Gpnmb在急性腎缺血再灌注損傷腎臟和抗原提呈細(xì)胞的表達(dá)

1、Gpnmb在急性腎缺血再灌注損傷腎臟和抗原提呈細(xì)胞的表達(dá)急性腎損傷 (acute kidney injury, AKI)是臨床常見(jiàn)病癥 , 具有高患病率和死亡率。 AKI 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜 ,炎癥和免疫反應(yīng)在 AKI 的病理生理進(jìn)展中起重要作 用。巨噬細(xì)胞(macrophages, M © )和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)均為抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APC),是炎癥和免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的重要 成員。有研究證明在 AKI腎臟中,M浸潤(rùn)至腎髓質(zhì),它既可引起腎臟損傷,也能促 進(jìn)腎組織修復(fù) , 但它所起的具體作用還不完全清楚。 在臨床

2、上 ,缺乏早期診斷指標(biāo) 致使診斷及治療延遲是 AKI 至今死亡率仍高的一個(gè)重要原因。 目前最常用的檢測(cè) 指標(biāo)是血肌酐 (serum creatinine, SC r) 、血尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 及血清肌酐清除率 (creatinine clearance rate, CCR), 它們檢測(cè) AKI 的特異性 和敏感性都不高。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)腎臟損傷分子 -1(kidney injury molecule-1, Kim-1) 是一個(gè)高特異性的 AKI 檢測(cè)指標(biāo)。有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋 白(n eutrophil gelati nase-a

3、ssociated lipocali n, NGAL),白介素-18(interleukin-18, IL-18) 和脂肪酸結(jié)合蛋白 (fatty acid binding protein, FABP也可以作為AKI的檢測(cè)指標(biāo)。但所有這些標(biāo)志物尚處于評(píng)估階段,距臨床應(yīng) 用仍有一段距離。所以 , 目前仍然缺乏一個(gè)或一組高特異性高敏感性的指標(biāo)可早期診斷 AKI, 并指導(dǎo)后續(xù)治療非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白 (glycoprotein non-metastatic mela nomab, Gpn mb是一種I型跨膜糖蛋白。它又稱為造血生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)、樹(shù)突狀激肽(hematopoietic growth

4、 factor in ducible n eurok inin, HGFIN)細(xì)胞相關(guān)的硫酸肝素糖蛋白整合素 (dendritic cell-associated heparin sulfate proteoglycan-dependent integrin ligand DC-HIL) 、骨激肽 (osteoactivi n,OA)。它的胞外段包括一個(gè)肝素結(jié)合域、一個(gè)整合素精氨酸甘氨酸門冬氨酸基序、以及一個(gè)多囊腎序列。Gpnm在多種組織細(xì)胞中表達(dá)，如胚胎神經(jīng)系統(tǒng)、胚胎腎單位、皮膚基底層、 毛囊生發(fā)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、陰、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和 DC近年來(lái)的研究表明,Gpnmb可能抑制冊(cè)的

5、炎癥反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞的活化，但它是否在急 性腎損傷中起作用目前還不清楚。 缺血再灌注損傷 (ischemia/reperfusion, I/R) 是引起 AKI 是常見(jiàn)原因之一。急性腎 I/R 動(dòng)物模型是長(zhǎng)期公認(rèn)的 AKI 模型。我們以前的研究對(duì)小鼠和大鼠 I/R模型腎臟進(jìn)行表達(dá)性差異顯示分析，發(fā)現(xiàn)Gpnm基因在急性I/R模型腎臟中 升高明顯，而Gpnm在受損腎臟中的具體表達(dá)位置并不清楚。有體外研究表明 Gpnm基因在MO和DC中表達(dá),Gpnmb蛋白分為膜型和分泌型，但Gpnm在尿液中 的表達(dá)情況目前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。所以我們進(jìn)一步檢測(cè)Gpnm在急性腎I/R動(dòng)物模型腎臟和尿液中的表達(dá)水平 以期能更深入

6、了解 AKI 損傷和修復(fù)的機(jī)制 , 也同時(shí)尋求更實(shí)用的 AKI 早期診斷指 標(biāo)；并在體外實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步探討Gpnmb在 APC及腎臟細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)。本論 文分為兩部分：第一部分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn) , 建立小鼠和大鼠急性腎 I/R 模型, 應(yīng)用 Northern blot 、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative ploymerase chain reaction, qPCR).原位雜交、免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀等技術(shù)，觀察對(duì)照組和I/R組動(dòng)物 腎臟中GpnmbS達(dá)水平,并用免疫熒雙染色對(duì)Gpnm在腎臟的表達(dá)進(jìn)行定位，同時(shí) 用Western blot檢測(cè)Gpnmb在對(duì)照組和I/R組動(dòng)物尿液中的

7、表達(dá)。第二部分為 體外實(shí)驗(yàn) , 原代培養(yǎng)小鼠和大鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞 （bone marrow derivedmacrophages, BMMcp）和小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDC）,并結(jié)合小鼠巨噬細(xì)胞株（RAW264.7細(xì)胞）,觀察Gpnmb在APC （M©和DC）的表達(dá)特點(diǎn)，并對(duì)其作用進(jìn)行初步探討。我們還原代培養(yǎng)了小鼠和大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞 （proximal tubular epithelial cells, PTC）, 并利用不同種屬不同腎小管節(jié)段的細(xì)胞株 （如 LLC-PK1、 NRK 52 e、

