余h2o的影響，共獲得235個(gè)化學(xué) 位移小段和各化學(xué)位移對應(yīng)的積分值，以excel文件貯存。1. 6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)文件采用simca-p軟件(version 11.5, umetrics ab, umea, sweden)進(jìn)行主成分分析 (principal components analysis, pca)和偏最小二乘- 判別分析(partial least squares-discriminant analysis, pls-da)o根據(jù)pls-da分析的vip圖，尋找對分類貢獻(xiàn)較大 的變量(即化學(xué)位移)，確定各組的共性代謝物和組間差異 的潛在生物標(biāo)志物

9、。采用matlab軟件(the mathworks, inc.) 進(jìn)行方差分析(anova)o2結(jié)果2. 1樣品的1h-nmr譜分離與分析 不同分組的大鼠海馬 皮質(zhì)區(qū)樣品的典型1h-nmr譜及其中的部分內(nèi)源性成分見圖 1,由圖可見血清中代謝成分主要是有機(jī)酸、氨基酸和脂類 等化合物。2.2正常組、模型組、卡托普利組及清熱降壓膠囊組的 pca和pls-da首先將樣本數(shù)據(jù)導(dǎo)入matlab軟件采用anova 進(jìn)行特征預(yù)選擇，然后在預(yù)選擇特征的基礎(chǔ)上，再用simca-p 軟件進(jìn)行pca和pls-da,見圖2?？梢?類樣本中，不管是 pca還是pls-da,卡托普利組的空間分布與其他3組有較大 差異，且分

10、布離散度較高，而其他3組的分布較為混雜，可 能因?yàn)榭ㄍ衅绽深A(yù)的靶點(diǎn)與中藥組差異明顯，因而導(dǎo)致其 代謝輪廓異于其他3組。為了尋找清熱膠囊的干預(yù)靶點(diǎn)，考 慮刪除卡托普利組再進(jìn)行進(jìn)一步模式識(shí)別分析。a.全波譜圖；b.放大圖。圖1 shr海馬區(qū)的典型1h-nmr譜fig. 1 the typical 1h-nmr spectroscopy of shr hippocampus圖2基于anova特征預(yù)選擇的正常組(classi)、模型 組(class 2)、卡托普利組(class 3)及清熱降壓膠囊組 (class 4) pca 和 pls-da 散點(diǎn)圖fig. 2 the pca and pls-d

11、a seatter plot of the normal group (class 1), model group (class 2), cap to pril group(class 3) and qingre jiangya capsule group (class 4) based on anova pre-selected卡托普利組與其他3個(gè)組差異明顯，為避免其對代謝輪 廓空間分布的“擠壓”作用，在刪除卡托普利組數(shù)據(jù)后，將 剩余3組數(shù)據(jù)導(dǎo)入simca-p,進(jìn)行pls-da,所建模型對自變 量的擬合能力指數(shù)(r2x)為0. 708,說明模型對自變量的擬 合能力良好，對因變量的擬合指數(shù)(r

12、2y)為0. 763,說明模 型對因變量的擬合能力良好，模型的預(yù)測指數(shù)q2cum (交叉 驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)的平方，表示模型的預(yù)測能力，該值越大，模 型的預(yù)測能力越強(qiáng))為0. 498,相對較低，但從分類結(jié)果來 看，各個(gè)類別已基本分開，且符合各類別之間相互關(guān)系的實(shí) 際情況，因此模型的分類結(jié)果可靠，見圖3。圖3基于an0va特征預(yù)選擇的正常對照組(class 1)、 模型組(class 2)及清熱降壓膠囊組(class 3) pls-da散 點(diǎn)圖fig. 3 the plsda scatter plot of the normal group (class 1), model group (class

13、2) and qingre jiangya capsule group (class 3) based on anova pre-selected正常組，模型組和清熱降壓膠囊組之間代謝模式的差異 依然顯著，清熱降壓膠囊組處于模型組和健康對照組之間， 并與2組有混雜，提示清熱降壓膠囊可能會(huì)改善大鼠海馬區(qū) 的代謝輪廓，使其向正常大鼠轉(zhuǎn)變，從整體水平上有效干預(yù)shr海馬區(qū)的代謝模式。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建模型的可靠性，采用排列檢驗(yàn)法 (permutation test) 5-7,即將原始響應(yīng)數(shù)據(jù)(即y)隨 機(jī)化，x數(shù)據(jù)不變，然后評價(jià)隨機(jī)數(shù)據(jù)擬合的可能性(或機(jī) 會(huì)性)。對于一個(gè)有效模型，相應(yīng)的r2和q2的

14、截距應(yīng)分別 小于0.3, 0. 055 o經(jīng)過30次隨機(jī)排列，計(jì)算的r2和q2 的截距分別為0. 263, -0. 489,見圖4,因此所建模型是有 效的，可靠的。圖4代謝組學(xué)模型排列檢驗(yàn)法的可靠性驗(yàn)證結(jié)果fig .4 the reliability experiment result of metabonomic model based on arrangement test2.3生物代謝物的尋找、鑒定根據(jù)清熱降壓膠囊組、 正常對照組、高血壓模型組的pls-da結(jié)果，選擇vip (variable importance for the projection) >1 的變量作 為潛在生物

