楊樹(shù)原生質(zhì)體融合的研究

1、楊樹(shù)原生質(zhì)體融合的研究作者：童威導(dǎo)師：諸葛強(qiáng)摘要:本文以南林895楊(populus xeuramcricana cv'nanlin895')、轉(zhuǎn)bt基因南林895楊和銀白楊(p. alba) 為材料，在建立懸浮細(xì)胞系及植株再生的基礎(chǔ)上，開(kāi)展楊樹(shù)原生質(zhì)體分離和電融合研究，篩選適合楊樹(shù)原 生質(zhì)體分離與純化、原生質(zhì)體電融合及雜種篩選和培養(yǎng)等條件、方法。旨在為楊樹(shù)體細(xì)胞雜交種質(zhì)創(chuàng)新研 究捉供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：幼嫩莖段較適合誘導(dǎo)愈傷組織。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:ms+2, 4-d2mg/lo 將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷繼代培養(yǎng)基：ms+2, 4-d 2mg/l+kt 0. 2mg/

2、l,經(jīng)廣5次繼代培養(yǎng)后獲得淡黃色、 結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基：ms+2,4-d加g/l+naao. 2mg/l+kt 0. lmg/l+水解酪蛋白 500mg/l,建立楊樹(shù)懸浮細(xì)胞系。關(guān)鍵詞：楊樹(shù)：原生質(zhì)體分離：電融合tn this paper, populusxeuramericana cv 'nanlin895' , transgenic populusxeuramericarmcv ntinlin895" with bt gene and pabla were used as experiment materials,on the base o

3、f the establishment of suspension culture and plant regeneration,wc studied protoplast isolation and protoplast electofusion in poplar,selected the optimum conditions and methods for the protoplast isolation, protoplast purification, protoplast eletrofusion, protoplast culture and selecting the soma

4、tic hybrids.the main results described as follows:the plantlet twigs were feasible to induce callus.the medium for callus inducementwas ms+2, 4-d 2mg/l.the induced calli were transferred into the medium for callus subculture ms+2, 4-d 2mg/l+kt 0. 2mg/l. the calli become light yellow and texture shor

5、t after 4-5 subculture periods,which were used to establish cell suspension culture of poplar with the liquid medium ms+2,4-d 2mg/l+naa 0. 2mg/l+kt 0. lmg/l+ch 500mg/l;keys words： poplar;protop last isolation electrofusion1楊樹(shù)原生質(zhì)體的融合實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室的南林895楊(populusxeuramericana cv "nanlin895)、轉(zhuǎn)bt基因

6、 南林895楊、銀白楊(p. alba)組培苗，分別収其莖段、葉柄和葉片作為外植體。1.1.植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的概念包括植物器官，組織，細(xì)胞，原生質(zhì)體及胚的培養(yǎng)，其核心理論依 據(jù)是植物細(xì)胞的全能性，他包括植物細(xì)胞的“形態(tài)全能性”(steward fcetal., 1964)和“化 學(xué)全能性” (zenk mhet al.,1975)兩個(gè)方血的概念，即植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都包含有整 株植物全部的遺傳信息，在一定條件下具有發(fā)育成一個(gè)完整的植株的能力。植物細(xì)胞懸浮培 養(yǎng)即植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這些細(xì)胞和小聚集 體來(lái)自愈傷組織，某個(gè)器官或組織，甚至幼嫩的

7、植株，通過(guò)物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離獲得 (路鐵鋼和葉和春,1995)。愈傷組織或懸浮愈傷組織作為原牛質(zhì)體培養(yǎng)的起始材料，有其它材料所不及的優(yōu)越性: 一是獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量高；二是分離的原生質(zhì)體再生能力強(qiáng)，能夠在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)地分 裂并保持較強(qiáng)的器官分化能力；三是重復(fù)性良好。因此，獲得良好的愈傷紐織是原生質(zhì)體分 離、培養(yǎng)及細(xì)胞融合的基礎(chǔ)。1.2.植物原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)選川時(shí)應(yīng)根據(jù)植物材料和酶制品的特性進(jìn)行綜合考慮。此外，還必須控制好酶解條件。 影響酶解過(guò)程的主要因索冇溫度、ph值、滲透壓、離了濃度、振蕩及預(yù)處理等。一般情況 下，酶解溫度為2530°c,酶解液的ph值根據(jù)所用酶種類(lèi)的不同