8、M D C、K MIMCD3、） 人腎胚胎細(xì)胞株 （293） 及人腎癌細(xì)胞株 （769-p）, 研究 Gpn m是否在腎小管上皮細(xì)胞、腎癌細(xì)胞及腎胚胎細(xì)胞表達(dá)。目的：建立小鼠和 大鼠急性腎I/R模型,觀察在對(duì)照組和I/R組動(dòng)物腎臟中GpnmbnRN和蛋白表達(dá) 水平（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）,并通過(guò)原代培養(yǎng)BMM , BMD和 PTC及巨噬細(xì)胞株及各種腎小 管上皮細(xì)胞株、腎癌細(xì)胞株及腎胚胎細(xì)胞株（體外實(shí)驗(yàn)）,觀察Gpnml這些細(xì)胞中 的表達(dá)特點(diǎn),初步探討Gpnmb勺作用。方法：1、建立小鼠和大鼠急性腎I/R模型： I/R 組小鼠和大鼠予以雙側(cè)腎蒂鉗夾阻斷血流 30分鐘,對(duì)照組（即假手術(shù)組）僅切 開(kāi)皮膚和肌肉

9、, 不作腎蒂血管鉗夾。分別于術(shù)后第 1、 2、 3、 4、 5、 7、 14天處死小鼠和大鼠。留取尿液和血液 , 收集處理腎組織標(biāo)本。通過(guò)檢測(cè)血 . 肌酐, 觀察，腎織織光鏡形態(tài)學(xué)及 Kim-1 和 vimentin 的免疫熒光染色對(duì) I/R 模型進(jìn)行覽鑒定。2、檢測(cè)Gpnmb在對(duì)照組和I/R組腎臟及尿液中的表達(dá)：采用Northern blot, qPCR測(cè)Gpnmb的 mRN表達(dá)水平；采用原位雜交定位 Gpnmb mRN在腎臟中的 表達(dá)部位；米用免疫熒光染色觀察 Gpnml:蛋白在I/R組腎臟中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化； 采用免疫熒光雙染色及流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步確定Gpnm!在I/R組腎組織中APC（M

10、©和DC）和T淋巴細(xì)胞上的表達(dá),并通過(guò)Western blot檢測(cè)Gpnmi在對(duì)照組和I/R 組尿液中的表達(dá)。3、原代培養(yǎng)小鼠和大鼠BMMcp通過(guò)免疫熒光染色和流式細(xì)胞 儀檢測(cè) 腐 表面標(biāo)志物(小鼠：F4/80和CD11b大鼠：CD68),來(lái)驗(yàn)證BMMcp®養(yǎng) 成功與否。通過(guò)以上技術(shù)檢測(cè) Gpnm在BMMc的表達(dá)。然后用不同細(xì)胞因子將 BMMc刺激分化成M1型和M2型BMMcp通過(guò)檢測(cè)M1 型和M2型Mcp的表面標(biāo)志物及所表達(dá)細(xì)胞因子,來(lái)驗(yàn)證M1型和M2型BMMc分 化成功與否。再通過(guò)免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀、Western blot及ELISA等技術(shù)檢測(cè)Gpnm在M1型和

11、M2型BMMc表達(dá)的特點(diǎn)。4、培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞株 (RAW264.7), 分成兩組：一組用脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 處理 24 小時(shí) (LPS組)，另一組不用LPS處理(對(duì)照組),采用qPCR. Western blot及ELISA等 技術(shù),觀察Gpnm在LPS組及對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)。5、原代培養(yǎng)小鼠BMDC能過(guò)免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠 DC的表面 標(biāo)志物(CDllc),來(lái)驗(yàn)證BMD(培養(yǎng)成功與否。再通過(guò)同樣方法檢測(cè) Gpnmb在小鼠 BMD(中的表達(dá)。6、原代培養(yǎng)小鼠和大鼠PTC并培養(yǎng)各不同種屬不同節(jié)段腎小 管的細(xì)胞株(如LLC-

12、PK1 NRK52e、MDCK MIMCD3)人腎胚胎細(xì)胞株(293)及人 腎癌細(xì)胞株(769-P),通過(guò)qPCF或免疫熒光染色檢測(cè)Gpnmb在以上細(xì)胞的表達(dá)。用紅色熒光標(biāo)記的Gpnmb (Gpnmb-Fc-Cy3處理原代培養(yǎng)的小鼠和大鼠 PTC, 檢測(cè)PTC是否結(jié)合或吞噬外源性的Gpnmb結(jié)果：1、小鼠和大鼠急性腎I/R模 型建立成功：(1)SCr :與對(duì)照組相比，1/R組小鼠和大鼠SCr在術(shù)后第1天明顯 升高,于第2天起下降,至第7天基本恢復(fù)到正常水平。(2)光鏡(HE染色):對(duì)照 組腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常 ,I/R 組腎組織可見(jiàn)腎小管腫脹、 壞死、脫落, 管腔擴(kuò)張 , 腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

