有關物質方法學

1、有關物質方法學研究主要內容1、有關物質檢查方法建立的研發(fā)思路2、有關物質方法的建立和方法學驗證2.1、原料藥和制劑的相關理化性質2.2、有關物質分析方法的選擇2.3、有關物質分析方法的驗證2.4、有關物質雜質的定量方法3、有關物質雜質的分析4、有關物質雜質限度的制訂有關物質檢查方法建立的研發(fā)思路研發(fā)思路：有關物質檢測方法的建立重點是測定方法的先進性、準確性、可行性。（1首先有關物質的方法選擇，對于仿制藥有EP、BP、USP等質量標準的藥品，首選以上的色譜條件進行篩選，尤其關注的離子對試劑的使用。（避用不同色譜條件進行對比研究，如果方法一是等度測定的，方法二最好選用梯度色譜條件，比較兩種方法測定

2、結果的雜質個數(shù)及雜質含量等。確證有關物質測定方法的準 確性。（瀏所篩選的方法進行系統(tǒng)的方法學研究，比較不同檢測方法的優(yōu)劣，選擇較好的色譜 條件作為本品有關物質檢查的測定方法。寸于仿制藥同時要將自制樣品與市售原研樣品進行全面的質量比較，分析其雜質的種類和含量，確保自制樣品與市售原研樣品的雜質在同一水平。原料藥和制劑的相關理化性質在建立有關物質檢查方法前，需首先了解原料藥和制劑的相關理化性質。（1M于原料藥，了解原料藥的基本性質和結構特點。了解原料藥合成工藝過程中的起始原料、副產(chǎn)物、副產(chǎn)物產(chǎn)生的雜質、中間產(chǎn)物或可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物等。結合相關已知的雜質來確定有關物質檢測的條件。（列于制劑，可能影響藥

3、物有關物質的重要因素有輔料、劑型、存儲條件等，主要了解輔料對有關物質檢測的干擾情況，不同劑型在不同存貯條件下可能產(chǎn)生的雜質等。對于復方制劑，同時要考慮到復方中原料的相互作用可能產(chǎn)生的雜質等。有關物質分析方法的選擇有機雜質的檢測方法包括化學法、光譜法、色譜法等，因藥物結構及降解產(chǎn)物的不同采用不同的檢測方法。通過合適的分析技術將不同結構的雜質進行分離、檢測，從而達到對雜質的有效控制。目前普遍采用的雜質檢測方法主要有：（1 高效液相色譜法（HPLC ）目前采用的分析方法主要以高效液相色譜法為主，為常用 的分析方法。選擇不同的色譜柱對雜質進行有效的分離。（醺層色譜法（TLC） 是色譜法中的一種， 是快

4、速分離和定性分析少量物質的一種很重要 的實驗技術，但準確性較低。（聽相色譜法（GC）氣相色譜法主要是用于能氣化的物質的檢測和分離。一般用于有機殘留溶劑的檢測和分離。也可用于一些能揮發(fā)的雜質的檢測。（佻細管電泳法（CE ）毛細管電泳法是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據(jù)樣品中各組分的淌度和（或）分配行為的差異而實現(xiàn)各組分分離的一種分析方法。其應用比較廣泛，但該方法測定精密度不高，專屬性不穩(wěn)定，且CE儀器價格較高。由于各種分析方法均具有一定的局限性，因此在進行雜質分析時，應注意不同原理的分析方法間的相互補充與驗證，如HPLC與TLC及HPLC與CE的互相補充，反相HPLC系統(tǒng)

5、與正相HPLC系統(tǒng)的相互補充， HPLC不同檢測器檢測結果的相互補充等。有關物質分析方法的驗證O測波長的選擇有關物質檢測波長是結合主成分與雜質的最大吸收波長進行選擇。測定方法：分別稱取待測供試品、對照品、空白輔料、市售對照樣品適量，用流動相溶 解并稀釋到一定濃度，配制成對照品溶液、供試品溶液以及空白輔料溶液，分別于采用 HPLC法測定，采用 DAD檢測器進行，確定待測物質中各雜質的最大吸收波長、主峰 的最大吸收波長以及空白輔料的干擾情況等，有雜質對照品的同時進行掃描，或HPLC進行測定。必要時可將供試品溶液適當破壞后測定各降解產(chǎn)物的最大吸收波長。判斷結果：根據(jù)測定結果確定有關物質測定的檢測波長

