一種新型具有GPx和SOD的含硒抗氧化肽制備

1、一種新型具有GPx和SOD勺含硒抗氧化肽制備 In this study the artificial design was synthesized with SODand GPxamino acid sequence of small peptide ， the active site of target proteinmodification sites designedCys，at the sametime will not affect the structure of other sites of Cys become available from other amino acids

2、 76 synthetic antioxidant peptide sequence of amino acids ，and try to take advantage of e.c. with our fabrication： oliauxotroph expression system for the expression of 76 peptide analogues ， and the expression of peptide activity appraisal ， expectations for oxidation of simulation study provides so

3、me theoretical parameters.天然抗氧化酶穩(wěn)定性差、 來源受限且分子量較大等缺點(diǎn)一直 限制其在各個領(lǐng)域勺實(shí)際應(yīng)用。 由于抗氧化酶對維持正常生命活 動勺重要性， 使得科學(xué)家們一直在利用模擬手段去設(shè)計并改造天 然抗氧化酶，以便闡明酶催化反應(yīng)機(jī)理和提高其實(shí)際應(yīng)用價值。 但機(jī)體內(nèi)勺抗氧化酶是通過協(xié)同作用來維持該系統(tǒng)平衡勺， 且進(jìn) 程也復(fù)雜多變， 因此， 對于單一功能酶勺研究和模擬顯然不能深 入理解這個復(fù)雜勺抗氧化酶系統(tǒng)， 開展具有抗氧化能力勺多功能 酶勺模擬勢在必行 1 。在此之前，我們利用近幾年的時間對具有 SOD和GPx活力的 模擬酶進(jìn)行了一部分研究， 以SOC和GPx序列為

4、基礎(chǔ)，基于模塊 酶的設(shè)計理念， 我們構(gòu)建了一個具有谷胱甘肽過氧化物酶和超氧 化物歧化酶 ?p 酶活性的含硒 65 肽，但由于其分子量較大，很難 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。故此，我們在此 65 肽的氨基端連接上人 免疫缺陷病毒反式轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序 列，即細(xì)胞穿膜肽，使其具有穿透生物膜的能力，獲得 76 肽模 擬物，并在大腸桿菌中成功融合表達(dá)，再通過硒化，得到了具有 SOD和GPx活力的模擬酶。1 材料1.1 試驗(yàn)材料65P肽(HQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRDGSLWPFLRHVYG PRACVV HAGED由本實(shí)驗(yàn)室保留，大腸桿菌克

5、隆菌株E. colipET22b由本實(shí)驗(yàn)室保留。1.2 主要試劑核酸染料(SYBR?Green )、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000,DL15000DNAMarker)購于 TAKALA公司，T4 DNA連接酶購自 MBI 公司，胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂購于 Oxiod 公司；瓊脂糖購于 Promega公司；異丙基-(3 -D-硫代半乳糖苷(isopropyl B -D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)、氨芐青霉素(ampicilli n, Amp)、卡那霉素(kan amyc in , Kana)購于上海生工生物技術(shù)XX公司；小型質(zhì)粒抽提試劑盒購于北京天根生 化科技XX

6、公司；限制性內(nèi)切酶 Xba I和Nde I購于大連寶生物 公司；蛋白質(zhì) Marker 購于 SolabioXX 公司； DNAMarker 購于寶 生物大連生物工程公司；四甲基二乙胺（ TEME）D 、考馬斯亮藍(lán) R-250、十二烷基磺酸鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨（APS、甘氨酸、 溴酚藍(lán)（ BPB）、 Tris 、甘油、醋酸、乙醇等其他生化試劑和常 規(guī)試劑均為分析純。2 方法2.1 76 肽的構(gòu)建與鑒定在原有65P肽氨基酸序列的基礎(chǔ)上，連接TAT穿膜肽（Y GRKKRRQRR使其能穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)2 ，對其蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測， 構(gòu)建 76 肽的初始三維 結(jié)構(gòu)。借助生物信

7、息學(xué)軟件 Primer Premier 5.0 的輔助下，合 成含有SOC和GPx序列的76肽核苷酸序列， 并將原有非活性位 點(diǎn)的半胱氨酸替換成其它氨基酸。將合成得到的76肽核苷酸序列與pET22b質(zhì)粒利用T4 DNA 連接酶在16C條件下進(jìn)行過夜連接，構(gòu)建帶有76肽基因序列的重組載體 pET22b-76P 質(zhì)粒。采用 CaCl2 方法將重組載體轉(zhuǎn)入 E.coli BL21 （cysE51）感受態(tài)菌株中，轉(zhuǎn)入含有 50 ?g/mL Kana 的LB固體培養(yǎng)基中在37C條件下培養(yǎng)10h進(jìn)行篩選，挑取單克 隆在含有50 ?g/mL Kana的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離 心收集菌體沉淀提取 p

8、ET22b-76P質(zhì)粒，采用Ndel和XbaI限制 性核酸內(nèi)切酶對pET28b-76P質(zhì)粒在37 C下分別進(jìn)行單酶切和雙酶切4 h,再用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切鑒定。2.276肽的表 ?_與條件優(yōu)化將復(fù)制成功pET22b-76P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌 E.coli BL21（cysE51 ）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過培養(yǎng)和抗性篩選鑒定，篩選出陽 性重組子。 然后配制半胱氨酸營養(yǎng)缺陷型表達(dá)所需培養(yǎng)基， 即采 用Sec替代蛋白中的所有 Cys，進(jìn)行Se-76P的表達(dá)。通過優(yōu) 化菌體培養(yǎng)濃度、Cys終濃度、IPTG誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度及誘 導(dǎo)表達(dá)時間，IPTG誘導(dǎo)劑濃度梯度為千分之零點(diǎn)六、千分之零 點(diǎn)八、千分

9、之一、千分之一點(diǎn)二、千分之一點(diǎn)四，誘導(dǎo)溫度梯度為26C、28C、30C、32C，誘導(dǎo)表達(dá)時間梯度為 2h、3h、4h、 5h、6h，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終確定最優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件，誘導(dǎo)表達(dá)出含硒 76肽。SDS-PAG鑒定含硒表 達(dá)產(chǎn)物并用Ni2+離子螯合層析純化4，純化所用咪唑濃度梯度為 50mM 100mM 150mM 300mM 500mM 最后用 Western blotting 鑒定。利用試劑盒測定表達(dá)后的 76肽的GPx和 SOD舌力。3 結(jié)果分析3.1 酶切鑒定結(jié)果由限制性內(nèi)切酶Ndel和XbaI單、雙酶切后1%瓊脂糖凝膠 電泳鑒定后， 單酶切得到一條明亮的條帶且與重組質(zhì)粒分子量大 小一致， 雙酶切得到兩條明亮的條帶， 兩者之和等于重組質(zhì)粒的 大小，由此可知 pColdI（sp-4）-76P 質(zhì)粒構(gòu)建成功。3.2 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果由SDS-PAG實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1，見18頁）可知表達(dá)純化所得 到的蛋白分子量大小與預(yù)期一致， 誘導(dǎo)前無目標(biāo)條帶， 誘導(dǎo)后可