13、(3)Kim-1( 免疫熒光染色 )：對(duì)照組腎臟組織中 ,Kim-1 很少表達(dá)；在 I/R 組 腎組織 ,Kim-1 表達(dá)升高。 (4) Vimentin( 免疫熒光染色 ) ：對(duì)照組腎臟組織中,Vimentin很少表達(dá)，1/R組腎組織,Vimentin表達(dá)升高。2、Gpnml在小鼠和大 鼠急性腎I/R模型中的表達(dá)升高；(1)Northern blot 、qPCR和原位雜交結(jié)果示： 對(duì)照組大鼠腎臟中Gpnmb mRN表達(dá)低,而在I/R組大鼠腎臟中Gpnmb mRN的表 達(dá)顯著增高。Gpnmb mRN主要表達(dá)在腎髓質(zhì)外部外緣 (outer stripe of outer medulla,OSOM

14、的浸潤(rùn)細(xì)胞中。(2)免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀結(jié)果示：對(duì)照組大鼠腎臟 中,Gpnmb蛋白表達(dá)低，而在I/R組大鼠腎臟中明濕增多。Gpnmk主要表達(dá)在OSOM 的浸潤(rùn)細(xì)胞中。I/R損傷第2天的腎臟中,Gpnmb細(xì)胞位丁 OSO的腎間質(zhì)中,至I/R損傷第4 天，大部分Gpnmb細(xì)胞進(jìn)入了 OSO的腎小管管腔內(nèi)。腎小球和腎小管上皮細(xì)胞 未見(jiàn)Gpnmb表達(dá)。Gpnm與眶標(biāo)志物F4/80、CD68, MHC召CD86等共表達(dá)； Western blot 結(jié)果示：對(duì)照組小鼠尿液中 Gpnml表達(dá)水平很低,而I/R組小 鼠的尿液,Gpnmb在術(shù)后第1天和第2天表達(dá)明顯升高,第3天恢復(fù)到正常水平。3、Gpnmb

15、在原代培養(yǎng)的小鼠和大鼠BMM中表達(dá)：(1)免疫熒光染色結(jié)果示：小鼠BMM中Gpnm與F4/80共表達(dá)；大鼠BMM中,Gpnmb與CD68共表達(dá)。(2) 流式細(xì)胞儀結(jié)果示：原代培養(yǎng)小鼠BMM中有94.7 ± 6.1%細(xì)胞表達(dá)CD11b在CD Ilb+BMM©中Gpnm陽(yáng)性率為75.1 士 4.8%。(3)MO型BMM (未分化型)和M2型 BMM的Gpnml總表達(dá)量沒(méi)有差別，但M1型BMMc的 GpnmbS達(dá)總量增多。相對(duì)于M2型BMIM , Ml型BMIM細(xì)胞培養(yǎng)液中GpnmbS達(dá)高,而細(xì)胞蛋白裂 解液中的表達(dá)較少。根據(jù) Gpnmb在 BMIM的表達(dá)特點(diǎn),BMMcp可分為三

16、種類型： Gpnmb BMM；小單核 Gpnmb+BMJM；大多核 Gpnmb+BMM。4、Gpnml在 RAW264.7 巨噬細(xì)胞株表達(dá)：(1)qPCR和Western blot結(jié)果示,相對(duì)于對(duì)照組，Gpnmb mRNA 表達(dá)和蛋白表達(dá)在LPS組增高(p<0.05)。(2)免疫熒光染色結(jié)果示,有三種類型的RAW264.7細(xì)胞：Gpnmb- RAW264.7 細(xì)胞；小單核 Gpnmb+RAW264細(xì)胞；大多核 Gpnmb+RAW264細(xì)胞。在對(duì)照組 中,Gpnmb多表達(dá)在細(xì)胞核周圍：在 LPS組中,小單核Gpnmb+RAW264細(xì)胞的 Gpnm先進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)小泡,經(jīng)細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞

17、外；而在大多核 Gpnmb+RAW264.7 細(xì)胞中Gpnmt的表達(dá)仍在細(xì)胞核周圍。5、Gpnmb在原代培養(yǎng)的小鼠BMD(表達(dá)： 免疫熒光染色顯示,我們培養(yǎng)的細(xì)胞中大部分表達(dá) CD11c, Gpnmb與CD11c有 共表達(dá)。(2) 流式細(xì)胞儀結(jié)果示 ,在我們培養(yǎng)的細(xì)胞中 ,有70.28±8.25%細(xì)胞為 CD11c 陽(yáng)性；33.51 ± 2.32%CD11c細(xì)胞為Gpnmb陽(yáng)性6、Gpnmbi原代培養(yǎng)的小鼠和大 鼠PTC各腎細(xì)胞株表達(dá)很低： 相對(duì)于RAW264.細(xì)胞,Gpnmb mRN在原代培 養(yǎng)PTC及各腎小管細(xì)胞株(如LLC-PK1 NRK 52e MDCK. MIMCD3)人腎胚胎細(xì)胞 株(293)