Sr18菌代謝產(chǎn)物對松材線蟲蛋白質(zhì)和酶活力的影響

1、    sr18菌代謝產(chǎn)物對松材線蟲蛋白質(zhì)和酶活力的影響    侯金麗+馮欣摘要：基于sr18菌（syncephalastrum racemosum）代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)具有顯著的殺線蟲活性，測定了其在8 h內(nèi)對松樹線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量、sod、cat、tche和atp酶活性的影響。結(jié)果表明，4 h時處理組總蛋白質(zhì)的含量陡增至0.544 2 mg/ml，顯著高于對照組0.429 1 mg/ml，sr18菌代謝產(chǎn)物干擾了線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝；在8 h內(nèi)，處理組的sod、cat、tche和atp酶這4種酶活性均低于對照組，sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)這4種酶都

2、有不同程度的影響。這一結(jié)果為利用sr18菌代謝產(chǎn)物研究和開發(fā)微生物源殺線劑奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：sr18菌（syncephalastrum racemosum）代謝產(chǎn)物；線蟲；蛋白質(zhì)含量；酶活：s433.89 ：a ：0439-8114（2014）19-4604-03doi：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.19.025effects of sr18 fungi metabolites on the protein content and the enzymeactivities in the nematodehou jin-li1，feng xin2（1.hen

3、an industry and trade vocational college， department of food engineering ， zhengzhou 451191， china；2.tianjin key laboratory of animals and plants resistance， tianjin normal university， college of life science， tianjin 300387， china）abstract： based on sr18 fungi metabolites with significant nematicid

4、al activity in 8 h， the effects of this extract were evaluated on the content of total protein， the enzyme activities of sod， cat， tche and atp in 8 h. the results showed that in 4h， the content of total protein in the treatment group increased sharply to 0.544 2 mg/ml， significantly higher than tha

5、t of the control group（0.429 1 mg/ml）， indicating that sr18 fungi metabolites were interfered with the nematode protein metabolism. in 8 h， the enzyme activities of sod， cat， tche and atp of the treatment group were lower than that of the control group， indicating that sr18 fungi metabolites had dif

6、ferent effects on these four kinds of enzyme in the nematode. it will provide a theoretical basis for developing nematicides with microbial resources.key words： sr18（syncephalastrum racemosum） fungi metabolites； nematode； protein content； enzyme activities.植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原體，其寄生范圍廣，不僅對林木的危害十分嚴(yán)重，

7、對全世界農(nóng)作物的生產(chǎn)也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計，全世界植物寄生線蟲不僅造成年經(jīng)濟損失超過1 000億美元，還給人類和動物帶來嚴(yán)重的疾病1-4。目前應(yīng)用最廣泛的化學(xué)藥劑產(chǎn)生了環(huán)境污染和增強了線蟲抗藥性等諸多問題，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用受到一定的限制。隨著人類環(huán)保意識的提高，生物防治成為線蟲防治的主導(dǎo)5。絲狀真菌sr18（syncephalastrum racemosum）是本課題組從土壤中篩選出的一株生防菌，其代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)具有極強的殺線蟲活性6。為進一步明確sr18對線蟲的毒殺機理，本研究在此基礎(chǔ)上，選定松材線蟲（以下簡稱“線蟲”）為試驗對象，研究了sr18菌代謝產(chǎn)物在8 h內(nèi)對線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含

8、量、保護酶（sod、cat）活性、神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵酶（tche）活性和能量產(chǎn)生關(guān)鍵酶（atp酶）活性的影響，為利用該菌研究和開發(fā)微生物源殺線劑奠定理論基礎(chǔ)，同時為生物防控線蟲提供了新的途徑和技術(shù)支撐。1 材料與方法1.1 試驗材料sr18菌種由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。27 ，在ps液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4 d后，過濾去掉菌體，收集培養(yǎng)液。線蟲由中國林科院森環(huán)森保所提供。線蟲用以察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌 （batrytis cinerea， bc菌） 避光（26±1） 飼養(yǎng)57 d。1.2 試驗方法1.2.1 線蟲處理方法 采用浸漬處理法。在（26±1）的環(huán)境下，67 ml

9、 sr18菌代謝產(chǎn)物中加入約100 000條線蟲，然后分別處理0、2、4、6、8 h。在相應(yīng)ps液體培養(yǎng)基中加入等量的線蟲作為對照。 1.2.2 生理生化指標(biāo)的測定 分別于試驗設(shè)定的時間內(nèi)將浸漬處理后的線蟲離心收集，置于預(yù)冷的滅菌勻漿器中，加入4 ml預(yù)冷勻漿緩沖液，反復(fù)凍融3次7，然后冰上勻漿15 min，漿液進行超聲破碎（破碎條件為超聲破碎10 s，間隔30 s，共30次，功率400 w8）。破碎產(chǎn)物以3 000 r/min，4 離心20 min，收取離心后的上清液即為總蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮蘭g250染色法；過氧化氫酶（catalase，cat）活性測定參照文獻(xiàn)9；乙酰膽

