基因芯片的操作流程及步驟PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1基因芯片的操作流程及步驟基因芯片的操作流程及步驟1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES1 CELL =23 PAIRS OF CHROMOSOMES第1頁(yè)/共88頁(yè)第2頁(yè)/共88頁(yè)第3頁(yè)/共88頁(yè)第4頁(yè)/共88頁(yè)第5頁(yè)/共88頁(yè)細(xì)胞細(xì)胞對(duì)對(duì)mRNA進(jìn)行標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記雜交雜交基因表達(dá)資料基因表達(dá)資料第6頁(yè)/共88頁(yè)基因芯片研制的總體藍(lán)圖基因芯片研制的總體藍(lán)圖 研制方向的確定研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定基因探針序列的確定檢測(cè)樣品檢測(cè)樣品 的制備的制備探針陣列的探針陣列的準(zhǔn)備準(zhǔn)備檢測(cè)設(shè)備的檢測(cè)設(shè)備的研制研制雜交檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析雜

2、交檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析第7頁(yè)/共88頁(yè)大量探針?lè)肿樱ㄍǔＣ科椒嚼迕c(diǎn)陣密度高于500）于固定支持物上檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度與被標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息第8頁(yè)/共88頁(yè)基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物基因芯片是信息時(shí)代的產(chǎn)物橫跨橫跨：生命科學(xué)、物理學(xué)、生命科學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)計(jì)算機(jī)科學(xué)、微電子技術(shù)光電技術(shù)、材料科學(xué)光電技術(shù)、材料科學(xué) 等現(xiàn)代高等現(xiàn)代高科技?？萍?。第9頁(yè)/共88頁(yè)4.我國(guó)主要研究單位我國(guó)主要研究單位第10頁(yè)/共88頁(yè)第11頁(yè)/共88頁(yè)第12頁(yè)/共88頁(yè)6400點(diǎn)的基因芯片點(diǎn)的基因芯片 （面積（面積 12X14 mm)第13頁(yè)/共88頁(yè)第14頁(yè)/共

3、88頁(yè)把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒偷?5頁(yè)/共88頁(yè)薄膜型、玻片型微板型集成電路型第16頁(yè)/共88頁(yè)第17頁(yè)/共88頁(yè)核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。是基因芯片應(yīng)用的基礎(chǔ)。第二節(jié)、基因芯片技術(shù)第二節(jié)、基因芯片技術(shù)第18頁(yè)/共88頁(yè)第19頁(yè)/共88頁(yè) 表達(dá)型基因芯片的設(shè)計(jì)表達(dá)型基因芯片的設(shè)計(jì)第20頁(yè)/共88頁(yè)一、基因芯片（一、基因芯片（DNA微陣列）微陣列）u 寡

4、核苷酸芯片、寡核苷酸芯片、cDNAcDNA芯片、芯片、GenomicGenomic芯片芯片 u 模式一：是將靶模式一：是將靶DNADNA固定于支持物上，適固定于支持物上，適 合于大量不同靶合于大量不同靶DNADNA的分析，的分析，u 模式二：將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，模式二：將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希?適合對(duì)同一靶適合對(duì)同一靶DNADNA進(jìn)行不同探針序列的分進(jìn)行不同探針序列的分 析。析。 第21頁(yè)/共88頁(yè)1.基因芯片原理 基因芯片基因芯片是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的。它是在基因探針的基礎(chǔ)上研制出的。它將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷希缓笈c標(biāo)記的樣品將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，然后與標(biāo)

5、記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布來(lái)進(jìn)行分析?；蛐酒汛罅糠肿訖z測(cè)單元集成在一個(gè)微小的析。基因芯片把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物固體基片表面，可同時(shí)對(duì)大量的核酸和蛋白質(zhì)等生物分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析。分子實(shí)現(xiàn)高效、快速、低成本的檢測(cè)和分析。 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是建立在是建立在Southern blotSouthern blot基礎(chǔ)之上基礎(chǔ)之上的，可以說(shuō)它是的，可以說(shuō)它是Southern blotSouthern blot的改進(jìn)和發(fā)展，它的的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變

6、性原理是：變性DNA DNA 加入探針后在一定溫度下退火，同加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。源片段之間通過(guò)堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。第22頁(yè)/共88頁(yè)第23頁(yè)/共88頁(yè)第24頁(yè)/共88頁(yè)一組寡核苷酸探針一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組由雜交位置確定的一組核酸探針序列核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列重組的互補(bǔ)序列靶序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC A

