基于傳統(tǒng)培養(yǎng)和宏基因組測序分析泗洪小龍蝦不同部位的菌群多樣性

1、    基于傳統(tǒng)培養(yǎng)和宏基因組測序分析泗洪小龍蝦不同部位的菌群多樣性    湯純 諸永志 吳海虹 孫芝蘭 朱云龍摘 要：通過傳統(tǒng)培養(yǎng)和宏基因組測序方法分析泗洪地區(qū)小龍蝦整體、表面、尾肉等不同部位的菌群多樣性，確定不同部位的特定污染菌組成。結(jié)果表明：小龍蝦整體的初始菌數(shù)達8.4 （lg（cfu/g），且不同部位的微生物群落有明顯差異;通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)，在科水平上，黃桿菌科（flavobacteriaceaea）是泗洪小龍蝦不同部位的優(yōu)勢菌科，叢毛單胞菌科（comamonadaceae）、莫拉氏菌科（moraxellaceae）和氣單胞菌科（aeromo

2、nadaceae）分別是小龍蝦整體、表面和尾肉的優(yōu)勢菌科;在屬水平上，金黃桿菌屬（chryseobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）和氣單胞菌屬（aeromonas）分別是小龍蝦整體、表面和尾肉的優(yōu)勢菌屬，黃桿菌屬（flavobacterium）在3 個部位中相對豐度均較高。關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦;培養(yǎng)基法;宏基因組測序;微生物多樣性abstract： the bacterial diversity in whole crayfishes and tail muscle， as well as on the surface of crayfishes was invest

3、igated using the traditional culture-dependent method and metagenomic analysis in this study. on this basis， the composition of special contaminant bacteria was determined. the results showed that the initial microbial load in whole crayfishes was8.4 （lg （cfu/g）. significant variation in microbial c

4、ommunity composition was found among the tested samples. the metagenomic analysis showed that the family flavobacteriaceae was dominant in all samples and comamonadaceae， moraxellaceae and aeromonadaceae were also dominant families in whole crayfishes and tail muscle， as well as on the surface of cr

5、ayfishes， respectively. at the genus level， chryseobacterium， acinetobacter， and aeromonas were the domain bacteria in whole crayfishes and tail muscle， as well as on the surface of crayfishes， respectively. the relative abundance of flavobacterium was higher for the three samples.keywords： red swam

6、p crawfish; culture-dependent method; metagenomic analysis; microbial diversity克氏原螯蝦（procambarus clarkia）俗稱小龍蝦，是一種重要的淡水經(jīng)濟蝦類，肉質(zhì)鮮嫩、肥美，廣泛分布在有淺灘的地方。自2000年以來，小龍蝦餐飲業(yè)蓬勃發(fā)展，但與之相關(guān)的食品安全問題屢見不鮮。2010年，南京23 人因食用小龍蝦患橫紋肌溶解癥（haff?。?。2011年，300余人于瑞昌參加“瑞昌市萬人龍蝦節(jié)”，隨后出現(xiàn)副溶血性弧菌群體性食物中毒2。與其他水產(chǎn)品相似，小龍蝦營養(yǎng)豐富且水分活度高，此外，生鮮小龍蝦自身微生物污染嚴(yán)

7、重，在其運輸、貯藏過程中易腐敗變質(zhì)3-5。李兵兵等6發(fā)現(xiàn)，淮安地區(qū)所產(chǎn)的生鮮小龍蝦帶有副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌。張生元7、朱若林8等從小龍蝦中分離到條件致病菌布氏檸檬酸桿菌。傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法是將樣品處理稀釋液涂布在各類選擇性培養(yǎng)基上以獲得菌種，純化分離后再分別提取dna，最后通過blast分析確定菌株類別，但該方法存在明顯不足，憑肉眼篩選菌株時，人為主觀意識較強，容易遺漏部分細菌。且自然界中可經(jīng)人工培養(yǎng)的微生物僅約1%，傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法無法培養(yǎng)出樣品中所有細菌9-10。相比之下，宏基因組測序可以同時對幾十萬到幾百萬條dna進行測序，能夠?qū)悠分兴⑸锏幕蚪M進行全面分