10、堿酯酶（acetylcholinesterase，ache）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，sod）、超微量atp酶活性測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。2 結(jié)果與分析2.1 sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響sr18菌代謝產(chǎn)物在不同時間對線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響見圖1。由圖1可知，在處理2 h左右，sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量和對照相比沒有明顯差異，當(dāng)處理時間延長到34 h，可以檢測到sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量急劇升高至0.544 2 mg/ml，而且明顯高于正常培養(yǎng)情況下的線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量0.429 1 m

11、g/ml。在46 h，sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)量急劇下降，與對照組線蟲的總蛋白質(zhì)含量相比沒有明顯差異。隨著處理時間的延長，sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量和對照組逐漸趨于一致。各項數(shù)據(jù)表明，在短時間內(nèi)，線蟲對于sr18菌代謝產(chǎn)物具有一個明顯的應(yīng)激反應(yīng)，這主要表現(xiàn)為短時間內(nèi)蛋白質(zhì)大量的合成和降解。2.2 sr18菌代謝產(chǎn)物對sod活性的影響sr18菌代謝產(chǎn)物在不同時間對線蟲體內(nèi)sod活性的影響見圖2。由圖2可知，在04 h內(nèi)，sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)sod活性沒有明顯的變化，但對照組的sod活性有一個明顯升高和下降的改變。在48 h內(nèi)sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線

12、蟲體內(nèi)sod活性和相應(yīng)對照組sod活性的變化趨勢基本保持一致。從總體sod活性高低來看，sr18菌代謝產(chǎn)物處理的線蟲體內(nèi)sod活性在處理時間內(nèi)明顯低于對照組。這表明，sr18菌代謝產(chǎn)物具有抑制線蟲體內(nèi)sod活性的功能。2.3 sr18菌代謝產(chǎn)物對cat活性的影響sr18代謝產(chǎn)物在不同時間對線蟲體內(nèi)cat活性的影響見圖3。由圖3可知，處理組和對照組線蟲體內(nèi)cat活性，隨處理時間的不同在8 h內(nèi)的變化規(guī)律基本相似。即在02 h內(nèi)呈上升趨勢，在28 h呈下降趨勢。在24 h內(nèi)處理組與對照組相比cat活性急速下降，說明sr18菌代謝產(chǎn)物抑制了cat的活性，但4 h后，cat活性的下降趨于平緩，說明隨處

13、理時間的增加cat活性受抑制程度基本相同即達(dá)到了最大效果。當(dāng)線蟲體內(nèi)的cat活性被抑制時，會使線蟲體內(nèi)廣泛存在的活性氧暴增，導(dǎo)致自由基增多，造成對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，特別是生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化作用導(dǎo)致機體內(nèi)過氧化脂質(zhì)生成，致使細(xì)胞膜的流動性降低，核酸和染色體被破壞10，11。2.4 sr18菌代謝產(chǎn)物對tche活性的影響sr18菌在不同時間對線蟲體內(nèi)tche活性的影響見圖4。由圖4可知，處理組和對照組的線蟲體內(nèi)tche活性的變化趨勢基本相同，維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。但處理的線蟲體內(nèi)tche活性始終低于對照的線蟲，這說明sr18菌代謝產(chǎn)物對tche有顯著的抑制作用，且隨著時間的變化，tche活

14、性受抑制程度基本相同。2.5 sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)atp酶活性的影響sr18代謝產(chǎn)物在不同時間對線蟲體內(nèi)atp活性的影響見圖5。由圖5可知，處理組和對照組的線蟲，在06 h這段時間內(nèi)，體內(nèi)atp酶活性維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。處理組線蟲體內(nèi)atp酶活性低于對照組，說明sr18代謝產(chǎn)物抑制了atp酶的活性。但處理的線蟲在8 h時，體內(nèi)atp酶的活性顯著降低，表明長時間處理能更大限度地抑制atp酶地活性。3 小結(jié)與討論3.1 sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有較大影響sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有重要的影響，在4 h時，處理組總蛋白質(zhì)含量與對照組相比有顯著差異，4 h時處理組比

15、對照組的線蟲明顯活躍，這可能與4 h時總蛋白質(zhì)的含量陡增有關(guān)。而在其他時間則基本保持一致，在24 h這段時間內(nèi)處理組線蟲在逆境情況下可能發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，合成某些新的蛋白質(zhì)來抵抗不利的外界環(huán)境，但隨著處理時間的增加含量逐漸降低，這可能是處理組線蟲體內(nèi)的某些蛋白質(zhì)在代謝產(chǎn)物處理過程中分解受阻，在體內(nèi)大量積累，但隨著處理時間的加長蛋白質(zhì)分解又恢復(fù)正常所造成的。有關(guān)更深層次的原因有待進一步研究。3.2 sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)sod、cat活性的影響sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶（sod）活性的影響結(jié)果看，處理組和對照組線蟲體內(nèi)sod活性在8小時內(nèi)的變化規(guī)律基本相似，即先呈下降趨勢

