MALDITOFMS在細菌檢測中的應用學習教案

1、會計學1MALDITOFMS在細菌在細菌(xjn)檢測中的應用檢測中的應用第一頁，共54頁。2第1頁/共53頁第二頁，共54頁。3第2頁/共53頁第三頁，共54頁。n雖然某些生化試驗只需要數(shù)分鐘即可完成，但對于絕大多數(shù)經(jīng)過轉種、培養(yǎng)的微生物標本，通常要得到一個完整的鑒定報告大約要24-48h，某些苛氧菌或生長慢的細菌則耗時更多。n操作繁瑣、主觀性強。4第3頁/共53頁第四頁，共54頁。具有高度穩(wěn)定性、易于提取和分析而成為理想的細菌鑒定的研究對象。n通過分析比較細菌rRNA序列的相關性確定細菌種系的發(fā)生關系。5第4頁/共53頁第五頁，共54頁。n技術復雜、耗費高、假陽性率高、不能自動化、高通量。

2、n不適合臨床常規(guī)檢測！6第5頁/共53頁第六頁，共54頁。迫切需要找到一種新的病原微生物快速診斷(zhndun)的方法，以滿足臨床需要7第6頁/共53頁第七頁，共54頁。8第7頁/共53頁第八頁，共54頁。9第8頁/共53頁第九頁，共54頁。恰好是另一種核素質量的整數(shù)倍。n分析這些離子可獲得化合物的分子量、化學結構、裂解規(guī)律等信息。10第9頁/共53頁第十頁，共54頁。n速度慢的離子在磁場中偏轉較大，速度快的偏轉小n在磁場中還能發(fā)生質量的分離，使不同質荷比的離子聚焦在不同的點上，將它們分別聚焦而得到(d do)質譜圖，從而確定其質量。11第10頁/共53頁第十一頁，共54頁。n有單聚焦質譜計、

3、雙聚焦質譜計和四極矩質譜計等。n后兩種用得較多，而且多與氣相色譜儀和電子計算機聯(lián)用。12第11頁/共53頁第十二頁，共54頁。能維持10-7 10-8毫米汞柱的真空度。13第12頁/共53頁第十三頁，共54頁?？谝?。n液相色譜/質譜接口有傳動帶接口、直接液體接口和熱噴霧接口。14第13頁/共53頁第十四頁，共54頁。（desorption ionization）和快原子轟擊電離等。n其中場解吸和快原子轟擊特別適合測定揮發(fā)性小和對熱不穩(wěn)定的化合物。15第14頁/共53頁第十五頁，共54頁。16第15頁/共53頁第十六頁，共54頁。n對于(duy)微量不純的化合物，可以利用氣相色譜或液相色譜（對

4、極性大的化合物）將化合物分離成單一組分，導入質譜計，錄下質譜圖。17第16頁/共53頁第十七頁，共54頁。大簡化了操作手續(xù)。n質譜法特別是它與色譜儀及計算(j sun)機聯(lián)用的方法，已廣泛應用在有機化學、生化、藥物代謝、臨床、毒物學、農(nóng)藥測定、環(huán)境保護、石油化學、地球化學、食品化學、植物化學、宇宙化學和國防化學等領域。18純化純化(chn hu)離子離子(lz)分離分離分析分析第17頁/共53頁第十八頁，共54頁。用LC-MS分析，此時主要得到分子量信息，如果是串聯(lián)質譜，還可以得一些結構信息。n如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要獲得分子量信息。對于蛋白質樣品，還

5、可以測定氨基酸序列。19第18頁/共53頁第十九頁，共54頁。20第19頁/共53頁第二十頁，共54頁。21質譜的基本概念質譜儀第20頁/共53頁第二十一頁，共54頁。22第21頁/共53頁第二十二頁，共54頁。庫或與已知微生物的質譜峰比較，來實現(xiàn)對微生物的快速鑒定具有快速、高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點，能夠(nnggu)對核酸、蛋白質和多肽等生物大分子進行微量分析.23第22頁/共53頁第二十三頁，共54頁。再用一定波長的脈沖式激光進行照射，基質吸收激光能量后，均勻地傳遞給待分析物，使待分析物瞬間氣化(q hu)并離子化。使用基質的主要目的是保護待分析物不會因為過強的激光能量導致化合物被破壞。2