8、析11。于美娟等12采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基法和宏基因組測序技術(shù)確定傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵魚冷藏期間的優(yōu)勢腐敗菌，結(jié)果表明，宏基因組測序檢測到的菌屬更具有多樣性。小龍蝦屬于變溫動物，生存高度依賴水體，不同地區(qū)小龍蝦所處的生存環(huán)境、攝入的食物可能不相同，因此對小龍蝦菌群的研究不能僅從某一單因素出發(fā)，需綜合考慮多種因素13。本研究選擇泗洪地區(qū)的小龍蝦為代表，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)和宏基因組測序方法對生鮮小龍蝦整體、小龍蝦表面以及小龍蝦尾肉的細菌菌群進行分析，找出初始優(yōu)勢菌群，系統(tǒng)分析其潛在的食品安全風(fēng)險。1 材料與方法1.1 材料與試劑小龍蝦（體質(zhì)量2535 g），來源于江蘇泗洪地區(qū)，冷鮮包裝快遞至實驗室后進行樣品處理。平板計

9、數(shù)瓊脂（plate count agar，pca）、甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，msa）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，vrbga）、營養(yǎng)肉湯、十二烷基硫酸鹽胰蛋白酶（lauryl sulfate tryptose，lst）肉湯、腦心浸液（brain heart infusion，bhi）肉湯 北京奧博星生物技術(shù)制造有限責(zé)任公司;假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（cn瓊脂） 山東青島海博生物技術(shù)有限公司。1.2 方法1.2.1 樣品處理在不進行預(yù)清洗的條件下，對小龍蝦樣品的處理分為3 種：1）以小龍蝦整體為樣品

10、：稱取鮮活小龍蝦50 g，打碎后稱取10 g置于90 ml無菌生理鹽水中，均質(zhì)30 min后，梯度稀釋;2）以小龍蝦表面為樣品：選取10 只大小均等、質(zhì)量約180 g的鮮活小龍蝦，置于225 ml無菌生理鹽水中，均質(zhì)30 min后，取出小龍蝦，保留生理鹽水并進行梯度稀釋;3）以小龍蝦尾肉（帶蝦線）為樣品：無菌剝?nèi)?0 g小龍蝦蝦仁，剪碎后置于90 ml無菌生理鹽水中，均質(zhì)30 min后，梯度稀釋。1.2.2 菌數(shù)測定及優(yōu)勢腐敗菌分離鑒定按照gb 4789.22016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定進行小龍蝦樣品菌落總數(shù)測定。分別取1.2.1節(jié)中合適梯度的稀釋液100 ?l涂布于

11、pca（菌落總數(shù)計數(shù)）、vrbga（腸桿菌菌落計數(shù)）、msa（葡萄球菌菌落計數(shù)）、cn瓊脂（假單胞菌菌落計數(shù)）平板上，30 恒溫培養(yǎng)24 h。將各類平板上的特征菌落分離純化，在對應(yīng)的培養(yǎng)基上劃線2 次，獲得單菌落后，挑取單菌落于5 ml對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，30 振蕩培養(yǎng)至600 nm波長處的光密度（optical density，od600 nm）為1左右后收集菌液14。將一部分菌液與50%甘油按體積比11混合后放入-80 冰箱中保存;另一部分菌液10 000 r/min離心23 min后棄上清。用100 l無菌超純水將沉淀重懸后，100 水浴10 min;再將其10 000 r/min離心1

12、 min，收集上清液備用;取2 l上清液，加入2×master mix 20 l、無菌超純水14 l、引物27f（5-agagtttgatcmtggctcag-3）與1492r（3-ggttaccttgttacgactt-5）各2 l，進行16s rdna的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，pcr）擴增，取5 l擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳條帶清晰的擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序15。1.2.3 樣品總dna提取取1.2.1節(jié)中的樣品均質(zhì)液，4 、2 000 r/min離心10 min后，取上清液;然后4 、12 000

13、r/min離心10 min后，棄上清液，收集沉淀。將提取得到的dna樣品進行瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)量檢測后，置于-80 保存?zhèn)溆谩?.2.4 misep測序和數(shù)據(jù)分析將dna樣品送至北京奧維森基因科技有限公司，利用illumina miseq pe300宏基因組測序平臺測序。微生物多樣性檢測選取細菌16s rdna v3v4區(qū)，該區(qū)擴增引物為338f（5-actcctacgggaggcagcag-3）和806r（5-ggactacnngggtatctaat-3）16-17。通過illumina miseq平臺進行paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)過qiime（v1.8.0）軟件過濾、拼接，過濾雙端

