Gpnmb在急性腎缺血再灌注損傷腎臟和抗原提呈細胞的表達

1、Gpnmb在急性腎缺血再灌注損傷腎臟和抗原提呈細胞的表達急性腎損傷 (acute kidney injury, AKI)是臨床常見病癥 , 具有高患病率和死亡率。 AKI 發(fā)病機制復雜 ,炎癥和免疫反應在 AKI 的病理生理進展中起重要作 用。巨噬細胞(macrophages, M © )和樹突狀細胞(dendritic cells, DC)均為抗原提呈細胞(antigen presenting cells, APC),是炎癥和免疫反應系統(tǒng)中的重要 成員。有研究證明在 AKI腎臟中,M浸潤至腎髓質,它既可引起腎臟損傷,也能促 進腎組織修復 , 但它所起的具體作用還不完全清楚。 在臨床

2、上 ,缺乏早期診斷指標 致使診斷及治療延遲是 AKI 至今死亡率仍高的一個重要原因。 目前最常用的檢測 指標是血肌酐 (serum creatinine, SC r) 、血尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 及血清肌酐清除率 (creatinine clearance rate, CCR), 它們檢測 AKI 的特異性 和敏感性都不高。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)腎臟損傷分子 -1(kidney injury molecule-1, Kim-1) 是一個高特異性的 AKI 檢測指標。有報導認為中性白細胞明膠酶相關脂質運載蛋 白(n eutrophil gelati nase-a

3、ssociated lipocali n, NGAL),白介素-18(interleukin-18, IL-18) 和脂肪酸結合蛋白 (fatty acid binding protein, FABP也可以作為AKI的檢測指標。但所有這些標志物尚處于評估階段,距臨床應 用仍有一段距離。所以 , 目前仍然缺乏一個或一組高特異性高敏感性的指標可早期診斷 AKI, 并指導后續(xù)治療非轉移性黑色素瘤糖蛋白 (glycoprotein non-metastatic mela nomab, Gpn mb是一種I型跨膜糖蛋白。它又稱為造血生長因子誘導的神經(jīng)、樹突狀激肽(hematopoietic growth

4、 factor in ducible n eurok inin, HGFIN)細胞相關的硫酸肝素糖蛋白整合素 (dendritic cell-associated heparin sulfate proteoglycan-dependent integrin ligand DC-HIL) 、骨激肽 (osteoactivi n,OA)。它的胞外段包括一個肝素結合域、一個整合素精氨酸甘氨酸門冬氨酸基序、以及一個多囊腎序列。Gpnm在多種組織細胞中表達，如胚胎神經(jīng)系統(tǒng)、胚胎腎單位、皮膚基底層、 毛囊生發(fā)細胞、成骨細胞、破骨細胞、陰、視網(wǎng)膜色素上皮細胞和 DC近年來的研究表明,Gpnmb可能抑制冊的

5、炎癥反應和T淋巴細胞的活化，但它是否在急 性腎損傷中起作用目前還不清楚。 缺血再灌注損傷 (ischemia/reperfusion, I/R) 是引起 AKI 是常見原因之一。急性腎 I/R 動物模型是長期公認的 AKI 模型。我們以前的研究對小鼠和大鼠 I/R模型腎臟進行表達性差異顯示分析，發(fā)現(xiàn)Gpnm基因在急性I/R模型腎臟中 升高明顯，而Gpnm在受損腎臟中的具體表達位置并不清楚。有體外研究表明 Gpnm基因在MO和DC中表達,Gpnmb蛋白分為膜型和分泌型，但Gpnm在尿液中 的表達情況目前尚無報導。所以我們進一步檢測Gpnm在急性腎I/R動物模型腎臟和尿液中的表達水平 以期能更深入

6、了解 AKI 損傷和修復的機制 , 也同時尋求更實用的 AKI 早期診斷指 標；并在體外實驗中，進一步探討Gpnmb在 APC及腎臟細胞中的表達特點。本論 文分為兩部分：第一部分為體內實驗 , 建立小鼠和大鼠急性腎 I/R 模型, 應用 Northern blot 、實時熒光定量 PCR(quantitative ploymerase chain reaction, qPCR).原位雜交、免疫熒光染色及流式細胞儀等技術，觀察對照組和I/R組動物 腎臟中GpnmbS達水平,并用免疫熒雙染色對Gpnm在腎臟的表達進行定位，同時 用Western blot檢測Gpnmb在對照組和I/R組動物尿液中的

