第五章 放射性藥物

1、第五章 放射性藥物 凡進入體內(nèi)的，用于診斷或治療的放射性核素及其標記化合物統(tǒng)稱為放射性藥物(radio pharmaceuticals)。放射性藥物實際上也是放射性核素標記化合物一個重要部分，只不過對它的要求更為嚴格。它與臨床核醫(yī)學的關密更為密切。§1 放射性藥物的臨床應用一、診斷藥物主要利用放射核素放出的射線。 (一)用于臟器顯像 利用放射性核素進入體內(nèi)的蓄積選擇性和臟器病變組織對放射性藥物攝取的差別，通過顯像儀器來顯示出臟器或病變組織的影像，供臨床診斷。顯像儀種類很多，如：簡單掃描儀、照相機、發(fā)射型計算機斷層（ECT）,正電子發(fā)射型計算機斷層（PET）。顯像分為動態(tài)和靜態(tài)兩種方式

2、。還有平面和斷層顯像，可得到臟器三維立體圖像。 (二)用于功能測定：給病人口服、注射或吸入某種放射性藥物，在體外用功能儀直接測量或測量血、尿、大便的動態(tài)變化，可反映臟器的功能狀態(tài)，如甲狀腺、腎、心肌、胰腺等功能測定。 (三)XCT和ECT的比較：二、治療藥物主要是利用放射性核素放出的射線或射線能引起電離反應，達到抑制和破壞病變組織而進行治療。§2 對放射性藥物的要求一、具有合適射線類型和能量：用于顯像診斷的放射性藥物中的放射性核素應是發(fā)射射線或正電子(+)，最好不發(fā)射或少發(fā)射-、射線，以減少機體不必要的輻射損傷。其射線發(fā)射機率要高，每100個衰變能給出95100個光子，這樣信息密度就

3、高。射線能量最好在100300 kev，此范圍射線適合掃描機、相機和SPET的測量。如是用于治療，應選-或射線，不發(fā)射或少發(fā)射射線，以提高治療效果。射線的能量-應在1 Mev以下，應在6Mev以下。二、具有合適的物理半衰期：診斷用放射性核素的T1/2要在滿足診斷檢查所需時間的前提下盡可能的短，以減少病人的受照劑量。目前臨床上診斷用放射性藥物的核素T1/2大多在幾小時至幾天，條件好的醫(yī)院已用T1/2在幾分鐘的放射性藥物。治療用的放射性藥物T1/2不宜太短，一般在1到8天，以保證療效。三、毒性?。阂筮M入體內(nèi)的放射性核素及其衰變產(chǎn)物的毒理效應小，若有毒性，應用時要嚴格控制在無毒性反應的范圍內(nèi)。最好

4、核素的衰變產(chǎn)物是穩(wěn)定性核素。另外，放射性藥物的核純度、比活度及放化純度高，不僅能提高藥物效果，還能減少毒副作用。§3 放射性藥物的攝取機制 放射性藥物進入體內(nèi)，在顯像、功能測定及治療中，都依據(jù)其攝取的機制，主要有以下七個方面： (一)功能性吸收與排泄：臟器的某些細胞，由于各種各樣的原因，能選擇性地吸收某種放射性藥物，并通過某些組織器官排泄或分泌。在此過程中放射性藥物未經(jīng)受代謝變化，如腎小管上皮細胞對131I-鄰碘馬尿酸的吸收、99mTC-DMSA被腎小管吸收并經(jīng)腎臟排泄等，這就是腎功能測定和腎顯像的機制。所以，放射性藥物在某些組織器官中吸收的數(shù)量、速度以及分布情況，可以反映疾病時功能

5、和形態(tài)的改變。所吸收的放射性藥物，還可能對某組織器官造成過量照射而實現(xiàn)對疾病的治療。 (二)運轉及參與代謝：通過某些藥物的主動轉運參與細胞內(nèi)的有關代謝過程研究特異器官的功能,進行功能測定或顯像。例如，用131I檢查甲狀腺功能，當?shù)饣镞M入體循環(huán)時，被甲狀腺細胞攝取。59Fe參與血紅蛋白合成而濃集于骨髓。75Se被胰腺吸收和利用并使之顯像。這些機制都是運轉及參與代謝。 (三)離子交換作用：99mTC-焦磷酸鹽用于骨顯像，是因為焦磷酸鹽能與骨中PO3-4交換，實現(xiàn)濃聚而進行顯像的。這是由于該顯像劑從血液彌散入細胞外液，骨的多孔的礦化表面被此液所包圍，磷酸酪合物迅速地通過離子交換固定于骨的固相，并摻

6、入羥基磷灰石晶格中，在骨的活性和血流增加的部位(如正愈合的骨區(qū)、原發(fā)或繼發(fā)腫瘤區(qū))，放射性濃度增高，這就是骨顯像的機制。 (四)簡單的彌散和分布：將放射性藥物引入體內(nèi)某空間，可顯示該空間的大小和形態(tài)。例如放射性惰性氣體133Xe(133氙)從呼吸道吸入或以其生理鹽水溶液的形式靜脈注入，均可彌散至肺泡內(nèi)，進行肺功能測定及顯像。若將24Na或32P皮內(nèi)注射，放射性通過彌散進入微血管而從局部清除，其半清除時間亦反應局部血流情況，整形外科常用此法測定管狀皮瓣的血運等。 (五)細胞吞噬和胞飲作用：當細胞與環(huán)境中某種物質的顆粒接觸時，如果適合細胞功能的要求，細胞膜與顆粒接觸的部分便開始內(nèi)陷，其周圍則伸出偽

7、足，并逐漸將顆粒包住，最后以膜包顆粒的形式進入細胞。如果進入的顆粒是固體物則稱吞噬，進入的是液體則稱胞飲。肝、脾、骨髓的內(nèi)皮系統(tǒng)具有識別和吞噬外來顆粒的功能。故放射性藥物集中于這些器官而顯像。例如，利用脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞可吞噬衰老，死亡的紅細胞，故用標記的變性紅細胞進行脾顯像。利用白細胞有吞噬膠體顆粒的功能，故可用放射性膠體標記白細胞，借此進行濃腫和血栓定位診斷等。 (六)毛細血管阻斷：放射性大顆粒聚合白蛋白或微球，當其顆粒直徑超過肺毛細血管直徑(10m)時，在靜脈注射之后無法通過肺毛細血管，而造成暫時性的均勻性栓塞，其分布與肺血流成比例，由此可觀察肺內(nèi)血流情況，用于肺顯像。小部分小血管阻塞、