14、序列數(shù)據(jù)，收集有效序列并矯正序列方向18。根據(jù)barcodes歸類各處理組序列信息，聚類為用于物種分類的操作分類單元（operational taxonomic unit，otu），otu相似性設(shè)置為97%19。對比silva數(shù)據(jù)庫，得到每個otu對應(yīng)的物種分類信息。再利用mothur軟件（version 1.31.2）進行alpha多樣性分析20。在門、綱、目、科、屬等分類水平上對微生物進行群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計，匯總分析新鮮泗洪小龍蝦不同部位的初始微生物群落。1.3 數(shù)據(jù)處理所有實驗重復(fù)測定3 次，采用spss 16.0軟件進行方差分析。2 結(jié)果與分析2.1 泗洪小龍蝦不同部位的初始菌相分析a. 小

15、龍蝦整體;b. 小龍蝦表面;c. 小龍蝦尾肉。由圖1可知，泗洪小龍蝦不同部位的優(yōu)勢腐敗菌均為腸桿菌。小龍蝦整體樣品在pca、vrbga、msa和cn瓊脂平板上生長的菌落數(shù)分別為8.4、7.3、7.2、7.1 （lg（cfu/g），小龍蝦表面樣品分別為7.1、6.7、6.7、6.2 （lg（cfu/g），小龍蝦尾肉樣品分別為7.0、6.4、6.1、6.0 （lg（cfu/g）。泗洪小龍蝦不同部位的菌落數(shù)有一定差別，尾肉樣品的菌落數(shù)較低。一方面可能是由于小龍蝦體表外骨骼中的幾丁質(zhì)具有致密結(jié)構(gòu)，能有效阻攔微生物入侵21，還可能是由于通過去除蝦頭和外殼減少了一定數(shù)量的微生物22。莊秋麗等23發(fā)現(xiàn)，刀額

16、新對蝦的初始菌落數(shù)為23 （lg（cfu/g），段偉文等24通過菌落計數(shù)發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦的初始菌落數(shù)大于4.0 （lg（cfu/g）。初始菌落數(shù)的差異可能與蝦的品種、養(yǎng)殖環(huán)境、實驗預(yù)處理方式等因素有關(guān)。2.2 泗洪小龍蝦不同部位優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定通過平板劃線法，根據(jù)4 種平板培養(yǎng)基上菌株的形態(tài)，分離得63 株菌。將每株菌進行16s rdna擴增，對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。在2 000 bp與1 000 bp之間出現(xiàn)特異性條帶即為成功擴增樣品，對獲得特異性條帶的pcr產(chǎn)物進行測序分析。將測序所得序列進行ncbi blast分析，選取同源性98%以上的菌株序列，確定菌株種屬15，構(gòu)建系

17、統(tǒng)進化發(fā)育樹（圖2）。由表1可知，泗洪小龍蝦不同部位分離所得63 株菌中大多數(shù)菌株均屬于腸桿菌科，其中32 株菌為檸檬酸桿菌屬。檸檬酸桿菌在自然界中普遍存在，易引起水產(chǎn)動物感染發(fā)病25。曹榮等26發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦的主要初始菌群為鞘脂桿菌屬（sphingobacterium）、金黃桿菌屬（chryseobacterium）和寡養(yǎng)單胞菌屬（stenotrophomonas）。jaaskelainen等27發(fā)現(xiàn)，三文魚和金槍魚中的主要腐敗菌分別為發(fā)光桿菌屬（photobacterium）和假單胞菌屬（pseudomonas）。zhang jingbin等28發(fā)現(xiàn)，不動桿菌（acinetobacter

18、）和假單胞菌（pseudomonas）是新鮮草魚片中的主要腐敗菌。水產(chǎn)品中主要腐敗菌的差異可能與生長環(huán)境和物種有關(guān)。2.3 泗洪小龍蝦不同部位的宏基因組測序結(jié)果及otu分析用trimmomatic及flash軟件優(yōu)化通過illumina miseq宏基因組測序獲得的新鮮小龍蝦不同部位樣品總菌的原始序列數(shù)據(jù)，9 個小龍蝦樣品共得到674 567 條有效序列。st. 泗洪小龍蝦整體;ss. 泗洪小龍蝦表面;si. 泗洪小龍蝦尾肉。圖510同。1、2、3代表平行樣。圖69同。由圖3可知，674 567 條有效序列中，序列的平均長度大部分集中在200260區(qū)間內(nèi)。由圖4可知，隨著樣品數(shù)的增加，otu數(shù)