15、標(biāo)志物的鑒別依據(jù)：8, vip圖見圖5,大于1的 變量有28個(gè)，參照文獻(xiàn)9-11的方法，根據(jù)變量對應(yīng)的化 學(xué)位移值，檢索以下3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫：kegg (http： /www. kegg. com ), metlin ( http :/www. metlin. scipps. edu), hmdb (http： /www. hmdb. ca), 最終鑒定了 4個(gè)潛在標(biāo)志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并確定了代謝通路, 見表1 o圖5 pls-da分析的vip得分圖fig. 5 the vip scores plot of pls-da從這4種潛在標(biāo)志物的代謝趨勢可知，與正常組比較,模型組的二甲基甘氨酸、甘油磷酸

16、膽堿、醛固酮和去甲腎上 腺素均呈升高的趨勢。經(jīng)清熱降壓膠囊干預(yù)后，各潛在標(biāo)志 物則成明顯下降的趨勢，見圖6。表1正常組、模型組和清熱降壓膠囊組潛在生物標(biāo)志物及代謝途徑分析table 1 the potential biomarker and metabolic pathway of the normal group, model group and qingre jiangya capsule group1.正常組；2模型組；3清熱降壓膠囊治療組。 圖6 shr海馬區(qū)4種潛在代謝標(biāo)志物代謝趨勢fig. 6 the metabolic trend of four potential biomar

17、ker in shr hippocampus3討論代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的 一種研究生物系統(tǒng)的組學(xué)方法，是研究“在新陳代謝過程 中，生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝 本質(zhì)"的科學(xué)，它關(guān)注生物體系所有內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變 化，并通過分析體液代謝物組成來確定生物體系的系統(tǒng)生化 譜和功能調(diào)控規(guī)律12。人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)，應(yīng)該用 代謝組學(xué)和全面性系統(tǒng)策略來理解生物體的疾病過程，代謝 組學(xué)是最接近生物表型和最能有效反映細(xì)胞個(gè)體或群體功 能的表征技術(shù)。這與中醫(yī)學(xué)整體觀念和辨證論治思維方式非 常相似13-15 o針對中醫(yī)藥的代謝組學(xué)研究，國內(nèi)外已有 多篇研究

18、報(bào)道。高血壓病陰虛陽亢證與健康人、陰虛陽亢證 與其他證型患者的血清代謝組學(xué)分析不但可以區(qū)分高血壓 病陰虛陽亢證與健康組人群，還顯示出高血壓病陰虛陽亢證 不同于其他證型的顯著特點(diǎn)16 o代謝組學(xué)對整體代謝輪廓 的描述可以評價(jià)復(fù)雜性多元(方劑成分及代謝產(chǎn)物)輸入的 調(diào)整帶來整體效應(yīng)的變化17。xiumei lu等以代謝組學(xué)技 術(shù)研究骨碎補(bǔ)對腎陽虛證的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)治療組血漿代 謝譜隨時(shí)間變化，有明顯的回歸趨勢18。作為代謝組學(xué)常見的分析測試手段，核磁共振代謝組學(xué) 方法樣品前處理簡單易行，用量較少且采集方便，不會(huì)破壞 樣品的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，可以在接近生理環(huán)境的條件下進(jìn)行測 試，這樣最大限度的保留了樣品

19、內(nèi)部的代謝物信息。核磁共 振測試手段多樣，信息豐富，得到的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)完善和全 面，這將有利于對樣本的整體分析和疾病診斷，實(shí)驗(yàn)方法靈 活，單脈沖、cpmg (carr-pureell-meiboom-gill)> 擴(kuò)散加 權(quán)和noesyid等手段以及二維nmr如hsqc, cosy, tocsy等 在代謝物指認(rèn)和歸屬上提供了大量的數(shù)據(jù)和證據(jù)，有利于代 謝物的結(jié)構(gòu)鑒定19-21 o自發(fā)性高血壓大鼠又稱原發(fā)性高血壓大鼠，是一種與人 類原發(fā)性高血壓極類似的動(dòng)物疾病模型。sabbat ini等22 研究發(fā)現(xiàn)shr海馬結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯變化，這可能是導(dǎo)致 遺忘綜合征的主要原因23。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常組

20、與shr組在 大鼠海馬的代謝譜中可以明顯區(qū)分，說明了 shr作為高血壓 相關(guān)的腦損傷模型是有效的，造成這種明顯區(qū)分的原因或許 與高血壓引起的學(xué)習(xí)與記憶功能下降的病理機(jī)制有關(guān)24。nmr海馬代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，正常組，模型組和清熱降壓膠囊組 之間代謝模式的差異顯著，卡托普利組個(gè)體之間代謝模式各 異，清熱降壓膠囊可以逆轉(zhuǎn)shr海馬的代謝模式。經(jīng)代謝物 結(jié)構(gòu)鑒定，找到了 4種相應(yīng)的潛在代謝標(biāo)志物：二甲基甘氨 酸、甘油磷酸膽堿、醛固酮和去甲腎上腺素，在shr海馬中 含量明顯高于正常大鼠，說明高血壓損傷海馬組織主要與大 鼠機(jī)體的酪氨酸代謝、血管平滑肌收縮以及醛固酮控制的鈉 鹽再吸收相關(guān)。去甲腎上腺素（ne）是