8、幾小時后顆粒自行降解。 (七)特異導向結合：根據(jù)受體與配基、抗體與抗原結合具有高特異性，高親和性的特點，用適當?shù)姆派湫院怂貥擞浀呐潴w或抗體，使之導向到含有高密度受體或抗原的靶器官或靶組織，達到顯像或治療的目的。例如用11C-去甲腎上腺素與心肌腎上腺素能神經(jīng)末梢結合，濃集于心肌。123I-IBZM是多巴胺D2受體阻斷劑而顯示腦內(nèi)部位D2受體分布位置與數(shù)量。99mTC標記抗CEA單克隆抗體及131I標記AFP抗體，可分別進行結腸癌和肝癌的診斷治療。131I標記抗人精漿蛋白抗體用于前列腺癌轉移灶的顯像等。§4 放射性核素發(fā)生器 放射性核素發(fā)生器(radio nuclide generato

9、r)：是一種從長半衰期放射性核素(母體)中分離得到短半衰期的衰變產(chǎn)物(子體)的一種裝置，俗稱母牛(cow)。一、基本特性 (一)放射性衰變和生長的相互關系：在目前所發(fā)現(xiàn)的兩千多種放射性核素中，多數(shù)核素的衰變并不產(chǎn)生穩(wěn)定核素，即衰變的子體產(chǎn)物仍然是放射性核素，這就使得一些相關的放射性核素之間構成了“衰變鏈”。放射性核素發(fā)生器就是把特定的衰變鏈中某一個所需的放射性核素從它的母體中分離出來的裝置。由于母體和子體之間半衰期的差別，這種分離可以以一定的時間間隔反復多次地進行，直至母體衰變完，就好象母?？梢悦刻彀磿r擠奶一樣。 (二)理想的醫(yī)用核素發(fā)生器的條件：各種放射性核素之間構成的衰變鏈為數(shù)眾多，但不是

10、都可以來制備核素發(fā)生器。一個“理想的”醫(yī)用放射性核素發(fā)生器必須滿足一定條件，主要有： 1、母體核素應有足夠長的半衰期，以保證制成的發(fā)生器有足夠長的使用壽命，且要求母體核素易于制備，成本低。 2、子體核素具有較短的半衰期，能發(fā)射適宜于體外探測的中能射線或特征X射線，子體核素的再衰變產(chǎn)物應為穩(wěn)定核素或放射性活度很低的長半衰期放射性核素。 3、子體核素具有活潑的化學性質，其化學形態(tài)具有高的放射性純度和放射化學純度，以及高的比活度。 4、發(fā)生器的結構簡單，操作簡便、快速、安全及產(chǎn)量高且在短期內(nèi)可重復使用。 5、無菌、無熱源、符合國家藥檢標準。目前應用最廣泛的核素發(fā)生器是99Mo-99mTc與113Sn

11、- 113mIn兩種。 99Mo-99mTC發(fā)生器大都采用裂變產(chǎn)物所獲得的99Mo，先純化處理成(鉬酸銨)(NH4)2 99MoO4溶液，將其注入發(fā)生器玻璃層析柱內(nèi)，柱內(nèi)預先裝入Al2O3吸附劑約510 g，顆粒為200300目，并用PH4.3±0.5，0.01 mol/L的HCl液平衡沖洗。99Mo2-4有二個離子電荷，與Al2O3結合較牢固，而衰變子體99mTCO4-只有一個離子電荷，結合較弱。用滅菌生理鹽水淋洗可以把結合弱的99mTCO4-洗下，99MoO2-4仍留在柱上。滅菌生理鹽水不僅洗脫效率高(70%80%)，而且收集到的洗脫液不必調(diào)PH即可口服或注射。1、鋁罐，2、玻璃

12、交換柱，3、篩板，4、淋洗液排出管，5、鉬酸鋯膠體，6、生理鹽水進口接頭，7、8、14、連接膠管，9、空氣過濾，10生理鹽水瓶，11、發(fā)生器提把，12、小鋁罐，13、淋洗液收集瓶，15、淋洗液出口接頭，16、裝料管頭，17、塑料外殼二、锝的放射性藥物制備。（略）三、锝標記藥物的應用。（略） §5 放射性藥物的質量檢驗和管理一、放射性藥物的質量檢驗（一）物理檢驗 1、物理狀態(tài)：從顏色和透明度及大小合適的顆粒度考慮。 2、放射性核素純度：要求大于99%。 3、放射性活度：適宜的活度、尤對兒童、孕婦、哺乳婦用藥劑量要慎重。（二）化學檢驗 1、放射化學純度：要求大于95%。 2、化學純度：常

13、采用光譜法測定。 3、PH和離子強度：理想的放射性藥物的PH值應為7.4的等滲溶液。（三）生物檢驗1、無菌檢驗和滅菌：一般采用微生物培養(yǎng)法進行無菌檢驗?？刹捎酶邏簻缇蜻^濾除菌，根據(jù)藥物性質采用不同方法。2、熱源試驗：熱源是注射后導致發(fā)熱反應的毒素，主要是細菌內(nèi)毒素。放射性藥物在制備過程中要防止帶入熱源物質。3、毒性試驗：放射性藥物的主要毒性是輻射損傷，這種損傷程度可以由估算內(nèi)照射吸收劑量來判斷。二、放射性藥物管理 1、放射性新藥的管理：放射性新藥是指我國首次生產(chǎn)的放射性藥品，已生產(chǎn)的放射性藥品，凡增加新的適應證、改變給藥途徑和改變劑型亦屬新藥范疇。放射性新藥的研制內(nèi)容包括工藝路線、質量標準、

