端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對(duì)人胃癌細(xì)胞株的影響

1、    端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對(duì)人胃癌細(xì)胞株的影響 作者：王玉花 許蘭濤    作者單位：730030 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院消化科【摘要】  目的 觀察端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對(duì)人胃癌細(xì)胞株的作用。方法 用端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸與人胃癌細(xì)胞株共同溫育一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的分布，測(cè)定端粒酶活性。結(jié)果 端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞膜起泡、染色質(zhì)固縮、核碎裂、凋亡小體形成；電泳呈凋亡特征性Ladder帶；流式細(xì)胞儀分析顯示，在G1

2、期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，端粒酶活性抑制。結(jié)論 端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能抑制端粒酶活性，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖?！娟P(guān)鍵詞】  端粒酶；胃癌細(xì)胞；反義寡聚脫氧核苷酸；凋亡The effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotide on the growth of human gastric cancer cell lines  WANG Yuhua,XU Lantao. Department of Gastroenterology,The Second Hospital of Lanzhou Univers

3、ity,Gansu,Lanzhou  730030,China    【Abstract】  Objective  To observe the effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotides on gastric cancer cell line.Methods  Gastric cancer cell line was cultured with 15 mol/L telomerase antisense oligodeoxynucleotide for cert

4、ain time,then the cell activity,morphologic changes and cellDNA distribution were observed.The apoptotic cells were measured by flow cytometry and telomerase activity were detected by TRAPELISA.Results  Telomerase antisense oligodeoxynucleotide could induce the apoptosis of human gastric cancer

5、 cell lines and inhibit the activity of telomerase,which presented apoptotic features:intace cell membrane,chromatin condensation,nucleic fragmentation and apoptotic body formation.Flow cytometry analysis showed that a subG1 cell peak and agarose electrophoresis showed a marked DNA ladder,which sugg

6、ested that telomerase activity was inhibited.Conclusion  Telomerase may play an important role in the growth of human gastric cancer cells.Telomerase antisense oligodeoxynucleotides may inhibit telomerase activity,which may be a new target of treatment to human gastric cancer.   

7、 【Key words】  Telomerase; Gastric cancer cell;Antiisense oligodeoxynucleotide;Apoptosis    染色體端粒(telomere)是位于細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，在人體細(xì)胞中，端粒由串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n及一些結(jié)合蛋白組成，在染色體的定位、復(fù)制、保護(hù)和控制細(xì)胞生長(zhǎng)壽命等方面起重要作用，并與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)1，2。端粒酶是一種核糖核蛋白，它通過(guò)不斷合成端粒重復(fù)序列添加至染色體末端，維持染色體穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡方式

8、。應(yīng)用藥物選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能改善腫瘤的預(yù)后3。本研究旨在探討端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸(ASODNt)抑制端粒酶活性4，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)5，為胃癌基因治療提供依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  胃癌細(xì)胞株SGC7901  引自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。    1.2  試劑  ASODNt及無(wú)關(guān)寡聚核苷酸(NODN)由上海生工生物工程公司合成，全硫代修飾。ASODNt序列為5CTCAG

9、TTAGGGTTAGACA3，NODN為5CATTTCTTGCTCTCCACG3， 經(jīng)微機(jī)檢索與人類基因無(wú)同源性。四氮甲唑藍(lán)(MTT)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自上海生工生物工程公司。端粒酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自華美生物工程公司。    1.3  對(duì)細(xì)胞抑制作用的觀察  取2×107/L胃癌細(xì)胞接種于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 l，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別加入ASODNt，調(diào)節(jié)濃度使ASODNt終濃度分別為1、2、3、4、5 mol/L，NODN的終濃度為3 mol/L，為NODN組，培養(yǎng)24、48、72、96 h，另外1組為生理鹽水組，

10、于結(jié)束前4 h加入5 g/L  MTT 20l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入SDS溶液100 l，終止反應(yīng)。37培養(yǎng)箱過(guò)夜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)570 nm的吸光度A值，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及ASODNt對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。    1.4  形態(tài)學(xué)觀察  在培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)改變，并將5 mol/L的ASODNt處理3 d的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)。電鏡觀察，將1×109/L胃癌細(xì)胞與5 mol/L  ASODNt共同孵育3 d，PBS清洗2次，2.5%戊二醛固定24

