缺氧誘導(dǎo)因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的表達(dá)

1、                  作者：駱耐香，陳森洲，王險(xiǎn)峰，侯巧燕  【摘要】  目的探討缺氧誘導(dǎo)因子-1（hif-1）在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中的表達(dá)情況。方法采用rt-pcr、免疫組化法檢測(cè)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)組織中hif-1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果hif-1蛋白在正常大鼠關(guān)節(jié)組織中不表達(dá)，但在ra模型中表達(dá)，且表達(dá)隨模型時(shí)間的延長而增加。結(jié)論hif-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá), 并與炎癥嚴(yán)重程度

2、呈正相關(guān)，提示hif-1對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展起重要作用。 【關(guān)鍵詞】  缺氧誘導(dǎo)因子-1； 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； rt-pcr； 免疫組化abstract：objectiveto investigate the expression of hypoxia - inducible 1 alpha (hif - 1) in ra mice. methods imunohistochemistry and rt-pcr were used to detect the expression of hif - 1 in the joint tissues of ra mice. results

3、the joint tissues of mice showed no detectable hif - 1. in contrast, increased level of hif - 1 was found in ra mice.the upregulated expression of hif - 1 in ra mice models had close relationship with ra severely. conclusionhif - 1 plays an important role in the occurrence and progression of ra. key

4、 words： hypoxia - inducible factor 1alpha (hif - 1);   rheumatoid arthritis（ra）;   rt-pcr;   immunohistochemistry    hif-1(hypoxia inducible factor-1)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞氧平衡和缺氧反應(yīng)基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子, 是在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的, 調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)下的能量代謝和氧的運(yùn)輸, 是體內(nèi)維持細(xì)胞內(nèi)氧平衡的主要調(diào)控因子1。在缺氧條件下，hif-1蛋白及其

5、靶基因表達(dá)增加。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, ra)是一種原因未明且多發(fā)的全身自身免疫性疾病，其關(guān)節(jié)腔為缺氧微環(huán)境，基本病理改變主要是滑膜慢性炎癥及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞，臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進(jìn)行性病程，并可致多個(gè)關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，最終導(dǎo)致功能的喪失。有關(guān)ra組織中hif-1的表達(dá)及作用, 目前國內(nèi)少見報(bào)道。我們采用rt-pcr及免疫組化方法檢測(cè)正常大鼠、ra模型大鼠中hif-1的表達(dá)情況, 旨在探討hif-1在ra發(fā)生發(fā)展中的作用。1  材料1.1  動(dòng)物模型制作30只體質(zhì)量為180200g 成年wistar大鼠（雌雄不拘），24只參

6、照熊國林等2制作大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的方法造模，6只正常飼養(yǎng)。1.2  組織準(zhǔn)備24只模型動(dòng)物分期分批，每批4只分兩組分別用1%戊巴比妥鈉(50 mg/ kg)作腹腔注射。深麻醉下，一組快速開胸經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈快速灌注7090 ml生理鹽水，再以0.1 mol/ l磷酸緩沖液(pb，ph 7.6，由nah2po4和na2hpo4各適量加雙蒸水配置而成) 配制的4%多聚甲醛400 ml灌注固定，灌注固定后立即取膝關(guān)節(jié)周圍軟組織，置4%多聚甲醛中后固定2h，之后脫水、石蠟包埋，恒冷切片機(jī)切片, 片厚4 m, 切片裱貼于賴氨酸涂布的玻片上，用于he染色和免疫組化染色。另一組在深麻醉

7、下取關(guān)節(jié)組織用于rna的提取。6只正常大鼠分兩組按上述方法分別取組織用于he染色、免疫組化染色及總rna提取。2  方法2.1  rt-pcr取下的關(guān)節(jié)組織用trizol試劑按試劑盒說明書提取組織總rna。按我們?cè)仍O(shè)計(jì)的引物及反應(yīng)條件獲得產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳3。2.2  he染色切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，滴加蘇木精染液20min，蒸餾水返藍(lán)5min，鹽酸酒精分色，蒸餾水沖洗，伊紅染液復(fù)染，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用裝有數(shù)碼照相機(jī)的顯微鏡觀察并拍照。2.3  免疫組化染色  所有切片經(jīng)脫蠟、水化后，為更