7、表達。第二部分為 體外實驗 , 原代培養(yǎng)小鼠和大鼠骨髓源性巨噬細胞 （bone marrow derivedmacrophages, BMMcp）和小鼠骨髓源性樹突狀細胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDC）,并結合小鼠巨噬細胞株（RAW264.7細胞）,觀察Gpnmb在APC （M©和DC）的表達特點，并對其作用進行初步探討。我們還原代培養(yǎng)了小鼠和大鼠近端腎小管上皮細胞 （proximal tubular epithelial cells, PTC）, 并利用不同種屬不同腎小管節(jié)段的細胞株 （如 LLC-PK1、 NRK 52 e、

8、M D C、K MIMCD3、） 人腎胚胎細胞株 （293） 及人腎癌細胞株 （769-p）, 研究 Gpn m是否在腎小管上皮細胞、腎癌細胞及腎胚胎細胞表達。目的：建立小鼠和 大鼠急性腎I/R模型,觀察在對照組和I/R組動物腎臟中GpnmbnRN和蛋白表達 水平（體內實驗）,并通過原代培養(yǎng)BMM , BMD和 PTC及巨噬細胞株及各種腎小 管上皮細胞株、腎癌細胞株及腎胚胎細胞株（體外實驗）,觀察Gpnml這些細胞中 的表達特點,初步探討Gpnmb勺作用。方法：1、建立小鼠和大鼠急性腎I/R模型： I/R 組小鼠和大鼠予以雙側腎蒂鉗夾阻斷血流 30分鐘,對照組（即假手術組）僅切 開皮膚和肌肉

9、, 不作腎蒂血管鉗夾。分別于術后第 1、 2、 3、 4、 5、 7、 14天處死小鼠和大鼠。留取尿液和血液 , 收集處理腎組織標本。通過檢測血 . 肌酐, 觀察，腎織織光鏡形態(tài)學及 Kim-1 和 vimentin 的免疫熒光染色對 I/R 模型進行覽鑒定。2、檢測Gpnmb在對照組和I/R組腎臟及尿液中的表達：采用Northern blot, qPCR測Gpnmb的 mRN表達水平；采用原位雜交定位 Gpnmb mRN在腎臟中的 表達部位；米用免疫熒光染色觀察 Gpnml:蛋白在I/R組腎臟中表達的動態(tài)變化； 采用免疫熒光雙染色及流式細胞技術進一步確定Gpnm!在I/R組腎組織中APC（M

10、©和DC）和T淋巴細胞上的表達,并通過Western blot檢測Gpnmi在對照組和I/R 組尿液中的表達。3、原代培養(yǎng)小鼠和大鼠BMMcp通過免疫熒光染色和流式細胞 儀檢測 腐 表面標志物(小鼠：F4/80和CD11b大鼠：CD68),來驗證BMMcp®養(yǎng) 成功與否。通過以上技術檢測 Gpnm在BMMc的表達。然后用不同細胞因子將 BMMc刺激分化成M1型和M2型BMMcp通過檢測M1 型和M2型Mcp的表面標志物及所表達細胞因子,來驗證M1型和M2型BMMc分 化成功與否。再通過免疫熒光染色、流式細胞儀、Western blot及ELISA等技術檢測Gpnm在M1型和

11、M2型BMMc表達的特點。4、培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株 (RAW264.7), 分成兩組：一組用脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 處理 24 小時 (LPS組)，另一組不用LPS處理(對照組),采用qPCR. Western blot及ELISA等 技術,觀察Gpnm在LPS組及對照組RAW264.7細胞中的表達特點。5、原代培養(yǎng)小鼠BMDC能過免疫熒光染色和流式細胞儀檢測小鼠 DC的表面 標志物(CDllc),來驗證BMD(培養(yǎng)成功與否。再通過同樣方法檢測 Gpnmb在小鼠 BMD(中的表達。6、原代培養(yǎng)小鼠和大鼠PTC并培養(yǎng)各不同種屬不同節(jié)段腎小 管的細胞株(如LLC-

12、PK1 NRK52e、MDCK MIMCD3)人腎胚胎細胞株(293)及人 腎癌細胞株(769-P),通過qPCF或免疫熒光染色檢測Gpnmb在以上細胞的表達。用紅色熒光標記的Gpnmb (Gpnmb-Fc-Cy3處理原代培養(yǎng)的小鼠和大鼠 PTC, 檢測PTC是否結合或吞噬外源性的Gpnmb結果：1、小鼠和大鼠急性腎I/R模 型建立成功：(1)SCr :與對照組相比，1/R組小鼠和大鼠SCr在術后第1天明顯 升高,于第2天起下降,至第7天基本恢復到正常水平。(2)光鏡(HE染色):對照 組腎臟組織結構基本正常 ,I/R 組腎組織可見腎小管腫脹、 壞死、脫落, 管腔擴張 , 腎間質炎性細胞浸潤。