11、0; h，0.2 mol/L PBS緩沖液漂洗3次，每次15 min，1%鋨酸固定1 h，漂洗后經(jīng)梯度丙酮逐級(jí)脫水，Epon 812包埋，LKP2088型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾枸櫞酸鋁染色后，透射電鏡下觀察、攝片。    1.5  DNA抽提及電泳  將1×109/L胃癌細(xì)胞經(jīng)5 mol/L ASODNt處理3 d，然后把細(xì)胞離心，緩沖液清洗1次，酒精固定過(guò)夜，加裂解液及蛋白酶K，37搖床搖動(dòng)2 h，用等體積苯酚、氯仿、異戊醇各抽提1次，上清中加入1/10體積3 mol/L 醋酸鈉和2倍體積冷乙醇，于-20過(guò)夜，于-10 12 000

12、 r/min離心10 min收集沉淀，加入TE緩沖液，取抽提好的DNA 5 l，在20 g/L瓊脂糖凝膠，80 V電壓條件下，電泳3 h，紫外光透射儀下觀察電泳條帶并拍照。    1.6  流式細(xì)胞儀分析  將1×109/L胃癌細(xì)胞與5 mol/L ASODNt共同孵育3 d，緩沖液清洗2次，加無(wú)水乙醇固定24 h，隨后清洗細(xì)胞，與含有10 g/L RNA酶的TrisHcl緩沖液(pH=7.4)共同孵育10 min，碘化丙啶DNA染色，然后上機(jī)檢測(cè)。    1.7  端粒酶活性測(cè)定 

13、取1×109/L胃癌細(xì)胞，與5 mol/L的ASODNt共同孵育3 d，緩沖液洗1次，4 10 000 r/min離心1 min，沉淀加入150 l洗液洗滌，離心1 min，棄洗液，加50 l裂解液，懸浮、混勻，置冰浴30 min，4 14 000 r/min離心20 min，取上清2 l做TRAP反應(yīng)模板。取反應(yīng)管，各加入45 l反應(yīng)混合物，加入2 l已處理的標(biāo)本，混勻，加入30 l液體石蠟，置25水浴保溫30 min，在PCR儀上循環(huán)，94 120 s、94 30 s、48 30 s、72 90 s、72 300 s循環(huán)35次。循環(huán)結(jié)束后，在微孔板各孔中加入雜交反應(yīng)液，再加入擴(kuò)增

14、產(chǎn)物25 l混勻，設(shè)立陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照，置37恒溫反應(yīng)60 min。然后加入顯色劑，37避光顯色10 min，加入終止液，終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)450 nm讀取A值。    2  結(jié)  果    2.1  ASODNt對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響  不同濃度ASODNt與2×107/L胃癌細(xì)胞共同孵育后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，這一抑制作用隨濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。NODN、生理鹽水對(duì)胃癌細(xì)胞則無(wú)作用。見(jiàn)表1。    2.2  細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 

15、在倒置顯微鏡下可見(jiàn)NODN組及生理鹽水組細(xì)胞呈上皮型貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；而ASODNt組細(xì)胞有部分變圓浮起，細(xì)胞間接觸變松，增殖減慢，細(xì)胞中顆粒增多，隨藥物濃度增高，可見(jiàn)細(xì)胞周圍碎片增多，并將5 mol/L ASODNt處理3 d的細(xì)胞在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞核染色質(zhì)深染，聚積于核膜下濃集邊聚，膜突起呈小泡樣，小泡脫落形成含核小體片段的凋亡小體。而NODN組及生理鹽水組細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化。    2.3  DNA電泳結(jié)果  5 mol/L ASODNt作用3 d后，胃癌細(xì)胞DNA電泳呈明顯凋亡帶，生理鹽水

16、組則無(wú)凋亡帶，見(jiàn)圖1。    2.4  流式細(xì)胞儀分析結(jié)果  流式細(xì)胞儀檢測(cè)5 mol/L ASODNt作用3 d的胃癌細(xì)胞在G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。生理鹽水組未見(jiàn)凋亡峰，見(jiàn)圖2。 表1  不同濃度ASOONt組及NODN對(duì)SGC7901細(xì)胞作用后細(xì)胞平均吸光度值注：與同時(shí)間點(diǎn)NODN組、生理鹽水組比較，P0.05，P0.01    2.5  端粒酶活性  5 mol/L ASODNt作用3 d后，胃癌細(xì)胞端粒酶活性測(cè)定吸光度值A(chǔ)為0.060±0.007，活性明顯受到抑制