21、海馬神經(jīng)元中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì), 海馬內(nèi)ne的含量與記憶障礙密切相關(guān)，中樞腎上腺能神經(jīng) 遞質(zhì)的活動(dòng)是記憶形成與保持不可缺少的環(huán)節(jié)之一25。通 過與正常組比較，發(fā)現(xiàn)shr模型組海馬組織內(nèi)ne含量明顯 增加，中藥治療組與模型組比較，大鼠海馬組織內(nèi)ne含量 相對降低，反映清熱降壓膠囊干預(yù)后，引起shr大鼠海馬組 織內(nèi)ne的含量變化，故推測清熱降壓膠囊能夠通過調(diào)節(jié)海 馬內(nèi)的ne含量，逆轉(zhuǎn)高血壓造成的海馬損害。醛固酮是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rennin angiotension aldostone system, raas)中的重要部分， raas參與人體高血壓、心力衰竭、冠心病等眾多病理生理過

22、程。臨床上檢測的多為血漿醛固酮26,本次研究發(fā)現(xiàn)，自 發(fā)性高血壓大鼠海馬組織內(nèi)醛固酮含量增加，清熱降壓膠囊 干預(yù)后，其含量向正常組回歸，說明清熱降壓膠囊逆轉(zhuǎn)高血 壓的整體過程在組織的醛固酮含量中有相應(yīng)表達(dá)。磷酸甘油膽堿作為膽堿的一種，主要存在于細(xì)胞膜、髓 磷脂和腦內(nèi)的脂質(zhì)的更新，膽堿峰值的增加與膜崩解、翻轉(zhuǎn) 增加、髓鞘形成及炎癥有關(guān)27,本實(shí)驗(yàn)觀察到shr海馬區(qū) 磷酸甘油膽堿含量的增加，提示高血壓可能導(dǎo)致海馬神經(jīng)元 存在膜崩解增加及完整性受損，而清熱降壓膠囊干預(yù)后，甘 油磷酸膽堿的含量降低，顯示了本方對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作 用。本實(shí)驗(yàn)中清熱降壓膠囊組的整體代謝輪廓相對于模型 組有明顯回歸正常組的

23、趨勢，同時(shí)發(fā)現(xiàn)潛在代謝標(biāo)志物二甲 基甘氨酸、甘油磷酸膽堿、醛固酮和去甲腎上腺素也存在回 歸的趨勢，表明清熱降壓膠囊在降低血壓的同時(shí)，通過改善 大鼠體內(nèi)的酪氨酸代謝、血管平滑肌收縮以及醛固酮控制的 鈉鹽再吸收等整體代謝，從而能夠從分子水平上糾正自發(fā)性 高血壓大鼠海馬損害的病理進(jìn)程，以減少高血壓海馬組織造 成的結(jié)構(gòu)與功能損傷。本文所得到的潛在代謝標(biāo)志物，通過 核磁共振氫譜進(jìn)行了鑒定，得到潛在的標(biāo)志物應(yīng)該進(jìn)一步釆 用lc-ms/ms進(jìn)行對照品的定量分析驗(yàn)證，從而為潛在標(biāo)志 物向真正標(biāo)志物的轉(zhuǎn)變提供可靠的數(shù)據(jù)。參考文獻(xiàn)1喬松，馮家純，楊晶，等.自發(fā)性高血壓和持續(xù) 低灌流模型大鼠記憶能力與腦組織病理學(xué)對

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36、亢 證酪氨酸輕化酶及單胺氧化酶微衛(wèi)星多態(tài)性分析j.湖南 中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000, 20 (3)： 37.26 王雪，萬征，孫躍民，等.依普利酮對自發(fā)性高 血壓大鼠腦組織醛固酮與腦損害的作用j.中國循證心血 管病雜志，2009, 1 (5)： 273.27 davi c a, hawkins c p, barker g j, et al.serial proton magnetic resonanee spectroscopy in acute multiple sclerosis lesiontj brain, 1994,117：49.intervention effects of qingr

37、e jiangya capsule on brain hippocampus ofspontaneously hypertensive rats based on metabonomic researchjiang hai-qing, nie lei , li yun-lun, wang miao-miao, zhu mei, yang wen-qing, zhang xin-ya(1. experiment center, shandong university of traditional chinese medicine, ji f nan 250355, china；2. school of pharmaceutical sciences, shandong university， ji f nan 250011, china；3. affiliated hospital of shandong university of traditional chinese medicine, national hypertensionclinical research base, ji1 nan