13、(3)Kim-1( 免疫熒光染色 )：對照組腎臟組織中 ,Kim-1 很少表達；在 I/R 組 腎組織 ,Kim-1 表達升高。 (4) Vimentin( 免疫熒光染色 ) ：對照組腎臟組織中,Vimentin很少表達，1/R組腎組織,Vimentin表達升高。2、Gpnml在小鼠和大 鼠急性腎I/R模型中的表達升高；(1)Northern blot 、qPCR和原位雜交結果示： 對照組大鼠腎臟中Gpnmb mRN表達低,而在I/R組大鼠腎臟中Gpnmb mRN的表 達顯著增高。Gpnmb mRN主要表達在腎髓質外部外緣 (outer stripe of outer medulla,OSOM

14、的浸潤細胞中。(2)免疫熒光染色和流式細胞儀結果示：對照組大鼠腎臟 中,Gpnmb蛋白表達低，而在I/R組大鼠腎臟中明濕增多。Gpnmk主要表達在OSOM 的浸潤細胞中。I/R損傷第2天的腎臟中,Gpnmb細胞位丁 OSO的腎間質中,至I/R損傷第4 天，大部分Gpnmb細胞進入了 OSO的腎小管管腔內。腎小球和腎小管上皮細胞 未見Gpnmb表達。Gpnm與眶標志物F4/80、CD68, MHC召CD86等共表達； Western blot 結果示：對照組小鼠尿液中 Gpnml表達水平很低,而I/R組小 鼠的尿液,Gpnmb在術后第1天和第2天表達明顯升高,第3天恢復到正常水平。3、Gpnmb

15、在原代培養(yǎng)的小鼠和大鼠BMM中表達：(1)免疫熒光染色結果示：小鼠BMM中Gpnm與F4/80共表達；大鼠BMM中,Gpnmb與CD68共表達。(2) 流式細胞儀結果示：原代培養(yǎng)小鼠BMM中有94.7 ± 6.1%細胞表達CD11b在CD Ilb+BMM©中Gpnm陽性率為75.1 士 4.8%。(3)MO型BMM (未分化型)和M2型 BMM的Gpnml總表達量沒有差別，但M1型BMMc的 GpnmbS達總量增多。相對于M2型BMIM , Ml型BMIM細胞培養(yǎng)液中GpnmbS達高,而細胞蛋白裂 解液中的表達較少。根據(jù) Gpnmb在 BMIM的表達特點,BMMcp可分為三

16、種類型： Gpnmb BMM；小單核 Gpnmb+BMJM；大多核 Gpnmb+BMM。4、Gpnml在 RAW264.7 巨噬細胞株表達：(1)qPCR和Western blot結果示,相對于對照組，Gpnmb mRNA 表達和蛋白表達在LPS組增高(p<0.05)。(2)免疫熒光染色結果示,有三種類型的RAW264.7細胞：Gpnmb- RAW264.7 細胞；小單核 Gpnmb+RAW264細胞；大多核 Gpnmb+RAW264細胞。在對照組 中,Gpnmb多表達在細胞核周圍：在 LPS組中,小單核Gpnmb+RAW264細胞的 Gpnm先進入細胞內小泡,經(jīng)細胞膜釋放到細胞

17、外；而在大多核 Gpnmb+RAW264.7 細胞中Gpnmt的表達仍在細胞核周圍。5、Gpnmb在原代培養(yǎng)的小鼠BMD(表達： 免疫熒光染色顯示,我們培養(yǎng)的細胞中大部分表達 CD11c, Gpnmb與CD11c有 共表達。(2) 流式細胞儀結果示 ,在我們培養(yǎng)的細胞中 ,有70.28±8.25%細胞為 CD11c 陽性；33.51 ± 2.32%CD11c細胞為Gpnmb陽性6、Gpnmbi原代培養(yǎng)的小鼠和大 鼠PTC各腎細胞株表達很低： 相對于RAW264.細胞,Gpnmb mRN在原代培 養(yǎng)PTC及各腎小管細胞株(如LLC-PK1 NRK 52e MDCK. MIMCD3)人腎胚胎細胞 株(293)