DNA的粗提取與鑒定PCR蛋白質(zhì)的提取與分離學習教案

1、會計學1DNA的粗提取與鑒定的粗提取與鑒定PCR蛋白質(zhì)的提取與蛋白質(zhì)的提取與分離分離二、方法與過程二、方法與過程 1.1.制雞血細胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）制雞血細胞液（活雞鮮血經(jīng)分離或沉淀獲得）0.1g/mL檸檬酸鈉檸檬酸鈉100mL活雞鮮血活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒燒杯中，玻棒攪拌攪拌，離心、分離或靜置沉淀。離心、分離或靜置沉淀。2.提取提取DNA。取血細胞取血細胞5-10mL20mL蒸餾水蒸餾水，用玻棒沿一個方向，用玻棒沿一個方向快快速攪拌速攪拌。紗布紗布過濾過濾：濾液中含：濾液中含DNA和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。和其他核物質(zhì)，如蛋白質(zhì)。原理：血細胞的細胞膜、核膜吸水脹

2、破，玻璃棒原理：血細胞的細胞膜、核膜吸水脹破，玻璃棒快速快速攪拌攪拌，機械加速血細胞破裂。，機械加速血細胞破裂。.提取提取血血細胞核物質(zhì)：細胞核物質(zhì)：.溶解核內(nèi)的溶解核內(nèi)的DNA： 濾液濾液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一個方向，玻棒沿一個方向輕緩攪拌輕緩攪拌。第1頁/共51頁.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.濾取含濾取含DNA的粘稠物：的粘稠物：. DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解： 在上述溶液中緩緩加入在上述溶液中緩緩加入蒸餾水蒸餾水，并沿一個方向，并沿一個方向輕輕攪輕輕攪拌拌，出現(xiàn)絲狀物；當絲狀物不在增加時，停止加水（此，出現(xiàn)絲狀物；當絲狀物不在增加時，停止

3、加水（此時時NaCl溶液的濃度相當于溶液的濃度相當于0.14mol/L）。）。 用多層紗布用多層紗布過濾過濾，含，含DNA的粘稠物留在紗布上。的粘稠物留在紗布上。 20mL2mol/L的的NaCl溶液溶液步驟含步驟含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL燒杯中燒杯中輕緩攪拌輕緩攪拌3min，使盡可能多的，使盡可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液溶液。.過濾含有過濾含有DNA的的NaCl溶液：溶液： 用放有兩層紗布的漏斗用放有兩層紗布的漏斗過濾過濾步驟所得的溶液，濾液步驟所得的溶液，濾液中含有中含有DNA。第2頁/共51頁.提取含有雜質(zhì)較少的提取含有雜質(zhì)較少的DNA： 步驟所得的濾液體積分數(shù)為步驟所

4、得的濾液體積分數(shù)為95%的冷卻酒精的冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個方向，用玻棒沿一個方向輕緩攪拌輕緩攪拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出現(xiàn)）出現(xiàn)乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。分。3.DNA的鑒定：的鑒定： 加入二苯胺試劑加入二苯胺試劑4mL，用玻棒，用玻棒攪拌攪拌使使DNA溶解，沸水溶解，沸水浴浴5min，觀察溶液是否出現(xiàn)淺藍色。，觀察溶液是否出現(xiàn)淺藍色。1.共有共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌三次過濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入加入“兩次蒸餾水，兩次蒸餾水，三次三次NaCl溶液，一次酒精，一次酒精”三、實驗

5、小結三、實驗小結第3頁/共51頁四、實驗原理拓展介紹。四、實驗原理拓展介紹。1.DNA的釋放。的釋放。 DNA主要在雞血細胞的細胞核內(nèi)，正常情況下不會主要在雞血細胞的細胞核內(nèi)，正常情況下不會釋放出來，蒸餾水對于雞血細胞是一種低滲液，水分可釋放出來，蒸餾水對于雞血細胞是一種低滲液，水分可以大量進入血細胞，使之脹破，同時加上玻璃棒快速攪以大量進入血細胞，使之脹破，同時加上玻璃棒快速攪拌的機械作用，加速血細胞的細胞膜和核膜的破裂。但拌的機械作用，加速血細胞的細胞膜和核膜的破裂。但釋放出來的大量釋放出來的大量DNA與與RNA、蛋白質(zhì)結合在一起，即釋、蛋白質(zhì)結合在一起，即釋放的不是純凈的放的不是純凈的D