8、可以在5.46.2之間變動(dòng), 滲壓劑的使用濃度，一般控制在0.450.8mmol/l范圍內(nèi)。腮解前對(duì)材料進(jìn)行輕微的質(zhì)壁分 離，酶解時(shí)低速振蕩(40rpm)以及酶解液屮高鈣鎂離子濃度(cac12和mgc等能提高原牛質(zhì) 體的產(chǎn)量和質(zhì)暈。原生質(zhì)體成功分離后的純化方法常用的有漂浮法和界面沉降法。漂浮法在 洗滌純化過(guò)程中對(duì)原生質(zhì)體的損傷較小，但對(duì)離心力要求嚴(yán)格，不易學(xué)握，界面沉降法易造 成原生質(zhì)體損傷，但操作簡(jiǎn)單。原生質(zhì)體培養(yǎng)受：培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基種類(lèi)、原牛質(zhì)體密度、外源牛長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑素的影響。 木木植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)，起初常采用平板式，由于瓊脂的熔點(diǎn)較高原生質(zhì)體的傷害，逐漸 為淺層培養(yǎng)所代替。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，低熔

9、點(diǎn)的瓊脂糖對(duì)原生質(zhì)有良好的效果。甘霖(2(x)0)比較 了低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋和液體淺層培養(yǎng)對(duì)原牛質(zhì)的培養(yǎng)效呆，結(jié)果表明，詢(xún)者使細(xì)胞分裂提早 12d,分裂頻率提高11.3%。13原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合技術(shù)主要包括誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選和雜種植株的再生和鑒定 等3個(gè)環(huán)節(jié)。在融合方法上，是peg法和電融合法。選用吋應(yīng)根據(jù)植物材料和酶制品的特性進(jìn)行綜合考慮。此外，還必須控制好臨解條件。影 響酶解過(guò)程的主要因素有溫度、ph值、滲透壓、離子濃度、振蕩及預(yù)處理等。一般情況下, 酶解溫度為2530°c,酶解液的ph值根據(jù)所用酶種類(lèi)的不同可以在5.46.2之間變動(dòng)，滲 壓劑的使用濃度，一般控制

10、在().45().8mmol/l范|韋|內(nèi)。酶解前對(duì)材料進(jìn)行輕微的質(zhì)壁分離, 酶解時(shí)低速振蕩(40rpm)以及酶解液中高鈣錢(qián)離了濃度(cac12和mgc等能提高原生質(zhì)體 的產(chǎn)量和質(zhì)雖。原生質(zhì)體成功分離后的純化方法常用的有漂浮法和界面沉降法。漂浮法在洗 滌純化過(guò)程中對(duì)原生質(zhì)體的損傷較小，但對(duì)離心力要求嚴(yán)格，不易掌握，界面沉降法易造成 原牛質(zhì)休損傷，但操作簡(jiǎn)單。2.楊樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與植株再生2.1愈傷組織誘導(dǎo)和繼代篩選2.1.1愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)采用ms基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的2,4-d,均加入3%的蔗糖和0.7% 的瓊脂，ph5.8o培養(yǎng)3()d后記錄愈傷紐織的誘導(dǎo)惜況，期間觀察愈傷組

11、織發(fā)生的時(shí)間和狀 態(tài)。應(yīng)用ms某木培養(yǎng)革，附加不同濃度組介的2,4-d,kt等激索，將所誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn) 行繼代。所使用愈傷繼代培養(yǎng)基見(jiàn)表1。每次繼代，挑選淡黃色、生長(zhǎng)迅速的愈傷組織予以 繼代。前兩次繼代周期為20d,然后選擇顆粒較細(xì)、色澤淡黃、牛長(zhǎng)迅速的愈傷組織，加快 繼代頻率(1次/15d)。培養(yǎng)條件同上。表1愈傷繼代培養(yǎng)基tablet the different medium for callus subculture培養(yǎng)基2,4d(mg/l)kt(mg/l)ys-110.1ys-220.2ys-340.1ys-440.2注:培養(yǎng)基基本成分為:ms+蔗糖瓊脂 0.7% ,ph:5.82.