8、好暴露核抗原，將切片用edta（ph9.0，邁新公司產(chǎn)品）做熱修復(fù)20 min。為消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片用3%h2o2室溫孵育20min后，用0.01 mol/l的pbs緩沖液（ph 7.4）沖洗3次共10 min。濾紙吸干后加入濃縮型鼠抗hif-1單克隆抗體（newmaker，150稀釋）中4孵育過夜， 0.01 mol/l的pbs緩沖液（ph 7.4）沖洗10 min，加50 l maxvisiontm即用型二抗（邁新產(chǎn)品）中室溫孵育15 min后，0.01 mol/l的pbs緩沖液（ph 7.4）沖洗10 min，最后, 在dab顯色液（邁新產(chǎn)品）中反應(yīng)5 min，蒸餾水沖洗，

9、蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，用裝有數(shù)碼照相機(jī)的顯微鏡觀察并拍照。用pbs代替一抗做陰性對(duì)照，陽性對(duì)照片用已知人宮頸鱗癌陽性片（本院病理科切片）。hif-1以細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為陽性。將照片在adobe photoshop 中作圖像處理。選出樣片，組版，打印。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用spss 10. 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，樣本率的比較采用2 檢驗(yàn)；參數(shù)間的相關(guān)性采用kappa 值檢驗(yàn)。3  結(jié)果3.1  he染色  肉眼可見大鼠ra模型關(guān)節(jié)局部組織充血。鏡下可見關(guān)節(jié)腔滑膜增生、炎癥、細(xì)胞增殖、肉芽腫形成，軟骨及

10、骨組織破壞（圖1a）。3.2  免疫組化染色觀察  hif-1蛋白的表達(dá): 正常大鼠關(guān)節(jié)組織中檢測(cè)不到hif-1免疫陽性細(xì)胞，而模型組hif-1陽性反應(yīng)物為棕黃色顆粒, 主要位于關(guān)節(jié)細(xì)胞的胞核及胞漿中，并且hif-1的表達(dá)隨著模型時(shí)間的延長而增多（圖1b）。正常組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( p0.05）。3.3  rt-pcr結(jié)果觀察rt-pcr結(jié)果經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后獲得一條約2.5 kb的清晰條帶(圖2)。4  討論    hif-1是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞對(duì)缺氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)受氧濃度調(diào)節(jié)。hif-1呈固定表

11、達(dá)，hif-1 的活性主要由hif-1決定。通常hif-1只能在低氧情況下穩(wěn)定表達(dá),氧濃度< 6 %時(shí)，hif-1含量呈指數(shù)級(jí)上升，氧濃度< 0. 5 %(相當(dāng)于氧分壓1.332.00 kpa) 時(shí)其含量達(dá)最高峰。細(xì)胞缺氧時(shí)，hif-1穩(wěn)定表達(dá)并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，同時(shí)hif-1從胞漿轉(zhuǎn)移到核，兩者聚合成hif-1分子而發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子的作用。在多種病理狀態(tài)中，hif-1的表達(dá)異常。4.1  ra關(guān)節(jié)腔為缺氧微環(huán)境，滑膜中表達(dá)hif-1佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型(aa)4 主要表現(xiàn)為多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，比較接近人體ra。ra病變關(guān)節(jié)腔的滑膜細(xì)胞大量增加，滑液量增多，壓迫滑膜毛細(xì)血管致