6、NA，常稱為，常稱為DNA核蛋白核蛋白。2.DNA與蛋白質(zhì)分離。與蛋白質(zhì)分離。 在高濃度（在高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，）的氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，析出析出DNA并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中并溶解在高濃度的氯化鈉溶液中3.DNA的析出與獲取。的析出與獲取。 因為因為DNA在低濃度（在低濃度（ 0.14mol/L ）的氯化鈉溶液中溶解）的氯化鈉溶液中溶解度小，而蛋白質(zhì)的在其中的溶解度大度小，而蛋白質(zhì)的在其中的溶解度大。所以在向含。所以在向含DNA的的高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，高濃度的氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，從而使從而使DNA溶

7、解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。溶解度下降，蛋白質(zhì)溶解度增高。第4頁/共51頁4.DNA的再溶解。的再溶解。用高濃度（用高濃度（2mol/L）的氯化鈉溶液再溶解）的氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。粘稠物。5.DNA的沉淀和濃縮。的沉淀和濃縮。 對于除去了蛋白質(zhì)的對于除去了蛋白質(zhì)的DNADNA的氯化鈉溶液，必須再進一步沉的氯化鈉溶液，必須再進一步沉淀和濃縮，常用淀和濃縮，常用酒精沉淀法酒精沉淀法。即往。即往含有含有NaNa的的DNADNA溶液，加入溶液，加入體積分數(shù)為體積分數(shù)為95%95%的冷卻酒精，混勻后可以使的冷卻酒精，混勻后可以使DNADNA沉淀、濃縮，沉淀、濃縮，形成含雜質(zhì)較少的形成含雜質(zhì)較少

8、的DNADNA絲狀物絲狀物，懸浮于溶液中。若絲狀，懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后的濃縮后的DNADNA絲狀物可以用玻棒（玻棒有吸附絲狀物可以用玻棒（玻棒有吸附DNADNA的作用）的作用）緩緩旋轉的方法卷起。緩緩旋轉的方法卷起。6.DNA的鑒定。的鑒定。100DNA二苯胺二苯胺 藍色物藍色物鑒定時藍色的深淺與溶液中鑒定時藍色的深淺與溶液中DNA的含量多少有關。的含量多少有關。第5頁/共51頁方法步驟方法步驟 加入物質(zhì)加入物質(zhì) 目的目的 1.制備雞血細胞液 檸檬酸鈉溶液 2.提取雞血細胞細胞核物質(zhì) 20 m1蒸

9、餾水 3.溶解細胞核內(nèi)的DNA 2 m1L的NaCI溶液40mL 4.析出含DNA的黏稠物 蒸餾水 5.濾取含DNA的黏稠物 6.將DNA的黏稠物再溶解 2 molL的NaCl溶液20 mL 7.過濾含DNA的NaCl溶液 8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA 冷卻的95的酒精50 mL A:(1)向試管中加入0.015 molL的NaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺試劑 9.DNA的鑒定 B:(1)向試管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL二苯胺試劑 第6頁/共51頁加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固加速血細胞破裂加速

10、血細胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀釋至溶液稀釋至0.14mol/L使得使得DNA最大限最大限度地釋出度地釋出 使含使含DNA的黏稠物被留在紗布上的黏稠物被留在紗布上使含使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)的濾液中的雜質(zhì)提取提取DNA A出現(xiàn)藍色出現(xiàn)藍色 B無變化無變化第7頁/共51頁2.實驗中實驗中NaCl的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為2 molL和和0.14 molL對對DNA有何影響有何影響?1.在在DNA的粗提取實驗過程中，兩次向燒杯的粗提取實驗過程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用是中加入蒸餾