6、4第23頁/共53頁第二十四頁，共54頁。的離子飛行時間短而首先到達檢測器。25第24頁/共53頁第二十五頁，共54頁。c)。即通過測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來檢測(jin c)離子的分子量通過專用軟件分析比較，確定出特異性的指紋圖譜26第25頁/共53頁第二十六頁，共54頁。27MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 原理圖原理圖基質輔助激光(jgung)解吸電離飛行時間質譜第26頁/共53頁第二十七頁，共54頁。28第27頁/共53頁第二十八頁，共54頁。白質組指紋圖，通過特征性的模式(msh)峰進行菌株的鑒定。29MALDI-TOF-MS在臨床(ln c

7、hun)微生物中的應用第28頁/共53頁第二十九頁，共54頁。30MALDI-TOF-MS在臨床(ln chun)微生物中的應用第29頁/共53頁第三十頁，共54頁。n類可能類可能影響質影響質譜峰的譜峰的形成。形成。n有研究有研究表明，表明，DHB 50 mg/mL，31 50%乙腈，0.1%三氟乙酸為基質，檢測液體培養(yǎng)(piyng)細菌，可獲得最佳質譜圖。 現(xiàn)已有商品化的配套基質溶液可以購買。MALDI-TOF-MS在臨床(ln chun)微生物中的應用第30頁/共53頁第三十一頁，共54頁。臨床標本接種于培養(yǎng)基（液體臨床標本接種于培養(yǎng)基（液體或固體）或固體）挑取菌落或取液體培養(yǎng)液，經(jīng)挑取菌

8、落或取液體培養(yǎng)液，經(jīng)水和乙醇處理水和乙醇處理再經(jīng)再經(jīng)70%70%甲酸甲酸/ /乙腈（乙腈（1 1：1 1）處）處理理32MALDI-TOF-MS在臨床(ln chun)微生物中的應用第31頁/共53頁第三十二頁，共54頁。式式(msh)(msh)、加速電壓、激加速電壓、激光強度等參數(shù)光強度等參數(shù)還未獲得一個還未獲得一個統(tǒng)一的模式統(tǒng)一的模式(msh)(msh)，需，需要優(yōu)化。要優(yōu)化。33MALDI-TOF-MS在臨床(ln chun)微生物中的應用Ekin=1/2mV2第32頁/共53頁第三十三頁，共54頁。*橫坐標為質荷比（m/z），縱坐標為吸收(xshu)峰強度34MALDI-TOF-MS在

9、臨床(ln chun)微生物中的應用第33頁/共53頁第三十四頁，共54頁。35MALDI-TOF-MS在臨床(ln chun)微生物中的應用簡要操作簡要操作(cozu)流程流程第34頁/共53頁第三十五頁，共54頁。36（二）（二）MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS在細菌檢驗在細菌檢驗(jinyn)(jinyn)中的應用范圍中的應用范圍細菌菌種鑒定(jindng)多血清型細菌鑒定(jindng)耐藥性不同的菌株鑒定(jindng)真菌的鑒定(jindng)血液、尿液及其他無菌液體標本的鑒定(jindng)糞便標本的鑒定(jindng)第35頁/共53頁第三十六頁，共54頁。Bi

10、zzini等分析等分析1371株臨床分離株臨床分離(fnl)株發(fā)現(xiàn)株發(fā)現(xiàn)93.2%能鑒定到能鑒定到種水平，種水平，5.3%到屬水平。在到屬水平。在鑒定到種的水，鑒定到種的水，MS和傳統(tǒng)生和傳統(tǒng)生化方法平一致率為化方法平一致率為95.1%。37第36頁/共53頁第三十七頁，共54頁。結論：結論：MALDI-TOF-MS能準確、可重能準確、可重復地鑒定細菌且在復地鑒定細菌且在10min內(nèi)，內(nèi)，不需要其他的耗材。不需要其他的耗材。結果錯誤或不能鑒定是由于結果錯誤或不能鑒定是由于MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫不完數(shù)據(jù)庫不完善，大部分的差異是因為系善，大部分的差異是因為系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫相關的分類學差異。統(tǒng)數(shù)據(jù)

11、庫相關的分類學差異。38第37頁/共53頁第三十八頁，共54頁。應用應用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技術對這些技術對這些多血清型細菌進行鑒定和分多血清型細菌進行鑒定和分類得到了初步應用，在沙門類得到了初步應用，在沙門氏菌分型中表現(xiàn)出較好的分氏菌分型中表現(xiàn)出較好的分型能力。型能力。39第38頁/共53頁第三十九頁，共54頁。（MRSAMRSA）可以用可以用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS檢測針對檢測針對抗菌劑分子的細菌各種獲得抗菌劑分子的細菌各種獲得性酶，如性酶，如-內(nèi)酰胺酶、甲基內(nèi)酰胺酶、甲基化酶、質子泵等?；?、質子泵等。40第39頁/共53頁第四十頁，共