6、。有關物質分析方法的驗證專屬性試驗專屬性系指在其它成分可能共存的情況下，采用的方法能準確測定出被測雜質的特性（謝于原料藥，可根據(jù)其合成工藝，采用各步反應的中間體（尤其是后幾步反應的中間 體）、立體異構體、粗品、重結晶母液等作為測試品進行系統(tǒng)適用性研究，考察產(chǎn)品中 各雜質峰及主成分峰相互間的分離度是否符合要求，從而驗證分析方法對工藝雜質的分 離能力。（卻艮據(jù)藥物的化學結構特點、制劑的處方與工藝、儲存條件等選用合適的酸、堿、光、 熱、濕、氧化反應等加速破壞性試驗來驗證分析方法的專屬性。雖制降解試驗在試驗過程中，應注意破壞性試驗要適度，應著重考察敏感條件。如在 一定條件下穩(wěn)定，則無必要再提高條件的劇

7、烈程度進行重復試驗。破壞試驗的程度暫無 統(tǒng)一要求，一般以強力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。要達到這種破壞程度， 需要在研究過程中進行摸索，先通過初步試驗了解樣品對光、熱、濕、酸、堿、氧化條 件的基本穩(wěn)定情況，然后進一步調整破壞性試驗條件（如光照強度、酸堿濃度、破壞的 時間、溫度等），以得到能充分反映降解產(chǎn)物與主成分分離的結果和圖譜。有關物質分析方法的驗證O測限與定量限檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，是反映分析方法靈敏度的一個重 要指標；最低檢測限不得大于該雜質的報告限度，以保證檢出需控制的雜質。測定方法：取待測物質對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀釋

8、法，以信噪比為 3 : 1時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為3:1的樣品溶液進樣 6針，以峰面積計算相對標準偏差。判斷結果：最小檢測限濃度下樣品峰面積的相對標準偏差應< 20%以最小檢測限來確定供試品溶液配制的濃度作為依據(jù)o定量限是指被測雜質能夠被定量測定的最低量。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的 定量檢測能力。雜質定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質能夠被準 確測出。測定方法：取待測物質對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀釋法，以信噪比為10 ： 1時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為10 : 1的樣品溶液進樣 6針

9、，以峰面積計算相對標準偏差。判斷結果：定量限濃度下樣品峰面積的相對標準偏差應< 10%有關物質分析方法的驗證U系統(tǒng)適應性系統(tǒng)適應性試驗主要是考察主成分與雜質的分離情況以及主峰參數(shù)信息，如理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度等，均應符合測定要求。 任精密度試驗精密度試驗包括：重復性試驗、中間精密度試驗等。任溶液穩(wěn)定性試驗考察樣品在配制溶劑中的雜質與主峰的穩(wěn)定性，取一定濃度的樣品溶液，分別于不同時間取樣測定雜質與主峰的峰面積，以相對標準偏差來表示不同時間 測定結果的穩(wěn)定性。 判斷結果：結果RSD,洛2.0% ,在測定時間內的樣品溶液穩(wěn)定性良 好。伽用性試驗耐用性試驗是指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結

10、果不受影響的承受程度。一般系統(tǒng)變化條件：分別考察流動相比例變化±5%、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5 G檢測波長變化 ±5nm、流速相對值變化 ±20 %以及采用三根不同批號的色譜柱 進行測定時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。可接受的標準為：各雜質 峰的拖尾因子不得大于2.0,雜質峰與其他成分峰必須達到基線分離；各條件下的雜質含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對標準差應不大于 2.0%，雜質含量的絕對值在 ±0.1%以內。特殊 樣品如果色譜條件變化比較敏感的，可適當降低變化范圍。耐用性試驗部分還包括樣品萃?。ㄌ崛。┓€(wěn)健性：可理