11、水的作用是( )。A.稀釋血液、沖洗樣品稀釋血液、沖洗樣品B.使血細胞破裂、降低使血細胞破裂、降低NaCl濃度使?jié)舛仁笵NA析出析出C.使血細胞破裂、增大使血細胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血細胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的使血細胞破裂、提取含雜質(zhì)較少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出第8頁/共51頁3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺( (沸水浴沸水浴) )會染成會染成( ) ( ) A. A.磚紅色磚紅色 B.B.橘黃色橘黃色 C.C.紫色紫色 D.D.藍色藍色4.提取雞血中的提取雞血中的DNA時，為什么要除去血液時，為什么要除去血液中

12、的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，關鍵是對雜質(zhì)的去除，由于上的提取，關鍵是對雜質(zhì)的去除，由于上清液是血液中的血漿部分，不含清液是血液中的血漿部分，不含DNA，所以要除，所以要除去上清液去上清液(含有蛋白質(zhì)含有蛋白質(zhì))。答：答：D第9頁/共51頁nn第10頁/共51頁第11頁/共51頁第12頁/共51頁Fig. 7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeat第13頁/共51頁多聚酶鏈式反應（多聚酶鏈式反應（PCR） 擴增擴增DNA片段片段 第14頁/共51頁第15頁/共51頁第16頁/共51頁PCRPCR的基本原理的

13、基本原理 變性、復性、半保留復制變性、復性、半保留復制一生二，二生四，四生萬物一生二，二生四，四生萬物 PCR PCR三步曲三步曲變性變性 90909797退火退火 45456565延伸延伸 7272左右左右PCRPCR過程過程第17頁/共51頁第18頁/共51頁等其他領域。等其他領域。第19頁/共51頁第20頁/共51頁 體驗從復雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機理凝膠色譜法的原理和方法 樣品的預處

14、理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。第21頁/共51頁第22頁/共51頁第23頁/共51頁每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。第24頁/共51頁選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。 使微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性、蛋白質(zhì)的空間結構被破壞。第25頁/共51頁 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對

15、分子質(zhì)量的大 小，利用具有網(wǎng)狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。 當相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢;而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。第26頁/共51頁分離蛋白質(zhì)第27頁/共51頁 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用

16、的緩沖液。, 利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察()和科 學研究()磷酸緩沖液第28頁/共51頁弱酸及其對應的鹽：弱堿及其對應的鹽：多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽:緩沖溶液由足夠濃度的共軛酸堿對組成。其中，能對抗外來強堿的稱為共軛酸；能對抗外來強酸的稱為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱為緩沖對、緩沖劑或緩沖系。第29頁/共51頁帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)

17、的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。第30頁/共51頁 第31頁/共51頁 1、在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結構的凝膠。第32頁/共51頁 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 （為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。 。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會，因此測定的結果只是。SDS

18、能與各種蛋白質(zhì)形成，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子。因而掩蓋了，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。第33頁/共51頁用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法第34頁/共51頁樣品處理粗分離純化純度鑒定（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動物的血液來分離血紅蛋白。 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。 1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4

19、、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。第35頁/共51頁 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。將攪拌好混合液轉移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第36頁/共51頁第37頁/共51頁 取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，

20、將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。第38頁/共51頁 取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。安裝其他附屬結構。第39頁/共51頁A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度

21、及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第40頁/共51頁裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。1、液面不要低于凝膠表面，否則

22、可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。第41頁/共51頁打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。 加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。 小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動

23、，說明色譜柱制作成功）正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第42頁/共51頁正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第43頁/共51頁讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結構和功能。 血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然

24、后將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)進行純度鑒定。第44頁/共51頁鑒定血紅蛋白純度。 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液。 用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。作用是提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰

25、基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍，10%的甘油。 0.1%的考馬斯亮藍R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。10%的甲醇和10%的冰醋酸。第45頁/共51頁 1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風櫥內(nèi)或通風處進行。 2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。 3、在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。第46頁/共51頁第47頁/共51頁在電泳樣品中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3 min，以使蛋白質(zhì)變性。按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個，例如，血漿樣品紅細胞破碎后(即進行凝膠色譜分離之前)的樣品和