12、其血流減慢，導(dǎo)致ra關(guān)節(jié)腔為缺氧環(huán)境，滑膜中表達(dá)hif-1。早在1970 年，lund-olesen 報(bào)道ra患者的關(guān)節(jié)腔為缺氧環(huán)境，氧分壓(po2)為3.60kpa，骨關(guān)節(jié)炎(oa)患者中為5.73kpa ，正常對(duì)照組為8.40kpa。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ra患者中po2和疾病嚴(yán)重程度(病理學(xué)評(píng)分)負(fù)相關(guān)。最近研究表明5 ，hif-1的水平的調(diào)節(jié)不僅僅由氧濃度調(diào)節(jié)，多種細(xì)胞因子和生長因子已被證實(shí)在正常氧濃度下使hif-1蛋白的穩(wěn)定性增加及其靶基因的表達(dá)增加。gatromanolaki6 等則報(bào)道hif-1在ra和oa滑膜中的表達(dá)均升高，且主要在成纖維細(xì)胞表達(dá)，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有部分

13、表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜中沒有或檢測(cè)不到hif-1，而模型大鼠則有表達(dá)，并隨模型時(shí)間的推移而表達(dá)增加，說明模型時(shí)間越長，關(guān)節(jié)腔缺氧越嚴(yán)重。4.2  hif-1在ra的發(fā)病機(jī)制中可能參與調(diào)控糖酵解代謝啟動(dòng)并持續(xù)髓細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)髓細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，包括粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞，在ra的整個(gè)病理過程中占重要地位。無論在缺氧還是有氧情況下，髓細(xì)胞均依賴糖酵解產(chǎn)生atp供能，這與髓細(xì)胞中線粒體含量甚少有關(guān)。糖酵解過程的抑制劑可抑制髓細(xì)胞的上述作用，而線粒體呼吸鏈抑制劑則無此作用。hif-1通過調(diào)控糖酵解通路影響髓細(xì)胞功能。hif-1表達(dá)增加使糖酵解作用增強(qiáng)，髓細(xì)胞能

14、量供給充足，從而發(fā)揮聚集、粘附、游走、浸潤、吞噬等作用啟動(dòng)炎癥反應(yīng)并使之持續(xù)。cramer等7在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在hif-1基因缺失的髓細(xì)胞，無論在缺氧環(huán)境還是正常氧濃度下，其atp和乳酸的含量均明顯降低，而乳酸含量是髓細(xì)胞活化發(fā)揮炎癥作用的標(biāo)志之一。體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證明在髓細(xì)胞hif-1基因缺失的急性或慢性炎癥小鼠模型中，hif-1基因缺失組較野生型組疾病嚴(yán)重程度降低。    hif-1在ra發(fā)病機(jī)制中作用的深入研究將有助于進(jìn)一步闡明ra的本質(zhì),并為ra的基因治療領(lǐng)域開辟新途徑。國外有學(xué)者8設(shè)想和嘗試在治療基因的啟動(dòng)子中插入hre的基因序列后轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的

15、巨噬細(xì)胞注入局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)，使治療基因的表達(dá)在hif-1的調(diào)控之下通過巨噬細(xì)胞作用于其它病變關(guān)節(jié)，從而提高基因治療的靶向性與效率。以hif-1為靶點(diǎn)的基因治療方法將會(huì)成為ra等許多疾病治療研究的新方向。【參考文獻(xiàn)】  1semenza gl. hif-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia j. j appl physiol, 2000, 88:1474 .2熊國林，黃海瀟，謝玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備j.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（2）：121.3 陳森洲，王險(xiǎn)峰，

16、駱耐香.低氧誘導(dǎo)因子-1的基因克隆j.右江醫(yī)學(xué)，2007，35（5）：498.4王金榮，王宏偉，韓秀珍,等.靜脈注射丙種球蛋白對(duì)佐劑關(guān)節(jié)炎的作用j.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,24(6):669.5taylor pc, sivakumar b. hypoxia and angiogenesis in rheumatoid arthritisj. curr opin rheumatol, 2005,17(3):293.6gatromanolaki a,sivridis e,maltezos e,et al.upregulated hypoxia inducible factor-1 and hif-2 pathway in rheumatoid arthritis and osteoarthritisj.arthritis res ther,2003,5(4):r193.7cramer t, yamanishi y,clausen be ,et al. hif-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammationj. cell, 2003,112(5):