14、臨床前藥理及臨床研究。 2、放射性藥品生產(chǎn)、經(jīng)營的管理：放射性藥品生產(chǎn)、經(jīng)營的單位必須持有相應的許可證。1、 放射性藥品使用的管理：須符合放射性同位素衛(wèi)生防護管理有關規(guī)定。第六章 放射性核素示蹤技術 放射核素示蹤技術是利用放射性核素及其標記化合物作為示蹤劑，應用射線探測方法來檢測它的行蹤，以研究示蹤劑在生物體系或外界環(huán)境中運動規(guī)律的核技術。§1 放射性核素示蹤技術的原理及特點一、基本原理 放射性核素示蹤實驗的原理基于兩個方面：一是放射性核素及其標記化合物和相應的非標記化合物具有相同的化學及生物學性質；二是它們之間有不同的物理性質，即放射性核素能發(fā)出各種不同的射線，可被放射性探測儀器所

15、測定或被感光材料所記錄。二、主要特點 1.靈敏度高：最精確的化學分析只能測10-12 g水平，而放射性示蹤技術可測出10-1410-18 g水平，因而對研究體內(nèi)或體外實驗系統(tǒng)內(nèi)的微量物質具有特別價值。 2.檢測方法簡單多樣。3.合乎生理條件：許多被研究的物質是系統(tǒng)內(nèi)原有的成分，并且通常處于動態(tài)平衡狀態(tài)，其含量及分布維持穩(wěn)定狀態(tài)。如果引入該物質量少而無標記，則其很快即由內(nèi)源性物質所稀釋而失去蹤跡；如果引入該物質為大劑量則造成系統(tǒng)內(nèi)含量異常，此類實驗不是生理性的。用放射性核素及其標記化合物所用示蹤量足以用核探測儀器測出，但是其化學量可以是很少的，引入后幾乎不會改變體內(nèi)原有物質的含量，所以基本上不會

16、改變體內(nèi)或體外系統(tǒng)的正常生理平衡，實驗結果接近正常生理狀態(tài)物質的變化。4.能定位和定性。比如利用RAG可檢測示蹤劑在組織、細胞內(nèi)的分布情況等。三、基本類型、方法及注意事項 (一)類型：根據(jù)實驗的目的不同，可分以下幾種類型： 1.整體示蹤實驗：指將標記物引入完整的機體，從體外或取標本觀察標記物的去向，以了解機體在生理、病理過程中物質的分布及運動轉化規(guī)律，主要用于研究物質在體內(nèi)的吸收，分布、代謝和排泄等運動規(guī)律以及研究機體組織器官的功能和形態(tài)變化。2.離體示蹤實驗：指從整體中分離出來的組織或細胞等簡單系統(tǒng)進行的實驗。多用于某些特定物質如蛋白質、核酸等的轉化規(guī)律以及某些精細結構的功能研究。3.雙標記

17、示蹤實驗：其原理就是將兩個研究對象包括兩種分子或是一種分子的兩種形態(tài)或是一種分子的兩個部分，分別帶上示蹤原子，通過采用相應的測量方法，分析兩種標記原子的量，觀察它們經(jīng)過運動轉化前后比值的變化，判斷該兩種觀察對象是否具有相同的運轉規(guī)律。 (二)實驗方法及應注意的問題1.實驗準備階段 (1)實驗類型的選擇(補充)：其選擇的原則有： 研究整體吸收、分布、轉運、排泄等問題，只能選擇整體示蹤實驗。 物質在精細結構中的運動規(guī)律，可首先考慮離體示蹤實驗，最好有整體實驗加以驗證。 物質轉化的研究以離體實驗為宜，必要時也應加以整體示蹤實驗。 直接觀察細胞內(nèi)的物質轉化，而且該物質的標記物又無法直接引入細胞時，可以

18、選擇脈沖標記法，也可以用加入示蹤物的前身標記物法，該前身標記物進入細胞，在細胞內(nèi)發(fā)生“示蹤物前身示蹤物代謝產(chǎn)物”的轉變，獲得“示蹤物代謝產(chǎn)物”的信息。對于某些研究，用離體實驗方法易導致錯誤結論，或離體實驗本身的短時性不能給出應有結果時，應采用整體實驗。(2)標記物的選擇：針對不同的實驗類型、實驗目的及實驗周期從以下幾個方面考慮： 射線類型：體內(nèi)示蹤實驗宜選用射線發(fā)射體，如131I、99mTc；離體示蹤或取樣進行離體測定的研究則多選用射線或低能射線發(fā)射體，如3H、14C及125I等。 半衰期：體內(nèi)示蹤實驗一般選用短半衰期核素，體外示蹤實驗可用半衰期長的放射性核素。 放化純度：必須經(jīng)過純化鑒定、放

19、化純度>95%。比活度：根據(jù)示蹤實驗靈敏度要求選擇適當?shù)谋然疃?，整體示蹤實驗時，標記物的引入基本不改變該物質的體內(nèi)含量，同時要求能經(jīng)得起體內(nèi)的稀釋，使放射性測量的統(tǒng)計誤差在允許范圍內(nèi)。當研究的物質含量極微時，要求使用無載體高比活度的示蹤劑。離體實驗條件下，既要考慮到高比活度的標記物可以提高分析靈敏度，但又要考慮到比活度過高的標記物不僅其嚴重的輻射自分解使其自身不穩(wěn)定，還可能造成對實驗系統(tǒng)的輻射損傷效應，尤其是需要較長時間培養(yǎng)的細胞系統(tǒng)。標記位置的選擇：物質轉化的示蹤研究要求采用定位標記示蹤物，而目標記物在代謝過程中應穩(wěn)定、不脫落。當研究的目的只是觀察標記物的去向，而不管其代謝產(chǎn)物，就不需