19、量增加，當(dāng)樣品數(shù)大于20 000時，otu曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量較為合理，且測序數(shù)據(jù)量足夠大，基本可以反映樣品中所有的微生物多樣性信息。2.4 泗洪小龍蝦不同部位菌群的alpha多樣性指數(shù)分析alpha多樣性是指某個特定生態(tài)系統(tǒng)或區(qū)域內(nèi)的多樣性，對樣品進行alpha多樣性指數(shù)（包括chao1、observed_species、pd_whole_tree及shannon指數(shù)）分析可以反映樣品中微生物群落的豐度和均勻度。chao1和observed_species指數(shù)可以反映樣品中微生物群落的豐富度，主要反映樣品的測序量是否充足;shannon指數(shù)可以反映樣品中微生物群落的多樣性，pd_wh

20、ole_tree指數(shù)可以反映樣品中的微生物群落對進化歷史保存的差異15-16。由圖5可知，3 個部位樣品的chao1和observed_species指數(shù)均較高，說明樣品的測序量較為充足。另外，泗洪小龍蝦整體的pd_whole_tree及shannon指數(shù)均最高，說明該批次小龍蝦菌群多樣性較高，小龍蝦尾肉的pd_whole_tree及shannon指數(shù)與小龍蝦整體、小龍蝦表面相比較低，而小龍蝦與外界直接接觸的部位主要是體表、消化器官及腸道，小龍蝦的消化器官及腸道是重要的免疫器官，能有效阻止病原微生物的侵入21，尾肉樣品中的菌群主要為小龍蝦的腸道菌群，說明該批次小龍蝦的腸道菌群多樣性較低，這可能

21、與小龍蝦自身的免疫機制及所處飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。2.5 泗洪小龍蝦不同部位的菌群組成和聚類分析為了得到每個otu對應(yīng)的物種分類信息，采用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，rdp）classifier算法對otu代表序列進行比對分析，并在科、屬的水平上注釋各樣品中菌群的物種信息。2.5.1 基于科分類水平的分析由圖6可知，泗洪小龍蝦不同部位的菌群組成差異明顯。黃桿菌科（flavobacteriaceae）是泗洪小龍蝦整體和表面攜帶菌群中的主要菌科，而莫拉氏菌科（moraxellaceae）在表面樣品中的相對豐度與叢毛單胞菌科（comamonadaceae）在整體樣

22、品中的相對豐度均超過10%。泗洪小龍蝦尾肉中的主要菌群為氣單胞菌科（aeromonadaceae），黃桿菌科（flavobacteriacea）的相對豐度低于氣單胞菌科（aeromonadaceae）。此外，所有樣品中相對豐度高于5%的菌科還有希瓦氏菌科（shewanellaceae）、腸桿菌科（enterobacteriaceae）和假單胞菌科（pseudomonadaceae）。2.5.2 基于屬分類水平的分析由圖7可知，泗洪小龍蝦不同部位的菌群多樣性較高，主要有氣單胞菌屬（aeromonas）、黃桿菌屬（flavobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）和金黃桿菌屬

23、（chryseobacterium），3 個部位樣品菌群多樣性類似，但比例稍有不同。與傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法分離到的菌屬有較大差別，表明宏基因組測序法在一定程度上彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法的局限性。其中，泗洪小龍蝦整體樣品中的主要菌屬為黃桿菌屬（flavobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）、金黃桿菌屬（chryseobacterium）、假單胞菌屬（pseudomonas）和氣單胞菌屬（aeromonas），表面樣品中的主要菌屬為黃桿菌屬（flavobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）、金黃桿菌屬（chryseobacterium）和假單胞菌屬（ps

24、eudomonas），尾肉樣品中的主要菌屬為氣單胞菌屬（aeromonas）、黃桿菌屬（flavobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）、希瓦氏菌屬（shewanella）和假單胞菌屬（pseudomonas）。根據(jù)屬水平上的物種組成和相對豐度，通過upgma方法對各樣品進行聚類分析。由圖8可知，泗洪小龍蝦3 個部位的樣品在一個分支上，說明3 個部位樣品的菌種組成和相對豐度類似。2.6 泗洪小龍蝦不同部位菌群變化的熱圖分析通過可以用顏色變化反映原始數(shù)據(jù)信息或二維矩陣的熱圖，將9 個樣品的數(shù)據(jù)簡單聚合，直觀地用顏色深淺來表示數(shù)據(jù)大小。不同豐度的物種分塊聚焦，通過彩虹色梯度