17、，NODN組(0.130±0.002)與生理鹽水組(0.140±0.005)活性很高。ASODNt組與NODN組、生理鹽水組比較，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。    2.6  電鏡觀察  ASODNt組可見(jiàn)染色質(zhì)固縮，聚集于核膜下成塊狀，細(xì)胞漿濃縮，部分細(xì)胞碎裂成片，形成質(zhì)膜包被的大小不等的凋亡小體，見(jiàn)圖3。    3  討  論    端粒酶RNA組分中含有與端粒DNA序列互補(bǔ)的模板序列，針對(duì)該模板序列設(shè)計(jì)的反義核苷酸，可阻斷其模板作

18、用從而抑制端粒酶合成端粒序列6。Feng等7于1995年首先研究發(fā)現(xiàn)人反義端粒酶DNA可抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Mata等8用含有端粒重復(fù)序列為5(TTAGGG)n3(n=2,3,4)的六聚亞磷酸硫代寡核苷酸(PSOND)進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn)，PSODN與Burkitts淋巴瘤細(xì)胞株(OMABL1)共孵育時(shí)，能抑制后者的端粒酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而對(duì)照組無(wú)此效應(yīng)。作者通過(guò)ASODNt與NODN分別作用于胃癌細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)ASODNt能明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，抗腫瘤活性呈劑量依賴性，抑制端粒酶活性，生理鹽水組則無(wú)此作用。端粒、端粒酶在惡性腫瘤中發(fā)生異常，端粒酶在腫瘤細(xì)胞永生化中

19、起重要作用，因此以端粒酶為靶基因的治療研究，為設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物提供新目標(biāo)，為腫瘤的基因治療開(kāi)辟了新途徑。    細(xì)胞凋亡有其獨(dú)特的形態(tài)和生化特征。形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞體積小，胞質(zhì)收縮或出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)凋亡小體。在分子水平上發(fā)生細(xì)胞核DNA的降解，這是由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶被激活的緣故。內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的最小DNA片段長(zhǎng)度為180200 bp，其余的DNA片段長(zhǎng)度為180200 bp的倍數(shù)(寡聚體)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后表現(xiàn)為特征性的DNA梯形帶。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞的DNA裂解，在流式細(xì)胞儀上呈現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。  &#

20、160; 胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中端粒酶被激活的機(jī)制目前尚不清楚，Mandal等9用含人BCL2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和人結(jié)腸DiFi細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性HeLa細(xì)胞和DiFi 細(xì)胞的端粒酶活性分別升高510倍和812倍。說(shuō)明BCL2蛋白的過(guò)度表達(dá)是端粒酶激活的重要途徑之一。凋亡與端粒酶激活二者的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)表明ASODNt能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒酶合成端粒，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，為抗端粒酶的腫瘤基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。絕大多數(shù)正常體細(xì)胞缺乏端粒酶活性，應(yīng)用此藥物，可避免治療的不良反應(yīng)，增強(qiáng)治療的特異性。今后

21、應(yīng)進(jìn)一步探索抗端粒酶藥物的作用機(jī)理，使高效抑制劑早日用于臨床10，11?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 吳翔，楊光彩.人端粒酶與腫瘤的關(guān)系及測(cè)定方法J.國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，2005，20(2)：5559.2 王燕，李文平.端粒、端粒酶與惡性腫瘤臨床研究進(jìn)展J.疑難病雜志，2005，4(14)：251.3 Muller M. Druginduced apoptosis in hepatoma cells is mediated by the CD95(APO1/Fas)receptor/ligand system and involves activation of wildtype p53J.J Clin

22、 Invest,2005,99(1):403413.4 候麗宏，孫秉中.端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對(duì)H60細(xì)胞生長(zhǎng)的作用J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(8)：653655.5 Pu Y,JeanMichel C,Jean B,et al.Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors:correlation with grade,histology and proliferative activityJ. Cancer Research,2006，59:3 1663 170.6 Norton JC,Piatyszek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomerase activity nucleic acidsJ. Nat Biotechnol,2004