16、后呈上升趨勢。在整個變化過程中處理組sod活性明顯低于對照組，表明菌代謝產(chǎn)物抑制線蟲體內(nèi)sod的活性。但由于處理后的線蟲體內(nèi)的sod活性受抑制，不能及時有效的清除氧自由基，從而造成超氧陰離子的大量堆積，對線蟲機體造成毒性，干擾細(xì)胞正常的生理代謝，從而破壞線蟲了抗氧化保護酶系12。試驗結(jié)果表明，sr18菌代謝產(chǎn)物能顯著抑制線蟲的sod和cat活性，對線蟲機體造成毒性，使線蟲體內(nèi)廣泛存在的活性氧暴增，導(dǎo)致自由基增多，使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞和損傷10，11，最終導(dǎo)致線蟲死亡。3.3 sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche、atp酶活性的影響 在sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性試驗中

17、，中毒線蟲起初表現(xiàn)為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動緩慢、扭動身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動身軀，直至死亡，蟲體僵直。由此可以推測，sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜上的乙酰膽堿受體長時間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)13。從試驗結(jié)果看，在8 h時atp酶活性具有突然顯著降低（atp酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解atp成adp和pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲機體過度興奮，能量供給不上，造成線蟲痙攣、麻痹，影響了線蟲體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時導(dǎo)致線蟲死亡。由此

18、，可推測sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點從sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲活性測定得到證實，因為作用于神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點是快速擊倒和殺死作用，而sr18菌代謝物活性物質(zhì)對松材線蟲處理24 h死亡率達(dá)100%6。綜上所述，sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說明sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲的致死作用有可能是綜合性的，是通過不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問題有待進一步研究。參考文獻(xiàn)：1 劉 芳，劉曉艷，楊自文，等.對植物寄生線蟲具有活性的蘇云金芽胞桿菌研究進展j.中國生物防治學(xué)報，2012，

19、28（3）：430-434.2 cezairliyan b， vinayavekhin n， grenfell l d， et al. identification of pseudomonas aeruginosa phenazines that kill caenorhabditis elegansj.plos pathog，2013，9（1）： e1003101.3 sun j h， wang h k， lu f p， et al. the efficacy of nematicidal strain syncephalastrum racemosumj. annals of micro

20、biology，2008，58（3）：369-373.4 wiratno d， taniwiryono h， van d b， et al. nematicidal activity of plant extracts against the root-knot nematode， meloidogyne incognitaj. the open natural products journal，2009（2）：77-85.5 李繼平，漆永紅，陳書龍，等.利用殺線植物資源防治植物寄生線蟲的研究進展j. 草業(yè)學(xué)報，2013，22（3）：297-305.6 李 平，田 陽，高丙利，等.sr18生防

21、制劑的殺線蟲譜研究j.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（18）：238-245.7 王文林，夏代光，雷 霖，等.豐宮并殖吸蟲后尾蚴、成蟲及小睪并殖吸蟲成蟲的蛋白電泳分析j.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，6（2）：19-21.8 孫勁旅，張宏譽，應(yīng)萬濤，等.利用雙向電泳比較3種提取戶塵螨蛋白的方法j.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2004，24（3）：321-326.9 b.施特爾馬赫.酶的測定方法m.錢嘉淵，譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，1992.10 送榮粱.自由基對生物大分子損傷及防護的研究進展c.方允中.自由基生命科學(xué)進展：第2集a.北京：原子能出版社，1994.11 張 波，劉承蕓，孟紫強.二氧化硫吸人對小鼠

22、各臟器過氧化氫酶活性的影響j.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2003，20（1）：10-13.12 安玉興.植物殺線蟲活性成分及作用機理的研究d.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.13 翁群芳，鐘國華，胡美英，等.駱駝蓬提取物對松材線蟲的生物活性及生理效應(yīng)j.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（10）：2014-2022. 在sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性試驗中，中毒線蟲起初表現(xiàn)為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動緩慢、扭動身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動身軀，直至死亡，蟲體僵直。由此可以推測，sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜

23、上的乙酰膽堿受體長時間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)13。從試驗結(jié)果看，在8 h時atp酶活性具有突然顯著降低（atp酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解atp成adp和pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲機體過度興奮，能量供給不上，造成線蟲痙攣、麻痹，影響了線蟲體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時導(dǎo)致線蟲死亡。由此，可推測sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點從sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲活性測定得到證實，因為作用于神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點是快速擊倒和殺死作用，而sr18菌代謝物活性物質(zhì)對松材線蟲處理24 h死亡率達(dá)100%6。綜