7、TACGTTA第25頁(yè)/共88頁(yè)基因芯片熒光標(biāo)記的樣熒光標(biāo)記的樣品品 共聚焦顯微鏡共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象獲取熒光圖象雜交結(jié)果分雜交結(jié)果分析析探探 針針 設(shè)設(shè) 計(jì)計(jì)雜交第26頁(yè)/共88頁(yè)提出問(wèn)題提出問(wèn)題芯片設(shè)計(jì)芯片設(shè)計(jì)芯片制作芯片制作點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣方法 在片合成在片合成試樣處理試樣處理芯片雜交芯片雜交雜交檢測(cè)雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用PCR擴(kuò)增擴(kuò)增靶基因標(biāo)記靶基因標(biāo)記表達(dá)差異分表達(dá)差異分析析多態(tài)性分析多態(tài)性分析再測(cè)序再測(cè)序生物信息學(xué)生物信息學(xué)數(shù)學(xué)優(yōu)化數(shù)學(xué)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)基因芯片的相關(guān)技術(shù)示意基因芯片的相關(guān)技術(shù)示意圖圖第27頁(yè)/共88頁(yè)第28頁(yè)/共88頁(yè)基基 因因 芯芯 片片 流流

8、程程樣品制備樣品制備芯片制備芯片制備雜交雜交雜交信號(hào)檢測(cè)雜交信號(hào)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析第29頁(yè)/共88頁(yè)基因芯片的操作流程第30頁(yè)/共88頁(yè)第31頁(yè)/共88頁(yè)例例 基于芯片的基因測(cè)序基于芯片的基因測(cè)序第32頁(yè)/共88頁(yè)第33頁(yè)/共88頁(yè)cDNA spotted microarrays第34頁(yè)/共88頁(yè)點(diǎn)點(diǎn)”，“小點(diǎn)小點(diǎn)”，“低信低信號(hào)點(diǎn)號(hào)點(diǎn)”進(jìn)行篩選，并作標(biāo)進(jìn)行篩選，并作標(biāo)記）記）第35頁(yè)/共88頁(yè)第36頁(yè)/共88頁(yè)第37頁(yè)/共88頁(yè)第38頁(yè)/共88頁(yè)第39頁(yè)/共88頁(yè)第40頁(yè)/共88頁(yè)第41頁(yè)/共88頁(yè)第42頁(yè)/共88頁(yè)第43頁(yè)/共88頁(yè) 基因芯片使用步驟基因芯片使用步驟芯片制作芯片制作把探針

9、固定于載體表把探針固定于載體表面面樣品處理樣品處理目標(biāo)分子富集目標(biāo)分子富集分子間的雜交分子間的雜交結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分結(jié)果檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析析第44頁(yè)/共88頁(yè)原位合成原位合成直接點(diǎn)樣直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位光蝕刻合成原位噴印合成原位噴印合成 分子印章法分子印章法針式點(diǎn)樣針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法光導(dǎo)原位合成法 第45頁(yè)/共88頁(yè)優(yōu)點(diǎn)是可以用很少的步驟合成及其大量的探針陣列第46頁(yè)/共88頁(yè)1、原位光蝕刻合成、原位光蝕刻合成 寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術(shù)是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿

10、基單體的5羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5端保護(hù)的核苷酸端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n個(gè)個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)核苷酸的寡聚核苷酸，通過(guò)4n個(gè)化學(xué)步驟能合成出個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò)個(gè)

11、可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過(guò)32個(gè)個(gè)化學(xué)步驟，化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。個(gè)探針。 第47頁(yè)/共88頁(yè) 目前美國(guó)目前美國(guó)Affymetrix公司已有同時(shí)檢測(cè)公司已有同時(shí)檢測(cè)6,500個(gè)已知人類基個(gè)已知人類基因的因的DNA芯片，并且正在制備含芯片，并且正在制備含500,000-1,000,000個(gè)寡核苷酸個(gè)寡核苷酸探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的探針的人類基因檢測(cè)芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經(jīng)費(fèi)約經(jīng)費(fèi)約100萬(wàn)美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診萬(wàn)美元。該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具

12、有誘人的前景。斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景。 目前，用于分子診斷的目前，用于分子診斷的DNA芯片不僅已可用于檢測(cè)愛滋病芯片不僅已可用于檢測(cè)愛滋病病毒基因還可用于囊性纖維化（病毒基因還可用于囊性纖維化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相關(guān)基因的基因診斷。病相關(guān)基因的基因診斷。 鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成鑒于光刻設(shè)備技術(shù)復(fù)雜，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，加之成本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：本高及合成效率不高的問(wèn)題，因此有待進(jìn)行以下研究：對(duì)對(duì)光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；光刻技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提高合成效率；開發(fā)新的原位合成技開發(fā)新