11、解為提取方法的重復性良好。即 提取方法的確定驗證試驗。有關物質雜質的定量方法有關物質雜質的定量方法根據(jù)雜質與主成分的最大吸收波長及校正因子來確定。若雜質 與主峰的吸收波長基本一致，則一般采用自身對照法或峰面積歸一化法；若雜質與主峰 的吸收波長差異范圍較小，校正因子在0.91.1之間，則可采用不加校正因子的主成分自身對照法；超出該范圍，校正因子在 0.25.0范圍以內時，采用主成分自身對照法的 定量方式，須用校正因子進行校正；若雜質與主峰的吸收波長相差較大，校正因子在 0.25.0范圍以外時，不能通過校正因子校正，則要采用外標法進行測定。世卜標法（雜質對照品法）外標法定量比較準確，采用外標法進行

12、測定時，應進行相應的方法學研究。A檢測波長的選擇檢測波長的選擇測定方法參照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010版二部附錄IV A）進行測定，或采用HPLC法，DAD檢測器進行測定。 同時考察輔 料干擾等。B標準曲線線性關系應在設計的測定范圍內測定?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列被測物質濃度系列進行測定，至少制備5個濃度。以測得的響應信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，用最小二乘法進行線性回歸。 有關物質雜質的定量方法C精密度試驗儀器精密度試驗主要是考察測定方法在所用的試驗儀器測定結果的偏差，精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。測定方法：取一定濃度的雜質

13、對照品溶液，連續(xù)測定次數(shù)至少6次，以峰面積的測定結果計算相對標準偏差，考察儀器測定的。D重復性試驗重復性系指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔內，由同一分析人員測定所得結果的精密度。重復性測定可在規(guī)定范圍內，至少用9次測定結果進行評價， 如制備3個不同濃度的試樣，各測定 3次，或100%的濃度水平，用至少測定 6次的結 果進行評價。常用的測定方法時采用100%的濃度，測定6次，計算測定結果的相對標準偏差。測定方法：按含量測定的方法，分別平行稱取6份樣品，按外標法測定雜質的含量，以雜質含量測定結果計算相對標準偏差。E中間精密度中間精密度系指在同一實驗室，由于實驗室內部條件改變，如時間、分析人員、

14、儀器設備、測定結果的精密度。驗證設計方案中的變動因素一般為日期、分析人員、設備?？疾煸诓煌蛩刈儎拥臈l件下，測定結果的標準偏差。有關物質雜質的定量方法測定方法：按含量測定的方法，分別由不同的人員、時間、不同儀器按外標法測定樣品 雜質的含量，以雜質含量測定結果計算相對標準偏差。F回收率試驗回收率試驗來驗證測定方法的準確度。試驗設計需考慮在規(guī)定范圍內，制備3個不同濃度的試樣，各測定 3次，即測定9次，報告已知加入量的回收率（%） 或測定結果平均值與真實值之差及其可信限。并考察不同濃度下測定結果的相對標準偏 差。測定方法：按含量測定的方法，按加樣回收率測定方法，在已知雜質含量的樣品中加入 不同濃度的

15、雜質對照品，按外標法分別測定不同濃度樣品中的測的量，計算測的量比加 入量的百分含量（即回收率），以不同濃度下的回收率計算相對標準偏差。G雜質的檢測限檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，是反映分析方法靈敏度的一個重要指標；最低檢測限不得大于該雜質的報告限度，以保證檢出需控 制的雜質。測定方法：取待測物質對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀釋法，以信噪比為 3 : 1時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為3:1的樣品溶液進樣 6針，以峰面積計算相對標準偏差。判斷結果：最小檢測限濃度下樣品峰面積的相對標準偏差應< 20%以最小檢測限來確定供試品溶液

16、配制的濃度作為依據(jù)o 有關物質雜質的定量方法H雜質的定量限定量限是指被測雜質能夠被定量測定的最低量。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量 很少的雜質能夠被準確測出。測定方法：取待測物質對照品適量，加流動相配制成一點濃度的對照品溶液，按倍倍稀 釋法，以信噪比為 10 ： 1時相應的濃度或注入儀器的量確定檢測限。同時將信噪比為 10 : 1的樣品溶液進樣 6針，以峰面積計算相對標準偏差。判斷結果：定量限濃度下樣品峰面積的相對標準偏差應< 10%有關物質雜質的定量方法 加校正因子的主成分自身對照法采用加校正因子自身對照法應進行相應雜質的校

