GSK-3β調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂與原始卵泡形成機(jī)制的研究

1、GSK-3B調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂與原始卵泡形成機(jī)制的研究成年雌性哺乳動(dòng)物的卵巢中不存在生殖干細(xì)胞資源 , 因而出生前后卵巢中形 成的原始卵泡庫(kù)容量就成為其終生可利用的生育力資源。在胚胎期卵巢中 , 卵母 細(xì)胞經(jīng)歷第一次減數(shù)分裂前期后阻滯于核網(wǎng)期 , 隨后少部分的單個(gè)未成熟的卵母 細(xì)胞被周圍的扁平顆粒細(xì)胞包裹 ,形成原始卵泡 , 而大多數(shù)卵母細(xì)胞死亡丟失。 胚 胎期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂異常將直接導(dǎo)致原始卵泡庫(kù)建立障礙。因此, 探究胚胎卵母細(xì)胞內(nèi)精確的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于更好地理解雌性生殖儲(chǔ) 備的建立具有重要意義。糖原合成激酶 3 B (GSK-3B )是一種高度保守的絲、蘇 氨酸激酶,在細(xì)胞內(nèi)

2、發(fā)揮多種催化作用。已知GSK-3B通過磷酸化不同的底物,參 與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成、 細(xì)胞增殖與分化、微管動(dòng)力以及細(xì)胞凋亡等生理過程。然而, 關(guān)于 GSK-3B 在早期卵母細(xì)胞發(fā)生以及原始卵泡庫(kù)建立過程中的功能 研究仍然空缺。針對(duì)這一科學(xué)問題 , 我們展開了以下研究工作。免疫熒光檢測(cè)結(jié) 果證明 ,GSK-3B 在小鼠胚胎期與新生前后卵巢中表達(dá)廣泛 , 分布于體細(xì)胞與卵母 細(xì)胞的胞質(zhì),而卵母細(xì)胞內(nèi)GSK-3B的活性隨胚胎卵巢發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。在功能探究實(shí)驗(yàn)中,通過體外培養(yǎng)添加GSK-3B特異性抑制劑BIO后發(fā)現(xiàn),抑 制 GSK-3B 活性的胚胎卵巢中處于第一次減數(shù)分裂前期的卵母細(xì)胞發(fā)生大量凋

3、 亡, 導(dǎo)致卵巢卵母細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組卵巢。對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的研 究發(fā)現(xiàn),抑制GSK-3B后,胚胎卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程受阻,部分卵母細(xì)胞無(wú)法進(jìn) 入雙線期；同時(shí)DSBs修復(fù)異常的卵母細(xì)胞比例顯著增加。通過對(duì)DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn) 蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK-3B活性后，在胚胎卵巢中負(fù)責(zé)卵母細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)管及 執(zhí)行凋亡的B 63異常地在卵母細(xì)胞中提前表達(dá)，同時(shí)下游凋亡執(zhí)行相關(guān)基因的 表達(dá)也發(fā)生顯著上調(diào)進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：胚胎期卵母細(xì)胞內(nèi)GSK-3B通過磷酸化B -catenin 介導(dǎo)了 B 63的轉(zhuǎn)錄;GSK-3 B受抑制后,B -catenin降解受阻,在胞質(zhì)積累后發(fā) 生入核，激活B 63的轉(zhuǎn)

4、錄，造成胚胎卵母細(xì)胞凋亡。當(dāng)我們同時(shí)拮抗B -catenin的轉(zhuǎn)錄活性時(shí) , 卵母細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象能夠得到拯救。另外 , 在體實(shí)驗(yàn)證明 , 在小鼠 胚胎期與新生前后的卵母細(xì)胞中 , B -catenin 的轉(zhuǎn)錄活性與 B 63 的表達(dá)上調(diào)趨 勢(shì)一致,揭示在卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前期,GSK-3 B通過磷酸化降解B -catenin, 從而維持卵母細(xì)胞的存活 ; 而出生前后原始卵泡大量形成階段 ,GSK-3 B活性下調(diào),B -catenin的轉(zhuǎn)錄活性上升,激活B 63轉(zhuǎn)錄,監(jiān)管卵母細(xì)胞質(zhì)量并 清除有遺傳缺陷的卵母細(xì)胞。為了證明上述體外研究發(fā)現(xiàn)的 GSK-3B調(diào)控卵母細(xì)胞存活的作用,本研究進(jìn) 一步采

5、用體內(nèi)基因敲除小鼠模型驗(yàn)證了GSK-3 B在早期卵母細(xì)胞發(fā)生過程中的必要性。通過構(gòu)建 Cre-LoxP 條件性敲除小鼠模型 , 我們得到在生殖細(xì)胞中特異性 敲除Gsk-3 B的小鼠(conditional KO;cKO)。表型分析顯示,新生1天時(shí),cKO小 鼠卵巢卵母細(xì)胞數(shù)量明顯少于野生型小鼠,與體外使用GSK-3B抑制劑培養(yǎng)胚胎 期卵巢的結(jié)果一致；至新生7天時(shí),cKO小鼠卵巢生長(zhǎng)卵泡數(shù)量與野生型小鼠無(wú)顯 著差異 , 但原始卵泡數(shù)量顯著少于野生型小鼠。同時(shí)我們證明,cKO小鼠卵巢卵母細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡。另外,在新生1天cKO 小鼠卵巢中，DSBs標(biāo)記蛋白與修復(fù)蛋白持續(xù)表達(dá)，表明敲除小鼠卵母細(xì)胞DSBS修 復(fù)發(fā)生了障礙。綜上，本研究證明在小鼠胚胎期卵巢內(nèi),GSK-3B對(duì)于第一次減數(shù) 分裂前期的卵母細(xì)胞的存活具有重要作用。GSK-3B通過調(diào)控B -catenin的