24、上所述，sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說明sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲的致死作用有可能是綜合性的，是通過不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問題有待進一步研究。參考文獻(xiàn)：1 劉 芳，劉曉艷，楊自文，等.對植物寄生線蟲具有活性的蘇云金芽胞桿菌研究進展j.中國生物防治學(xué)報，2012，28（3）：430-434.2 cezairliyan b， vinayavekhin n， grenfell l d， et al. identification of pseudomonas aeruginosa phenazines that

25、kill caenorhabditis elegansj.plos pathog，2013，9（1）： e1003101.3 sun j h， wang h k， lu f p， et al. the efficacy of nematicidal strain syncephalastrum racemosumj. annals of microbiology，2008，58（3）：369-373.4 wiratno d， taniwiryono h， van d b， et al. nematicidal activity of plant extracts against the roo

26、t-knot nematode， meloidogyne incognitaj. the open natural products journal，2009（2）：77-85.5 李繼平，漆永紅，陳書龍，等.利用殺線植物資源防治植物寄生線蟲的研究進展j. 草業(yè)學(xué)報，2013，22（3）：297-305.6 李 平，田 陽，高丙利，等.sr18生防制劑的殺線蟲譜研究j.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（18）：238-245.7 王文林，夏代光，雷 霖，等.豐宮并殖吸蟲后尾蚴、成蟲及小睪并殖吸蟲成蟲的蛋白電泳分析j.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，6（2）：19-21.8 孫勁旅，張宏譽，應(yīng)萬濤，等.利

27、用雙向電泳比較3種提取戶塵螨蛋白的方法j.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2004，24（3）：321-326.9 b.施特爾馬赫.酶的測定方法m.錢嘉淵，譯.北京：中國輕工業(yè)出版社，1992.10 送榮粱.自由基對生物大分子損傷及防護的研究進展c.方允中.自由基生命科學(xué)進展：第2集a.北京：原子能出版社，1994.11 張 波，劉承蕓，孟紫強.二氧化硫吸人對小鼠各臟器過氧化氫酶活性的影響j.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2003，20（1）：10-13.12 安玉興.植物殺線蟲活性成分及作用機理的研究d.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.13 翁群芳，鐘國華，胡美英，等.駱駝蓬提取物對松材線蟲的生物活性及生理效應(yīng)j.中國農(nóng)業(yè)

28、科學(xué)，2005，38（10）：2014-2022. 在sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性試驗中，中毒線蟲起初表現(xiàn)為蟲體扭曲、顫抖、痙攣，接著線蟲游動緩慢、扭動身軀，最后反應(yīng)遲鈍、偶爾扭動身軀，直至死亡，蟲體僵直。由此可以推測，sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲體內(nèi)tche活性的顯著抑制，導(dǎo)致乙酰膽堿積累，造成突觸間隙的乙酰膽堿持續(xù)處于高濃度，使突觸后膜上的乙酰膽堿受體長時間處于活化狀態(tài)，從而阻斷了神經(jīng)傳遞，引起中毒反應(yīng)13。從試驗結(jié)果看，在8 h時atp酶活性具有突然顯著降低（atp酶是能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，可分解atp成adp和pi，放出大量的能量），有可能是由乙酰膽堿的積累造成線蟲機體過度興奮，能

29、量供給不上，造成線蟲痙攣、麻痹，影響了線蟲體內(nèi)的正常代謝，從而影響其生命力，嚴(yán)重時導(dǎo)致線蟲死亡。由此，可推測sr18菌代謝物活性物質(zhì)具有神經(jīng)遞質(zhì)抑制作用，這一點從sr18菌代謝物活性物質(zhì)的室內(nèi)殺線蟲活性測定得到證實，因為作用于神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，其毒殺作用的特點是快速擊倒和殺死作用，而sr18菌代謝物活性物質(zhì)對松材線蟲處理24 h死亡率達(dá)100%6。綜上所述，sr18菌代謝產(chǎn)物的活性物質(zhì)對這4種酶都有不同程度的抑制作用，這說明sr18菌代謝產(chǎn)物對線蟲的致死作用有可能是綜合性的，是通過不同方面和不同系統(tǒng)作用的結(jié)果，它們之間是相互關(guān)聯(lián)和相互影響，而有關(guān)更深層次的問題有待進一步研究。參考文獻(xiàn)：1 劉 芳，劉曉艷，楊自文，等.對植物寄生線蟲具有活性的蘇云金芽胞桿菌研究進展j.中國生物防治學(xué)報，2012，28（3）：430-434.2 cezairliyan b， vinayavekhin n， grenfell l d， et al. identification