20、要嚴格定位的標記物。 (3)選擇合適的測量方法：通常根據(jù)選用的核素發(fā)射的射線種類確定用何種方法測量。如固體閃爍測量，液體閃爍測量、放射自顯影等方法。雙標記要用雙標記方法測量。2.實驗階段 (1)示蹤劑量的估算：示蹤劑量的估算不能用簡單的公式來估算，應該綜合考慮。 稀釋作用：放射性核素標記化合物進入機體后，一般要求放射性活度在整個實驗過程中，經(jīng)稀釋后所制得的放射性樣品不能低于本底計數(shù)，必須滿足下式：A·C·E/D>B式中：A.示蹤劑的比活度 C.示蹤劑的用量 E.測量效率 D.稀釋倍數(shù) B本底組織的濃聚作用：由于某些放射性核素有親某種組織的特性，有的放射性核素進入機體后

21、不是完全均勻被稀釋，而可能選擇性地蓄積到某些器官、組織而濃聚。如131I進入體內(nèi)后，有30%或更高可被甲狀腺攝取，給予劑量時就要考慮這個特異性。 實驗周期及安全劑量：根據(jù)試驗周期長短，實驗分析方法，給予途徑等進行安全劑量估算。如，示蹤劑引入機體，要求基本不改變該物質在體內(nèi)的濃度。藥物研究時其化學量不應超過臨床劑量，動物實驗時在不中毒的前提下可適當增大劑量。體外示蹤實驗可用比活度較低的標記物。 對于非均勻分布的標記物還應根據(jù)實驗情況(實驗周期長短、標記物的生物半衰期，標記物在擬觀察的臟器中分布的百分數(shù)，能取得的樣品量，測量上最低需多少dpm等)作一系列估算。(2)示蹤劑引入途徑：根據(jù)實驗類型和目

22、的，對整體動物實驗可采用靜脈、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌胃等。(3)放射性樣品的制備：樣品的制備就是為測量服務，測量的形式主要有三類：取標本在體外測放射性；制成不同水平的切片作放射自顯影；從體外測整體內(nèi)的放射性。因此樣品制備就要適應不同測量類型。(4)數(shù)據(jù)處理：放射性示蹤實驗結果可根據(jù)不同目的選用不同參數(shù)表示，含義也各不相同，概括為以下幾種。 整個臟器的總放射性活度：主要用于研究物質分布的實驗以反映各臟器的相對分布量。對于不同個體的同一臟器來說，該參數(shù)與各個體接受的劑量成正比，故各個體的劑量不同時應換算成所給劑量的%，或對劑量進行校正。 放射性含量：dpm/mg組織或ml體液、dpm/m

23、g蛋白或DNA等。用以反映不同組織濃集某種物質的能力。對不同個體來說，該參數(shù)與單位體重接受的劑量成正比，故要求各個體接受的劑量按單位體重計算是相等的，否則應作相應的校正。比活度：dpm/mmol或mg化合物。主要用于研究內(nèi)源性物質的動態(tài)分布或代謝。它受三個因素的影響，即與引入的放射性活度成正比；與組織中非標記物含量成反比；與示蹤物被清除的速度成反比。相對比活度：兩個解剖部位中同一化合物比活度的比值或兩種化合物比活度的比值。用于反映組織中某物質的來源及組織與血液交換的速率，可排除血液中比活度不恒定的影響。四、示蹤實驗中的同位素效應 (一)同位素效應的概念：物質轉化時，如分子中某一原子被它的同位素

24、所取代，雖然反應性質不變，有時卻會發(fā)生反應速度的改變，稱為同位素效應(isotope effect)。 (二)同位素效應的類型 1.初級同位素效應：反應直接涉及同位素所在的鍵時，同位素效應比較嚴重，稱初級同位素效應(primary isotope effect)。 2.次級同位素效應：同位素效應發(fā)生在鄰近的化學鍵稱繼發(fā)同位素效應或次級同位素效應(second isotope effect)。 3.溶劑同位素效應：溶劑中某種原子被同位素取代后影響溶質的反應速度稱之。 4.生物體系的同位素效應：示蹤劑引入生物體后，由于同位素效應的存在會影響有關的各種生化反應，這種情況稱為生物體系的同位素效應。&#

25、167;2 放射性核素稀釋法一、概念 放射性核素稀釋法(radionuclide dilution technique)即用適當?shù)姆派湫院怂貥擞浕衔镒鳛槭聚檮?，利用化學上的稀釋原理對微量物質作定量分析，或測定液體容量的方法。二、基本原理 依據(jù)化學物質在稀釋前后質量不變的原理，放射性物質在被稀釋前后，其放射性活度也不會改變。但是，由于被稀釋，它的單位質量或體積內(nèi)的放射性活度(即比活度或放射性濃度)降低了。設質量為m1的標記物的比活度為s1與質量為m2的同一種化學形態(tài)的非示記物均勻混合，則標記物被非標記分子所稀釋，混合物的比活度為s2，混合前后的總放射性應相等。即： s2(m1+m2)=s1m1

26、(61) 如果m1和m2中有一個量為已知，只需測定混勻后樣品(取任意量)的比活度，就可算出另一量。三、基本方法 (一)核素正稀釋法(direct nuclide dilution)：用已知量的標記物測定未知量的非標記物的稀釋法稱為核素正稀釋法。方法要點是：將一定量已知比放射性的標記化合物與其非標記化合物的分子均勻混合，直接測定該混合樣品的比放射性，亦可進行提純后測定該樣品的比放射性。根據(jù)比放射性的降低來計算非標記化合物的含量。設：m1標記化合物的量；A標記化合物的放射性；S1標記化合物的比活度；S2稀釋后混合液的比活度；mx樣品中待測化合物的量根據(jù)公式 S2(m1+m2)=S1m1得： mx=

27、m·(S1/S2-1)這是正稀釋法的基本公式。 示例某樣品內(nèi)含有微量磷酸鈉(Na3PO4)，加32P標記的磷酸鈉(Na332PO4)0.05 mg，其放射性計數(shù)為1950 cpm，混勻后分離得純品磷酸鈉0.1 mg，放射性計數(shù)為600 cpm，求樣品中磷酸鈉的含量。解：已知A=1950 cpm, m1=0.05 mg, S1=1950/0.05=39000(cpm/mg)S2=600/0.1=6000 cpm/mg,代入式62得：mx=0.05×(39000÷6000-1)=0.275 mg (二)核素反稀釋法(inverse nuclide dilution)：