13、的原位合成技術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非術(shù)，如噴印合成技術(shù)，該技術(shù)既能進(jìn)行原位合成又能進(jìn)行非原位合成。原位合成。第48頁(yè)/共88頁(yè)第49頁(yè)/共88頁(yè)第50頁(yè)/共88頁(yè)3、原位噴印合成、原位噴印合成 芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是不過(guò)芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列芯片上移動(dòng)并根據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該需要將特定的堿基噴印在芯片

14、上特定位置。該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一固相合成一致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。致，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。 第51頁(yè)/共88頁(yè)4、點(diǎn)樣法、點(diǎn)樣法 點(diǎn)樣法是將合成好的探針、點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組或基因組DNA通過(guò)特定通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。以是寡核酸。 采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的采用人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即載玻片上，經(jīng)一定的化學(xué)方法

15、處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。芯片可置于緩沖液中保存。 用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過(guò)分區(qū)后用計(jì)算機(jī)控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量控制的微陣列點(diǎn)樣機(jī)按照預(yù)先設(shè)計(jì)順序點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為很小，約為5nl。大規(guī)模。大規(guī)模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)芯片的潛在優(yōu)越性是具有更強(qiáng)的親和勢(shì)和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類

16、和特異性雜交，但是需要大量制備，純化，量化，分類PCR產(chǎn)產(chǎn)物。物。 第52頁(yè)/共88頁(yè)第53頁(yè)/共88頁(yè)第54頁(yè)/共88頁(yè)第55頁(yè)/共88頁(yè)第56頁(yè)/共88頁(yè)第57頁(yè)/共88頁(yè)第58頁(yè)/共88頁(yè)2.2.基因芯片樣品制備基因芯片樣品制備 第59頁(yè)/共88頁(yè)第60頁(yè)/共88頁(yè)2 樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)樣本采集過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn) 氰代磷酸二乙酯氰代磷酸二乙酯(DEPC) 第61頁(yè)/共88頁(yè)離體新鮮組織，切成多個(gè)離體新鮮組織，切成多個(gè)1cm3小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、小塊，剔除結(jié)締組織和脂肪組織。胃、腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)，腫瘤組織應(yīng)將腸組織應(yīng)剪除外膜；肝、腎、脾應(yīng)剪除門部血管神經(jīng)

17、，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）。）。在在RNase生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。 用鋁箔包裹組織，或用用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織凍存管裝載組織(但最好統(tǒng)一采用鋁箔但最好統(tǒng)一采用鋁箔)。用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入用記號(hào)筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號(hào)，并貼上標(biāo)簽，迅速投入液氮冷卻。液氮冷卻。填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期、樣品處理填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號(hào)、取樣日期

18、、樣品處理情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織情況等將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個(gè)樣品袋只保存同樣的組織），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱），袋口留一根編號(hào)繩，繩上粘一張標(biāo)簽紙（標(biāo)簽上注明：樣品名稱、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐、編號(hào)、日期），迅速轉(zhuǎn)入便攜式液氮罐保留保留1-2張取材部位的病理切片。張取材部位的病理切片。第62頁(yè)/共88頁(yè)v 以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)以上步驟應(yīng)在冰上進(jìn)行且不超過(guò)15分鐘，超過(guò)時(shí)分鐘，超過(guò)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致樣品的間會(huì)導(dǎo)致樣品的RNA降解。降解。 v 對(duì)腫瘤組織的取材，要求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤對(duì)腫瘤組織的取材，要

19、求盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列和正常組織，例如對(duì)于手術(shù)切除的整個(gè)或部分前列腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行腺，可能要根據(jù)冰凍切片報(bào)告的結(jié)果來(lái)判定要進(jìn)行研究的取材部位。研究的取材部位。 第63頁(yè)/共88頁(yè)3.3.基因芯片雜交基因芯片雜交 第64頁(yè)/共88頁(yè)第65頁(yè)/共88頁(yè) 第66頁(yè)/共88頁(yè)第67頁(yè)/共88頁(yè)第68頁(yè)/共88頁(yè)第69頁(yè)/共88頁(yè)4.4.基因芯片檢測(cè)原理基因芯片檢測(cè)原理 第70頁(yè)/共88頁(yè)雜交信號(hào)的檢測(cè)是雜交信號(hào)的檢測(cè)是DNA芯片技術(shù)中的重要組成部分。芯片技術(shù)中的重要組成部分。由于由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)芯片

20、本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupled device camera，CCD)攝像機(jī)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。裝置。此外，大多數(shù)此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不

21、完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。應(yīng)也是非常重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。三個(gè)部分組成。第71頁(yè)/共88頁(yè)1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)第72頁(yè)/共88頁(yè)1熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法熒光標(biāo)記雜交信號(hào)的檢測(cè)方法（1）激光掃描熒光顯微鏡）激光掃描熒光顯微鏡 探測(cè)裝置比較典型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定探測(cè)裝置比較典