12、1.2愈傷組織繼代篩選將剛誘導(dǎo)出培養(yǎng)30d的愈傷組多i接種到不同的愈傷繼代培養(yǎng)基(見(jiàn)表1-1)中進(jìn)行繼代 培養(yǎng)，20d繼代一次，每次繼代時(shí)挑選淡黃色的、質(zhì)地疏松、生長(zhǎng)較快的愈傷組織觀察不同 培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織牛長(zhǎng)的影響，通過(guò)數(shù)次繼代，培養(yǎng)出淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織。2. 2懸浮細(xì)胞系的建立取鮮重廣2g繼代3次以后、最后一次繼代15d左右的顆粒狀胚性愈傷組織，置于盛冇 20ml液體培養(yǎng)基的150ml三和瓶屮，用銀子將愈傷組織輕輕夾碎，然后置于搖床上振蕩培 養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120rpm, 24h后用100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，除去愈傷組織碎片及大的細(xì)胞團(tuán)，再 經(jīng)loorpm離心加in,除去上面的碎渣，將

13、所得的單細(xì)胞放入加有30ml液體培養(yǎng)基的三角 瓶中，制成細(xì)胞懸浮液，置于搖床上在散射光下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為ll(t120rpm,培養(yǎng)溫度 25土 1°c。前兒次繼代時(shí)，待培養(yǎng)物靜置2min后，用吸管吸出2/3左右上清液，補(bǔ)充加入新 鮮液體培養(yǎng)基至30ml,以后每次繼代，均用吸管吸取鮮重約2g的懸浮細(xì)胞至150ml的三角 瓶中，加入液體培養(yǎng)基至30ml,根據(jù)細(xì)胞的牛長(zhǎng)速度，每58d繼代一次。取六瓶繼代6d后的懸浮細(xì)胞，倒入無(wú)菌的300ml的三角瓶，混合均勻，靜置2 min后, 按照繼代的方法，用吸管吸取體積約為51的懸浮細(xì)胞至150ml的三角瓶屮，加入30ml的 液體培養(yǎng)基，共18瓶。何

14、2d取兩瓶進(jìn)行鮮重和干重的測(cè)定。鮮重的測(cè)定：將懸浮培養(yǎng)物倒 在已經(jīng)知道重量的濕尼龍網(wǎng)上，用去離子水洗去培養(yǎng)基。真空抽濾除去細(xì)胞上沾留的多余水 分，然后稱(chēng)重。t重的測(cè)定：懸浮細(xì)胞經(jīng)過(guò)干尼龍網(wǎng)過(guò)濾，烘干(60°c, 12h)后稱(chēng)重。2. 3愈傷組織植株再生取繼代ri2次的南林895楊、轉(zhuǎn)bi基因南林895楊和銀白楊愈傷組織，放入附加不同 濃度的細(xì)胞分裂素6-ba、kt、zt、tdz和生長(zhǎng)素iaa、naa的ms培養(yǎng)基中,統(tǒng)計(jì)其出芽率, 比較不同詁種楊樹(shù)愈傷組織的再牛能力。實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基見(jiàn)圖表20表2愈傷組織芽分化培養(yǎng)基table2 the different medium for bu

15、d inducement培養(yǎng)基6-ba(mg/l)iaa(mg/l)kt(mg/l)zt(mg/l)naa(mg/l)tdz(mg/l)f-l0.50.001f-20.50.002f-310.001f-410.002f-50.50.2f-60.50.5f-70.50.50.50.1f-s10.50.50.1f-90.50.50.001f-100.50.50.002f-ll0.50.50.2f-120.510.2注：培養(yǎng)基基木成分為:ms+蔗糖 3滄瓊脂 0.7% ,ph:5.82. 4結(jié)果與分析愈傷紐織誘導(dǎo)及愈傷組織篩選培養(yǎng)和保持2. 4. 1不同外植體對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響表3不同外植體對(duì)愈傷誘導(dǎo)

16、的影響比較tab ie3 effect of d i fferent stuff on the cal i us inducement愈傷組織誘導(dǎo)率二（形成愈傷組織外植體塊數(shù)/成活的外植體塊數(shù)）x100%培養(yǎng)基 1： ms+2, 4-d lmg/l+蔗糖 3%+瓊脂 0. 7%外植體供試外植體數(shù)誘導(dǎo)數(shù)誘導(dǎo)率（）南林895楊莖段5151100南林895楊葉柄514384南林895楊葉片494184轉(zhuǎn)bt基因895莖段5555100轉(zhuǎn)bt基因895葉柄5243s3轉(zhuǎn)bt基因895葉片5342s0銀白楊莖段5353100銀白楊葉柄5142s2銀白楊葉片4s39s1培養(yǎng)基2：ms+2, 4-d lmg