28、用已知量的非標記物測定樣品中標記物含量的方法稱之為核素反稀釋法。方法要點是：在體內(nèi)示蹤實驗時，設標記物的化學量為mx，已知標記物的比活度為S1，加入非標記物的化學量為m，均勻后分離出純品(標記物+非標記物)的比活度為S2，根據(jù)稀釋法的基本公式(62)，得：mx=m S2/S1-S2 (63)這就是反稀釋法基本公式。凡是標記物在樣品中的化學量少，并混有放射性雜質，欲求其含量，只要知道該標記物的比活度，都可用反稀釋法進行定量。 示例用14CO2通過植物光合作用生成放射性蛋白質，取其中少量蛋白質經(jīng)水解后分離出部分谷氨酸測得比活度為254 dpm/mg，欲求谷氨酸的含量，取126 mg放射性蛋白樣品，

29、水解后加入非標記谷氨酸10.7 mg，混勻后分出少部分谷氨酸測比活度為382 dpm/mg。求標記谷氨酸的量及蛋白中標記谷氨酸的重量百分比?解：已知m=10.7 mg S1=508 dpm/mg S2=382 dpm/mg，代入公式(63)得mx=10.7×382/508-382=32.44 (mg)標記谷氨酸的量，則標記谷氨酸的重量百分比為：32.44÷126=25.7%。(一) 核素雙稀釋法(double nuclide dilution)：（略）（二）放射性核素稀釋法的應用 放射性核素稀釋法當初建立時，曾大量用于體外樣品的定量工作。但自從靈敏度更高的放射免疫分析方法及

30、由此發(fā)展起來的非放射性分析方法推廣以來，現(xiàn)已較少使用。但是在某些領域，核素稀釋法仍有不可取代的優(yōu)越性。一是測定生理性物質的體內(nèi)代謝庫或測定整體內(nèi)各種體液成分的量，二是作為考核其它超微量分析方法可靠性的參比。 1、測定生理性物質的體內(nèi)代謝庫 體內(nèi)各種生理性物質都有各自的分布范圍，每個分布范圍稱為一個代謝庫。利用同位素稀釋法來測定活體各代謝庫的大小幾乎是絕大多數(shù)物質整體代謝庫的唯一有效方法。例如靜脈注射少量高比活度的3 H-膽酸，待其在包括血漿在內(nèi)的代謝庫混勻后取樣測比活度，按稀釋法原理即可算出體內(nèi)包括血漿在內(nèi)的膽酸代謝庫的大小。 2、整體內(nèi)各種體液成分的量 整體內(nèi)有些體液成分的量也相對恒定，它們

31、不一定是一種特定物質，因此習慣上不稱為代謝庫，但是它們的變化有理論意義和臨床實踐意義。測量它們總量的唯一辦法也是同位素稀釋法。下表是常用的幾種體液成分測量法。四、建立核素稀釋法的條件(注意事項) 1.標記物或非標記物與待測物質在化學性質上要相同。 2.實驗過程中，標記原子在化合物上要穩(wěn)定，否則測定的比活度不準確。 3.標記物的放射化學純度要高。 4.必須確保標記物與非標記物充分混勻，特別是體內(nèi)稀釋實驗時，由于有吸收、擴散等因素，完全混勻的時間，一般需經(jīng)實驗確定。 5.對混勻后的樣品，要有可靠的分離、純化方法。因為混勻后，樣品的比活度恒定，所以樣品的丟失不影響結果的準確性，可采用各種理化的方法進

32、行純化，以確保分離的樣品純凈，測得可靠、準確的比活度。 §3 物質轉化的示蹤研究 研究物質轉化的目的要揭示機體內(nèi)重要生命物質的前身物、中間物、及產(chǎn)物的關系，以完成某種轉化的必要條件。該方法是目前最常用最理想的方法之一，可以在整體、離體的條件下進行，不但能夠對前身物、中間物，產(chǎn)物作用定性分析，還可用來研究前身物轉化為產(chǎn)物的速度，轉化的條件，轉化的機制及各種因素對轉化的影響等。一、摻入實驗(incorporation experiment) (一)基本原理：要研究生物體系中化合物A和B是不是前身物和產(chǎn)物的關系，可將A的適當部位用放射性(或穩(wěn)定性)核素標記。進入生物體系(整體或離體組織)后

33、一定時間，分離出B。如在B中出現(xiàn)較多的標記核素，說明A的標記原子、標記集團或整個標記分子已參入到B中，即證明化合物A是產(chǎn)物B的前身物。(二)主要參數(shù)：最常用的參數(shù)之一是摻入百分率(incorporation percen rate)，表示引入的前身物分子能轉變?yōu)楫a(chǎn)物的百分率，亦稱相對參入量，可對前身物和產(chǎn)物的關系作出定量測定，按下式計算：摻入百分率=產(chǎn)物的總放射性/前身物的總放射性×100%，上式中產(chǎn)物的總放射性并不反映前身物轉化為產(chǎn)物的總量，這是因為標記前身物進入生物體系后往往被內(nèi)源性前身物所稀釋，而后者形成的產(chǎn)物不帶放射性，因此，形成的非放射性產(chǎn)物越多，產(chǎn)物的總放射性反而越低。為

34、排除產(chǎn)物和前身物分子量不同的影響，通常用比活度來表示各自的放射性，即毫(微)克分子的放射性，然后再計算它們的比值來反映它們的相互關系，這種關系就稱為相對比活度(relative specific activity)，按下式計算：相對比活度=產(chǎn)物的比活度/前身物的比活度式中的前身物比活度是指標記前身物與內(nèi)源性前身物混勻后的測定值，兩者應同時測量。相對比活度反映的是前身物轉化為標記產(chǎn)物的速率，或稱標記前身物的利用率，即摻入率(incorporation rate)。(三)摻入實驗的類型1. 整體(in vivo) 摻入實驗：多數(shù)采用實驗動物，選用適當?shù)臉擞浳镆部稍谌梭w內(nèi)進行。整體實驗有利于觀察某一