25、及顏色深淺可以反映全部樣品在各分類水平上群落組成的差異性和相似性29-30。顏色深淺代表otu/物種豐度的高低。由圖9可知，泗洪小龍蝦不同部位的優(yōu)勢菌群，如黃桿菌屬（flavobacterium）、不動桿菌屬（acinetobacter）、金黃桿菌屬（chryseobacterium）和假單胞菌屬（pseudomona）等的比例大致相同，但泗洪小龍蝦整體與表面的優(yōu)勢菌群類似，泗洪小龍蝦尾肉與整體、表面的優(yōu)勢菌群有一定差別。例如，泗洪小龍蝦整體和表面中的黃桿菌屬（flavobacterium）和金黃桿菌屬（chryseobacterium）豐度較尾肉高，尾肉中的氣單胞菌屬（aeromonas）豐

26、度較整體和表面高。小龍蝦養(yǎng)殖場的水體環(huán)境中存在著一定量微生物31，而小龍蝦表面中的微生物主要來自小龍蝦直接接觸的水體環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境對小龍蝦整體的初始菌群影響較大。2.7 泗洪小龍蝦不同部位菌群的主成分分析通過主成分分析可以進一步反映不同樣品的菌群物種差異。橫、縱坐標(biāo)軸分別表示樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的兩大主成分，橫軸表示第1主成分，縱軸表示第2主成分，百分?jǐn)?shù)代表主成分對樣品差異的貢獻率23。由圖10可知，第1主成分與第2主成分的貢獻率分別為70.70%和18.32%，說明2 個主成分能反映所有樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成差異。泗洪小龍蝦樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成越相似，圖中樣品之間的距離越近。

27、通過縱向和橫向觀察均發(fā)現(xiàn)，泗洪小龍蝦尾肉（帶蝦線）樣品與小龍蝦整體樣品、表面樣品之間的距離較遠，小龍蝦整體樣品與表面樣品之間的距離較近，與alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致。3 結(jié) 論以泗洪小龍蝦的不同部位為研究對象，運用illumina miseq宏基因組測序方法分析新鮮小龍蝦不同部位的菌群組成，結(jié)果表明，新鮮小龍蝦不同部位所攜帶的菌群多樣性有差異。傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定法分離所得3 個部位小龍蝦中的主要細菌為檸檬酸桿菌屬（citrobacter）、克雷伯氏菌屬（klebsiella）、蜂房哈夫尼菌屬（hafnia alvei）和氣單胞菌屬（aeromonas）。宏基因組測序結(jié)果表明，小龍蝦3 個部位

28、的初始菌群組成有一定差別：新鮮小龍蝦整體菌群以黃桿菌屬（flavobacterium）、不動細菌屬（acinetobacter）、金黃桿菌屬（chryseobacterium）為主，與小龍蝦表面的微生物組成類似;小龍蝦尾肉的菌群與整體、表面差別較大，主要由氣單胞菌屬（aeromonas）、黃桿菌屬（flavobacterium）、假單胞菌屬（pseudomonas）和希瓦氏菌屬（shewanella）組成。針對不同部位菌群多樣性差異，本研究建議對小龍蝦的養(yǎng)殖環(huán)境進行嚴(yán)格管控，必要時可著重清洗小龍蝦表面、去除尾部腸道，以控制小龍蝦的初始菌落數(shù)。已有研究表明，檸檬酸桿菌屬和氣單胞菌屬是小龍蝦的主要

29、細菌性病原，對小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)有較大威脅7，8，32。而希瓦氏菌屬、假單胞菌屬和不動細菌屬均為水產(chǎn)品等富含蛋白質(zhì)食品中的常見腐敗菌，其中希瓦氏菌屬的產(chǎn)硫能力極強，有一定的嗜冷性，低溫條件下可迅速繁殖，不利于小龍蝦的低溫貯藏33。本研究為評估小龍蝦食品安全質(zhì)量風(fēng)險、檢測小龍蝦質(zhì)量提供了扎實的理論依據(jù)。參考文獻：1 韓麗嵐， 徐榮靖. 南京“小龍蝦事件”調(diào)查處理分析j. 中國衛(wèi)生監(jiān)督雜志， 2012， 19（1）： 75-78. doi：1007-6131（2012）01-075-04.2 孫吉昌， 游興勇， 劉成偉， 等. 一起由副溶血性弧菌致群體性食物中毒的調(diào)查報告j. 中國食品衛(wèi)生雜志， 201

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