17、/l+kt 0. 2 mg/l+蔗糖 3%+瓊脂 0. 7%外植體供試外植體數(shù)誘導(dǎo)數(shù)誘導(dǎo)率（）南林895楊莖段5353100南林895楊葉柄5145ss南林895楊葉片5446s5轉(zhuǎn)bt基因895莖段5454100轉(zhuǎn)bt基因895葉柄4740s5轉(zhuǎn)bt基因895葉片5445s3銀白楊莖段5252100銀白楊葉柄4942s6銀白楊葉片514384由表3可以看出，不同外植體脫分化形成愈傷組織的容易程度存在一定的差界。莖段脫 分化形成愈傷組織最早，誘導(dǎo)率高。外植體莖段接種7d后的誘導(dǎo)率在培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2 中分別達(dá)到56. 35%和52. 78%至14d即為100%。葉柄脫分化形成愈傷組織的能力次之

18、,而葉 片的脫分化反應(yīng)最遲鈍。比較兩種培養(yǎng)基可以看出培養(yǎng)基中kt濃度的細(xì)微變化對(duì)葉片，葉 柄，莖段愈傷組織的誘導(dǎo)沒(méi)冇多大彩響。所有的葉柄和莖段在接種一段吋間后，切口處都出現(xiàn)了愈傷組織，但所發(fā)生的愈傷組織 在顏色、質(zhì)地等方血均有明顯不同。葉片或莖段在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后會(huì)有三 類(lèi)愈傷組織形成，笫一類(lèi)為淺綠色愈傷紐織，表面帶有口色絨毛。這類(lèi)愈傷組織多從葉片屮 下部和靠近培養(yǎng)基的莖段切口部位產(chǎn)生。其細(xì)胞呈圓形，排列整齊、緊密；第二類(lèi)為淺褐色, 水浸狀，多在外植體靠近培養(yǎng)基部位產(chǎn)生。其細(xì)胞多呈方形或圓形，細(xì)胞較大，多液泡化, 這類(lèi)愈傷組織再生能力差，但可進(jìn)行繼代培養(yǎng)，并在繼代過(guò)程屮可在其頂

19、端或邊緣產(chǎn)生第三 類(lèi)愈傷組織；第三類(lèi)愈傷組織為白色絮狀，略帯粘性，多在葉柄和莖切口處產(chǎn)生，也可由繼 代后期的笫二類(lèi)愈傷組織的頂部和側(cè)部產(chǎn)牛。其細(xì)胞多呈長(zhǎng)形或桿形，首尾相連，細(xì)胞核在 桿的頂部。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幼嫩的莖段較適合誘導(dǎo)愈傷組織。2. 4. 2生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：ms+2, 4-d+蔗糖3%+瓊脂0. 7%o分別取2,4-d濃度<lmg/l： lmg/l<2, 4-d<3mg/l； 2, 4-d>4mg/l,不同濃度梯度的培養(yǎng) 基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：南林895楊、轉(zhuǎn)bt基因南林895楊培養(yǎng)2530d后，在莖段的兩邊切口出現(xiàn)少量的愈傷 組織，而銀白楊25飛0d后，愈傷組織生長(zhǎng)較快已經(jīng)包圍了整個(gè)切段。選取色澤淡黃、質(zhì)地 疏松的愈傷組織在不同2, 4-d濃度的培養(yǎng)基屮繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2, 4-d濃度對(duì)愈傷纟f1織的結(jié)構(gòu) 及綸長(zhǎng)速度有非常顯苦的影響。2, 4-d<lmg/l,形成的愈傷組織色澤暗淡，結(jié)構(gòu)緊密，牛長(zhǎng) 速度慢；2,4-d>4mg/l,形成的愈傷組織呈乳白色，結(jié)構(gòu)松脆，生長(zhǎng)速度很快；2, 4-d濃度 介于lmg/l和3mg/l之間時(shí)，形成的愈傷組織山色澤淡黃而鮮艷的小顆粒組成，生長(zhǎng)速度較 快，選取這種愈傷紐織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，可以建立起牛長(zhǎng)速度快、結(jié)構(gòu)松脆、細(xì)胞壁薄、細(xì)胞 質(zhì)濃厚的愈傷組