35、物質在體內(nèi)轉化的全貌，某些酶系統(tǒng)作用的研究有時只能在整體進行。如果實驗設計合理，整體參入易于得出最后結論。但由于體內(nèi)有循環(huán)交換及代謝旁路，不易弄清轉化過程的細節(jié)。 2. 離體(in vitro) 摻入實驗：研究物質轉化過程的細節(jié)常采用離體摻入實驗，實驗條件易于控制，有利于在分子水平闡明轉化過程的具體步驟，轉化條件及影響因素。一般用于離體摻入實驗的生物材料主要有組織切片、組織勻漿、游離細胞、 亞細胞顆?；驘o細胞酶系統(tǒng)，要求研究材料保持生理活性，至少在進行實驗期間能與引入的標記物相互作用。應用較多的是組織勻漿。必須注意的是：離體實驗得出的結果只能看作是提出了一種可能，應作綜合評價。(四)基本方法

36、1.選擇合適的標記物。根據(jù)待測代謝物的特定，選用適當前身物并在一定部位進行標記。 2.將標記物引入生物體系。 3.分離產(chǎn)物。根據(jù)不同情況采用不同的分離方法，提取的產(chǎn)物最好制備成溶液。 4.測量產(chǎn)物。放射性測量及物質定量，由此求出比活度。(五)要求與條件 1.標記前身物用量是示蹤量。比活度盡可能高，保證測量結果準確可靠。 2.放化純度要高(>95%)。 3.分離的產(chǎn)物要求達到放化純。(六)應用實例淋巴細胞轉化實驗。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA合成的前身物。人外周血T 淋巴細胞在PHA（植物血球凝集素）的刺激下發(fā)生母細胞轉化而增殖，處于S期的細胞不斷地攝取 TdR用以合成DNA。與此同時，

37、3H-TdR也不斷地被攝入細胞內(nèi)而被放射性標記。通過液閃計數(shù)測量，可了解淋巴細胞增殖活動的情況，借以了解機體的細胞免疫功能。如果用于腫瘤細胞，可以反映活動周期腫瘤細胞的數(shù)量或細胞的增殖活力，對研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，療效觀察及預后判斷具有重要的意義。常用結果的表現(xiàn)形式：3H-TdR摻入百分率、刺激指數(shù)（刺激組與對照組DNA的放射性之比）。細胞周期：G0期（休止期）-G1（DNA合成前期）-S（DNA合成期）-G2（DNA合成后期）-M（分裂期）§4 物質吸收、分布及排泄的示蹤研究一、物質的吸收示蹤實驗 (一)物質吸收百分率：為了盡可能如實反映整體的吸收率，通常都采用整體示蹤技術，尤其以

38、研究消化道的吸收率更為普遍。常用方法有： 1.觀察未吸收的殘余量法：示蹤物一次口服或灌胃后，收集含該示蹤物的全部糞便(通過預實驗確定收集天數(shù))，測定其在糞便中的殘余放射量(令該示蹤物吸收后經(jīng)消化道排出量可以忽略)，則吸收百分率=(攝入量-殘余量)/攝入量。 2.整體計數(shù)法：若已知某示蹤物在體內(nèi)更新很慢，待糞便中放射性排完后用計數(shù)器從體外作整體放射性測量，則吸收百分率=整體放射量/攝入放射量。 3.測定血漿中示蹤物含量法：示蹤物一次靜脈注射后全部進入血漿，隨之血漿內(nèi)示蹤物濃度因清除(組織分布、代謝、排泄等)而逐漸下降?？诜聚櫸锖蟮难獫{示蹤物濃度則是一邊吸收一邊清除的結果。為此，可用測定示蹤物血

39、漿濃度時相曲線下的面積(Area Under Curve, AUC)來表示吸收率。 若用相同劑量的同樣示蹤物分別作靜脈注射和口服實驗，且已知血漿清除速度相同，則口服與靜脈注射兩個時相曲線的AUC比值，稱為絕對生物利用度(Absolute Bioavailability)；兩種方案(不同劑型，或作不同處理)口服時的AUC比值，稱為相對生物利用度(Relative Bioavailability)，見圖6-1a,b。 血漿含量法應注意的問題：應將血漿中的原示蹤物與其標記代謝物分開，以原示蹤物的含量為=依據(jù)。為了排除血漿清除速度不同的差異對實驗結果的影響，最好用雙標記示蹤法，即以同一物質的兩個示蹤劑

40、在同一時間以不同途徑或不同口服方案引入同一機體，以雙標記測量技術求出相應的兩個AUC。若兩個示蹤劑的引入量不同，AUC應歸一化，即換算成各自劑量的%。 4.測定尿排出量法：對于經(jīng)腎臟排出的物質，一次口服示蹤劑后，測定一定時間內(nèi)經(jīng)尿排出的總量，也能反映吸收率。但此法受多種因素影響，如體內(nèi)代謝、貯存及腎功能狀態(tài)等，故使用此法時要周密設計，采取一些特殊措施，否則結果的可信度較差。 (二)物質吸收時化學形態(tài)的示蹤研究(自學)。 (三)物質吸收部位的示蹤研究(自學)。二、物質分布示蹤技術 物質分布是研究結構與功能相互關系的前提，有宏觀、細胞、亞細胞及分子等四個不同水平。它們的基本方法包括以下三個步驟：

41、1.引入示蹤劑：根據(jù)要求達到的不同水平與信息的可靠程度，而采用相應的引入途徑。宏觀水平(即器官水平)用整體示蹤實驗，以靜脈注射(小動物可用腹腔注射)為宜；對亞細胞和分子水平的研究，觀察對象是精細結構或大分子標本，靜脈注射則不易達到具有足夠示蹤物量的要求，故采用試管內(nèi)給予示蹤物法或由特殊途徑給入，例如用腦室注射法，以觀察標記神經(jīng)遞質的分布。 對示蹤劑的要求也視研究目的和達到的水平不同而有差別，首先，因為觀察目的是分布而不是轉化，故不需要嚴格定位標記的示蹤劑，但不可存在有可交換的示蹤核素，否則在體內(nèi)會發(fā)生非代謝性交換而使部分標記原子脫落；其次，對標記物的放射化學純度有嚴格要求，對于原料不純(如不藥