22、型。方法是將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，在計(jì)算機(jī)控制的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過(guò)物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為510m。同。同時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻時(shí)通過(guò)同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)算機(jī)控制傳動(dòng)平臺(tái)XY方向上步進(jìn)平移，

23、方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)芯片被逐點(diǎn)照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處照射，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成理，最后形成20m象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面研究。研究。 第73頁(yè)/共88頁(yè)第74頁(yè)/共88頁(yè)（3）采用了）采用了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡相機(jī)的熒光顯微鏡 這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微這

24、種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采用了增管，因而無(wú)須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采用了CCD相相機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)機(jī)，因而大大提高了獲取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。其特點(diǎn)是掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用 第75頁(yè)/共88頁(yè)（4）光纖傳感器）光纖傳感器 將將 DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖芯片直接做在光纖維束的

25、切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200m，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核，兩端均經(jīng)化學(xué)方法拋光清潔?；瘜W(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（過(guò)光纖維束傳導(dǎo)來(lái)自熒光顯微鏡的激光（4

26、90urn），激發(fā)熒），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。相機(jī)接收。 這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)這種方法快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有一定的應(yīng)用局限性。芯片，有一定的應(yīng)用局限性。 第76頁(yè)/共88頁(yè)2生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè)生物素標(biāo)記方法中的雜交信號(hào)探測(cè) 以生物素（以生物素（biotin）

27、標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都）標(biāo)記樣品的方法由來(lái)已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種到最初的雜交信號(hào)，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍類繁多，因而檢測(cè)方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜芯片雜交將受到很大的限制，

28、因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比交將受到很大的限制，因?yàn)樵谀猃埬ど蠠晒鈽?biāo)記信號(hào)信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。采用生物素標(biāo)記的。 目前應(yīng)用較多的是美國(guó)目前應(yīng)用較多的是美國(guó)General Scanning公司開發(fā)的基公司開發(fā)的基因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng)因芯片專用檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃，采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)

29、行分析。近期又開發(fā)出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。，其掃描精度和功能有較大的提高。第77頁(yè)/共88頁(yè)5.5.結(jié)果的分析結(jié)果的分析第78頁(yè)/共88頁(yè) 第79頁(yè)/共88頁(yè)為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，為了使結(jié)果的檢驗(yàn)更加簡(jiǎn)便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了的基因芯片的分析系統(tǒng)中采用了基基因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站因陣列掃描儀和專用的基因芯片工作站，對(duì)，對(duì)一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的一幅包含數(shù)萬(wàn)個(gè)探針位點(diǎn)的基因芯片圖樣的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的分析，僅需要數(shù)分鐘的時(shí)間。這樣在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成

30、用傳統(tǒng)方幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜法需要數(shù)月才能完成的幾萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)次雜交分析試驗(yàn)。交分析試驗(yàn)。 第80頁(yè)/共88頁(yè)第81頁(yè)/共88頁(yè). .結(jié)束語(yǔ)結(jié)束語(yǔ) 基因芯片作為生物芯片的代表，其發(fā)展目標(biāo)同生物芯片的基因芯片作為生物芯片的代表，其發(fā)展目標(biāo)同生物芯片的目標(biāo)一樣是目標(biāo)一樣是“芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室”(Lab-on-chip)，也即將整個(gè)生化檢，也即將整個(gè)生化檢測(cè)分析過(guò)程縮微到芯片上。測(cè)分析過(guò)程縮微到芯片上?！靶酒瑢?shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室”通過(guò)微細(xì)加工工通過(guò)微細(xì)加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等以實(shí)藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)和分析的全過(guò)程，而現(xiàn)對(duì)生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)和分析的全過(guò)程，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程趨于自動(dòng)化從而極大地縮短的檢測(cè)和分析時(shí)間，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程趨于自動(dòng)化從而極大地縮短的檢測(cè)和分析時(shí)間，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)材料，而且又降低人為主觀因素，大大提高實(shí)驗(yàn)節(jié)省了實(shí)驗(yàn)材料，而且又降低人為主觀因素，大大提高實(shí)驗(yàn)的客觀性。的客觀性。第82頁(yè)/共88頁(yè) 基因芯片技術(shù)發(fā)展到今天不過(guò)短短幾年時(shí)間，雖然還基因芯片技術(shù)發(fā)展到今天不過(guò)短短幾年時(shí)間，雖然還存在這樣或那樣的問(wèn)題，但其在基因表達(dá)譜分析、基因存在這樣或那樣的問(wèn)題，但其在基因表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