17、正因子的測定，僅適用于已知雜質的控制，如果校正因子在 0.25.0的范圍內也可用加校正因子的主成分自身對照法。校正因子的定義及特點一般來講，HPLC定量測定中，物質的檢測量 W與色譜響應值（峰面積等） A之間的比值稱為絕對校正因子，即單位響應值（峰面積等）所對應 的被測物質的量（濃度或質量）；而某物質i與所選定的參照物質 s的絕對校正因子之比， 即為相對校正因子，即通常所講的校正因子。但這種方法有時會因不同儀器及色譜條件 的波動，可產(chǎn)生一定范圍的誤差，需進行充分的方法耐用性驗證，并結合色譜峰定位控 制等措施，將誤差控制在一定范圍內。校正因子測定的要求A測定校正因子的各雜質與主成分的標準物質（對

18、照品） ，應符合標準物質（對照品）的要求。B確定校正因子的分析方法應與最終確定的質量標準方法一致，色譜條件等需經(jīng)篩選優(yōu)化后確定，如有變更，需考慮對校正因子的影響，必 要時重新確定。C要關注影響待測物 UV吸收的各種因素，如溶液制備所用溶劑最好與 最終確定的流動相相同，檢測波長最好在特定雜質及主成分UV曲線的峰或谷處，避開吸收值急劇變化波段，以保證測定方法具有較好的耐用性，并保持測定結果的恒定。有關物質雜質的定量方法校正因子的測定：A單濃度點測定：制備適當濃度的特定雜質對照品溶液和主成分對照 品溶液，分別進樣測定，待測樣品的絕對校正因子與參照樣品絕對校正因子的比，得到 校正因子。B多濃度點測定：

19、制備適當?shù)母?、中、低三水平濃度的特定雜質對照品溶液和主成分對 照品溶液（涵蓋定量限、標準限度），分別進樣測定，同法進行分別各點計算，求平均值，計算RSD ,得到校正因子。C標準曲線法測定：精密稱取雜質對照品和主成分對照品，分別制備系列溶液（涵蓋定 量限、標準限度），分別進樣后，按最小二乘法以進樣量對響應值（峰面積等）進行線 性回歸，求得兩條標準曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。D吸收系數(shù)比值法：對于 UV檢測器來講，兩物質的相對校正因子實際上也是兩物質以 流動相為溶劑，在檢測波長處的紫外吸收系數(shù)E1cm1%之比，故可按吸收系數(shù)法測定法的相關技術要求測定各自吸收系數(shù)，如對照品級別的標準物質、高中

20、低三水平濃度測定、吸收度介于0.30.8之間、至少5臺不同型號的 UV分光光度計、2份供試液同時平行 制備測定、同臺儀器 2份供試液的平行測定結果不超過±0.5%等。測定兩物質的吸收系數(shù)后，經(jīng)統(tǒng)計分析確定兩物質吸收系數(shù)，計算比值，求得校正因子。有關物質雜質的定量方法測定方法的選擇： 上述各方法中，A和B法較為簡捷，可以快捷地量化特定雜質與主成 分紫外吸收特征的差異，多用于評估采用主成分自身對照法定量雜質時是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對照法定量雜質，需將標準物質賦值信息轉化為校正 因子固化在質量標準中，那么校正因子的準確性非常關鍵，校正因子的準確計算應符合 更為嚴格的要

21、求，需要考慮并控制求算校正因子過程中的各種誤差因素，以及儀器通用 性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素，以便使求得的常數(shù)更為準確并具代表性，此時采用C、D法更為適宜，如能考慮到測定人員、不同試驗室因素的影響，會更加符合常數(shù)求算的 基本要求。在采用校正因子測定雜質的時候，要有加校正因子定量方式的合理性和測定結果的準確 性的試驗對比研究數(shù)據(jù)（研究數(shù)據(jù)應包括雜質對照品外標法、加校正因子的主成分自身 對照法、不加校正因子的主成分自身對照法對相同多批樣品雜質定量測定結果的對比數(shù) 據(jù)，作為是否需要校正或能否有效校正檢測結果的支持與依據(jù)）。有關物質雜質的定量方法 不加校正因子的主成分自身對照法（自身對照法）不加校正因子的主成分自身對照法（自身對照法）是雜質與主成分的響應因子基本相同 （校正因子在 0.91.1 ）。一般情況下，如雜質與主成分的分子結構相似，其響應因子 差別不會太大。測定方法：稱取供試品樣品適量，加適當溶劑配制成一定濃度的供試品溶液；精密