42、有效成分)或放化純度不高的示蹤劑，其實驗結果的可信度差。此外，對比活度的要求，也視觀察水平的不同而有不同的要求。器官水平的可低些，亞細胞及分子水平的則應有高比活度的示蹤劑。 2.觀察分布的方法：觀察方法有放射自顯影技術和取標本測含量等兩類方法，有時為獲得更可靠的結果，可以將兩類方法結合使用。無論何種方法都應區(qū)分原示蹤物和標記代謝物給出的信息，并注意時間因素對分布的影響，即選擇合適的觀察時相。 3.數(shù)據(jù)處理：為了保證結果的可比性，必須選擇合適的參數(shù)。現(xiàn)以取標本測定放射性為例，說明參數(shù)選擇問題：放射性活度應以dpm表示，若探測效率相同時，也可用cpm。以下問題應予注意：為了反映組織或組織內(nèi)某一組分

43、的濃集程度，應將測得的dpm用以下方式之一表達：dpm/組織或dpm/ml體液(器官水平)、dpm/細胞數(shù)(細胞水平)、dpm/mg蛋白或DNA(亞細胞水平)、dpm/mg核酸或蛋白(分子水平)。由于組織或組分的濃集程度還與接觸的示蹤物含量有關，若每克體重的示蹤物劑量不同，則不同個體相互比較時，應作以下校正：1)將測得的dpm除以每克體重的示蹤物劑量，或2)同時測定血漿中放射性含量，再以各組織或組分中的放射性含量除以血漿中放射性含量。當以全臟器的dpm換算為引入示蹤劑的百分數(shù)表達時，由于該參數(shù)不僅與臟器濃集力有關，還與臟器大小有關，故不能直接用它來比較不同臟器對示蹤劑的濃集力。但可作為臟器的功

44、能性指針，例如肝硬化時，攝取某些標記色素的百分數(shù)降低。至于物質分布研究的應用自己看看。三、物質轉運示蹤技術 核素示蹤是研究物質轉運的最重要手段之一。與物質分布示蹤技術一樣，有不同水平的層次，也同樣用ARG和取標本測示蹤物的放射性兩類基本方法。其主要特點是更強調(diào)動態(tài)觀察，而且往往要同時附加一些特定的處理，通過互相參比來說明轉運性質及機制。 (一)血漿組織間的轉運：基本方法是向血液引入示蹤物，不同時間取組織或/及血液測定示蹤物含量。根據(jù)不同的研究目的，主要設計方法有以下幾種： 1.動態(tài)平衡的證實：某物質在組織內(nèi)含量恒定，但能與血液中的該物質進行交換，即處于組織、血液之間的動態(tài)平衡狀態(tài)。為證實這個事

45、實，可將該物質的標記物引入血液，若組織中出現(xiàn)放射性，說明標記物由血液進入組織；若停止向血液引入該標記物，組織中的放射性則逐步下降。 2.組織中物質來源判別：同位素平衡實驗可以證明組織(細胞或亞細胞結構)中的物質是否全部或部分來自其周圍環(huán)境(血液、培養(yǎng)液或胞漿等)。設計方法及原理：將被研究物質的標記示蹤物引入“環(huán)境”后作動態(tài)觀察，若該物質全部來自環(huán)境，則示蹤物在組織內(nèi)外達到動態(tài)平衡后，其組織內(nèi)、外的比活度比值(相對比活度)應為1；若全部由組織自身合成，則組織內(nèi)放射性比活度比組織外小，相對比活度小于1。3.血漿運載蛋白研究：某種物質在血漿中被轉運，是以游離形式或是某些特定的血漿蛋白相結合的形式，可

46、以用核素示蹤法加以證實。方法也很簡便，將被研究物質的示蹤物引入血液中，再取血分離血漿，作血漿涂片ARG或作放射性掃描，先在電泳譜或層析譜上找出這種運載蛋白，再作進一步的性質分析。 (二)生物膜兩側的物質轉運：生物膜包括細胞膜，以及亞細胞顆粒成分與胞漿間的接口結構。生物膜兩側的物質轉運，除了單純擴散外，還有在膜結構中的某些蛋白質幫助下，形成易化擴散以及在某些耗能“泵”作用下的逆轉運(由低濃度側向高濃度側轉運)，稱為主動轉移。因此，生物膜兩側的物質轉運，不僅有利于營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物的運輸，而且與細胞的生理活動密切相關。核素示蹤法是研究這類轉運的重要的甚至是不可缺少的方法。 1.單純擴散研究：將標記

47、物加于生物膜的一側，觀察另一側的放射性以判斷擴散速度。脂溶性強弱和分子量大小，是決定單純擴散快慢的兩個主要因素。藥物的血腦屏障研究就使用這種方法。 2.易化擴散和主動轉運研究：根據(jù)研究目的不同而有不同的實驗設計。對于有腔臟器如腸道，可取出翻轉并結扎兩端，在體外培養(yǎng)中作示蹤實驗，既可以觀察轉運速度，還可以人為地造成濃度梯度、缺能、缺鈉等條件以分析轉運機制。對于一些實質性器官的細胞膜轉運，則通過漿細胞在含有示蹤劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察示蹤物向細胞內(nèi)轉運速度及轉運量；若把已經(jīng)達到同位素平衡的細胞移至無示蹤劑的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，則可觀察物質由細胞內(nèi)向細胞外轉運。還可以改變培養(yǎng)條件來觀察細胞內(nèi)轉運或外轉運

48、的凈變化。方法是：讓細胞在有標記物的培養(yǎng)液中達到同位素平衡，然后在不移去細胞外標記物的條件下加入影響細胞活動的因素，再分離細胞測放射性作動態(tài)觀察(即作時相曲線分析)。 (三)亞細胞水平的物質轉運研究：為了說明亞細胞結構間的物質轉運與細胞機能調(diào)控之間的關系，需進行亞細胞水平的物質轉運研究。常用電鏡ARG動態(tài)觀察或分離亞細胞組分作放射性動態(tài)測量，還可以通過制備亞細胞結構間物質轉運模型，即用一定的化學處理破壞細胞膜的特殊轉運機制，但不打碎細胞，可以得到上述模型。例如用皂甙處理肝細胞，使其胞膜對胞漿中的成分能自由通透。這樣一來細胞內(nèi)的示蹤物量反映顆粒性亞細胞結構中的示蹤物含量，故而可以從改變培養(yǎng)液中的