12、54頁。標本，標本，MSMS直接鑒定直接鑒定79%79%的單的單一細菌感染。一細菌感染。MSMS對尿液標本中的細菌快速、對尿液標本中的細菌快速、準確，尤其是大腸埃希菌，準確，尤其是大腸埃希菌，正確鑒定率為正確鑒定率為97.6%97.6%。也有研究應用也有研究應用MSMS直接檢測和鑒直接檢測和鑒定其他正常無菌液體中的細定其他正常無菌液體中的細菌，正確鑒定率為菌，正確鑒定率為96% 96% 。41第40頁/共53頁第四十一頁，共54頁。根菌等做出準確根菌等做出準確(zhnqu)(zhnqu)判定。判定。42第41頁/共53頁第四十二頁，共54頁。43第42頁/共53頁第四十三頁，共54頁。取取1m

13、L1mL培養(yǎng)液培養(yǎng)液 6000 6000g g離心離心3min3min收集菌體收集菌體, ,用用75%75%乙醇溶液滅活乙醇溶液滅活, ,離心去上清。離心去上清。用超純水將菌體洗滌用超純水將菌體洗滌2 2次次, ,最后用最后用1mL1mL超純水重懸菌體。超純水重懸菌體。取取1L1L細菌細菌(xjn)(xjn)重懸液與重懸液與1L1L基質溶液充分混合后點樣基質溶液充分混合后點樣, ,室溫干燥。室溫干燥。44MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 應用應用(yngyng)(yngyng)舉例舉例第43頁/共53頁第四十四頁，共54頁。物對系統(tǒng)進行物對系統(tǒng)進行(jnxng)(jnxng)

14、校正校正, ,使誤差使誤差0.1%.0.1%.4.4.數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析通過通過FlexAnalysis3.0FlexAnalysis3.0軟件處理軟件處理質譜圖質譜圖, ,包括質譜圖的平滑、包括質譜圖的平滑、衰減及標峰處理衰減及標峰處理( (信噪比大于信噪比大于5)5)。通過通過ClinProToolTM 2.1ClinProToolTM 2.1軟件進軟件進行行(jnxng)(jnxng)主成分分析。主成分分析。45MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 應用應用(yngyng)(yngyng)舉例舉例第44頁/共53頁第四十五頁，共54頁。46a：大腸桿菌(d chn n jn)

15、；b：志賀氏菌；c：副傷寒沙門氏菌MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS 應用應用(yngyng)(yngyng)舉例舉例第45頁/共53頁第四十六頁，共54頁。47AB大腸(dchng)埃希菌志賀氏菌副傷寒沙門氏菌(sh mn sh jn)混合菌群第46頁/共53頁第四十七頁，共54頁。48第47頁/共53頁第四十八頁，共54頁。受樣本中雜質的影響較小受樣本中雜質的影響較小無需預先無需預先(yxin)(yxin)培養(yǎng)或分離，培養(yǎng)或分離，可直接進行檢測可直接進行檢測49MALDI-TOF-MS方法學評價(pngji)第48頁/共53頁第四十九頁，共54頁。方法的準確性依賴于數(shù)據(jù)庫中

16、菌方法的準確性依賴于數(shù)據(jù)庫中菌種的信息量，目前國內(nèi)菌種數(shù)種的信息量，目前國內(nèi)菌種數(shù)據(jù)庫中的質譜分析據(jù)庫中的質譜分析(fnx)(fnx)圖圖譜量較少，限制了檢測的準確譜量較少，限制了檢測的準確性性50MALDI-TOF-MS方法學評價(pngji)第49頁/共53頁第五十頁，共54頁。技術應用的準確性。技術應用的準確性。該技術對不同菌株的檢測靈敏該技術對不同菌株的檢測靈敏度和準確性、多血清型細菌度和準確性、多血清型細菌的分型鑒別準確性以及樣品的分型鑒別準確性以及樣品處理、質譜圖采集和分析等，處理、質譜圖采集和分析等，還有許多問題需要研究和改還有許多問題需要研究和改進。在試驗方法的標準化方進。在試驗方法的標準化方面也需要深入探討。面也需要深入探討。51MALDI-TOF-MS方法學評價(pngji)第50頁/共53頁第五十一頁，共54頁。52第51頁/共53頁第五十二頁，共54頁。第52頁/共5