49、影響因素設計中，分析這些因素在細胞調(diào)控機制間的相互關系。§5 細胞動力學的示蹤 細胞動力學(Cell kinetics)是研究生物體內(nèi)各類細胞的增殖、分化、消亡過程的規(guī)律，包括處于各種狀態(tài)的時間參數(shù)、細胞數(shù)量、分布位置、細胞遷移途徑及更新等。對某些疾病的診斷、治療及估計預后有重要意義。 細胞動力學的研究方法主要有兩大類，即放射性核素標記示蹤和非核素標記示蹤。后者又包括有絲分裂阻斷法及細胞光度測量法，下面?zhèn)戎亟榻B放射性核素標記示蹤。一、示蹤原理 處于S期的細胞因需合成DNA，故可攝取DNA的特異前身物胸腺嘧啶核苷(TdR)合成到新的DNA分子中，由于TdR及其分解產(chǎn)物均為可溶性，而DN

50、A是不溶性的，因此，可通過一定的方法將它們與DNA分子分開。當將放射性核素標記的TdR引入待研究的實驗體系后，放射性就會出現(xiàn)在被標記的細胞中。在細胞動力學研究中最多用的標記化合物為3H-TdR(或14C-TdR)，可采用離體或整體實驗，由于體內(nèi)實驗存在射線輻射的影響，使用受到一定限制。放射自顯影是最常用的方法之一(請參見有關章節(jié))。二、示蹤的具體方法 細胞動力學的示蹤研究最主要的是對細胞進行標記。根據(jù)對細胞的標記時間、次數(shù)以及標記后的采樣情況可將放射性核素標記法分為： (一)一次脈沖標記法：根據(jù)取材方法不同可分為一次取材和多次取材兩種研究方法。 1.一次取材：采用的標記時間較DNA合成期短，將

51、3H-TdR加入含異步細胞群體的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)1560分鐘，以不含放射性的培養(yǎng)液洗滌數(shù)次，將樣本作放射自顯影，計數(shù)標記細胞并按下式計算標記指數(shù)(LI)：LI=Ns/Nc (65)Ns這標記細胞數(shù)，Nc為處于細胞周期中的總細胞數(shù)。由于穩(wěn)定細胞群體中處于某一時相的細胞數(shù)量與該時相的時間成正比，因此，標記指數(shù)LI等于Ts(S期持續(xù)的時間)與Tc(一個細胞周期持續(xù)的時間)之比，即：LI=（Ts）/（Tc） (66)若已知Ts可求出Tc和To(細胞更新時間)。當GF生長分數(shù)=1時：Tc=Ts/LI=To對于按指數(shù)方式生長的細胞群體，根據(jù)下式計算Tc：Tc=（Ts）/（LI）loge2 (67) 2.多次

52、取材：進行一次脈沖標記后，在一定時間內(nèi)多次取材，用自顯影方法觀察處于有絲分裂期的細胞(M細胞)中有3H標記的細胞的百分數(shù)，簡稱標記有絲分裂百分率(PLM)。 PLM=（標記有絲分裂細胞數(shù)）/（有絲分裂細胞總數(shù)）×100%以PLM為縱坐標，標記后時間為橫坐標，可得PLM曲線見圖6-2。上圖6-2是細胞個體間無差異情況下的動力學過程的理想模型。當標記結束，原S期的細胞全部被標記，這些細胞進入M期后，即出現(xiàn)標記M期細胞，期間要經(jīng)過G2期，由于開始一段時間內(nèi)PLM等于零，故G2期為從標記開始至出現(xiàn)標記M期細胞的時間間隔。隨著標記時間的延長，標記的S期細胞陸續(xù)進入M期，PLM逐漸上升并達到最高

53、值(100%)，此間隔即為TM期。當標記的S期細胞全部進入M期，而標記時處于G1期的非標記細胞亦開始進入M期時，PLM開始下降，這標志著所有的原S期細胞均通過M期，此間隔即為Ts期。隨后PLM逐漸下降至零，直到S期細胞再次進入M期，PLM從零又逐漸上升。一個細胞周期時間即指PLM兩次由零上升之間的間隔時間，因此，TG1=Tc-(TG2+Ts+TM) (68)應注意在實際工作中由于被標記細胞的同步化程度及取材時間間隔不同，以及各細胞周期時相的統(tǒng)計漲落的影響，實測的PLM曲線與理論的PLM曲線并非完全相同。如有時曲線的第二峰不能達到100%，計算細胞各參數(shù)時常采用曲線上50%的截點(見圖6-2)。

54、因此，TG2期為從標記開始到標記M期細胞達50%的時間，實際上是TG2+TM/2，因TM為較短的時相，誤差較小。Ts為曲線第一個波峰的兩個50%之間的間隔；TC為第一個波峰和第二個波峰上升至50%兩點間的時間；第一峰下降段的50%點與第二峰上升段的50%點間的時間間隔為TG1+TG2。此法不能求出TM，但若能精確測出TG2，可由TG2+TM/2計算TM。PLM法的局限性為不適用有絲分裂指數(shù)低的細胞組織，此外實驗時需多次取材，工作量比較大。除PLM法外，也可采用銀粒計數(shù)減半法(grain count halving method)研究細胞動力學。方法是：將3H-TdR脈沖標記后，在不同的時間間隔內(nèi)多次取材制備自顯影標本，計數(shù)標記核上的平均銀粒數(shù)，平均銀粒降低到原計數(shù)的一半所需的時間即為細胞周期時間。以本法進行細胞動力研究時要求細胞群體具有一定的同步化程度，故其應用受到較大限制。(二)二次脈沖標記法：對待測細胞群體用不同核素(如3H-TdR和14