a-淀粉酶高產(chǎn)菌株篩選實(shí)驗(yàn)

1、恥淀粉酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定及固定化枯草芽孑包桿菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是a-淀粉酶高產(chǎn)菌株之一，其菌落表面粗糙不透明，污白色或微 黃色，在液體培養(yǎng)基屮生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺嗓。需氧菌?？衫ǖ鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，在遺傳學(xué)研究屮 應(yīng)用廣泛。其芽抱0.60. 9x1.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孑包形成后菌體不膨 大。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。廣泛牛k在中性的的含淀粉多的 環(huán)境中，如富含淀粉的而粉廠(chǎng)、土壤等。淀粉酶是一種用途極為廣泛的生物催化劑，可應(yīng)用于而包制作業(yè)、淀粉的糖化和液化、紡織品脫漿、 造紙、清潔劑工業(yè)、化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的分析和制藥業(yè)等。淀粉酶家族

2、包括。-淀粉酶、3 -淀粉晦和衙 萄糖淀粉臨。a-淀粉酶為內(nèi)切酶，以無(wú)規(guī)則的方式切開(kāi)淀粉分子內(nèi)部的a - 1, 4糖肯鍵，而使淀粉牛 成糊精和低聚糖，是一種鈣離子依賴(lài)性酶。p-淀粉酶從非還原性末端順次切下麥芽糖，為外切酶。制 萄糖淀粉酶是一種作用于a - 1, 4糖昔鍵的外切酶，從非還原糖末端切下葡萄糖分子。a-淀粉酶是一種胞外酶，由于酶純化等操作往往導(dǎo)致酶活性和穩(wěn)定性都受影響，而利用細(xì)胞固定化 可以很好的解決這一問(wèn)題，其中q -淀粉酶的固定化交聯(lián)法是目前比較理想的方法。另可嘗試探索用一 定濃度的凝膠包埋枯草芽葩菌或用吸附法、交聯(lián)法將枯草芽抱桿菌固定化，使菌體不能流動(dòng)而酶對(duì)以存 在反應(yīng)液里。凝

3、膠柱底部對(duì)選用一定大小的半透膜使酶和淀粉不能流出反應(yīng)凝膠柱，而產(chǎn)物對(duì)以流出?！緦?shí)驗(yàn)一】一、a淀粉酶生產(chǎn)菌種的分離與培養(yǎng)、篩選二、【實(shí)驗(yàn)原理】大多數(shù)枯草芽抱桿菌好氧，最適生長(zhǎng)溫度為32°c,pi【為7.2,轉(zhuǎn)速為140r/min,接種量為9%,芽 泡率生長(zhǎng)最適溫度36°c,最適ph為7. 2,最適轉(zhuǎn)速120r/mino在以淀粉為碳源的固體培養(yǎng)基上用劃線(xiàn) 法分離純化出產(chǎn)a淀粉酶的菌株，根據(jù)是否町產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選。透明圈越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。三、【實(shí)驗(yàn)儀器和材料】1、試劑：0.1%呂氏（loeffler）美藍(lán)染液配制方法:a液：美藍(lán)（methylene blue,又名甲烯藍(lán)）0.3

4、 g, 95%乙醇30 ml；b 液：0.01% koh looml混合a液和b液即成，根據(jù)需要對(duì)配制成稀釋美藍(lán)液。2、淀粉酶篩選富集培養(yǎng)液（細(xì)菌）淀粉10 g、硫酸鍍10 g、氯化鈉5 g、硫酸亞鐵0.5 g、磷酸軾二鉀1 g、牛肉膏1 g,定容1 l,調(diào) 至pll為7,取300ml分裝9 ml于小試管中，高壓蒸汽滅菌于，115 °c, 20 min。3、淀粉酶篩選培養(yǎng)基i （細(xì)菌）淀粉3g、硫酸錢(qián)3g、氯化鈉1.5g,用無(wú)機(jī)酸堿調(diào)ph值至7.0左右，加蒸憎水定容至300 ml,再加 瓊脂5.4g,裝入三角瓶，塞上棉塞，用報(bào)紙包扎瓶口。高壓蒸汽滅菌，于115 °c, 20

5、 min,冷卻至50-55°c 左右時(shí)倒入無(wú)菌平皿。4、淀粉酶篩選培養(yǎng)基ii （細(xì)菌）淀粉10 g、硫酸鍍10 g.氯化鈉5 £、硫酸亞鐵0.5 磷酸氫二鉀1 g、牛肉膏1 g,定容1 l,調(diào) 至ph為7,再加18g瓊脂，取300ml分裝9 ml于小試管中，高壓蒸汽滅菌于，115 °c, 20 min。5、器材燒杯、玻璃棒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、吸管、移液槍、漏斗、瓷缸、接種環(huán)、刮鏟、載玻片、顯微鏡、酒精燈、高壓蒸汽滅菌鍋、載玻片、蓋玻片四、【實(shí)驗(yàn)步驟】1、富集培養(yǎng)（第1大丿：取標(biāo)本于90 ml無(wú)菌水，放置于搖床150 rpm,搖晃5 min,取出后 稍靜置。用無(wú)

6、菌槍頭吸収上清液lml接入9 ml的富集培養(yǎng)液中，同時(shí)做一個(gè)不接菌液的空白對(duì) 照管一起培養(yǎng)。置30°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2024小時(shí)（笫2, 3久9。2、觀(guān)察：用無(wú)菌操作法取少許菌液置于載玻片屮央的0.1%美藍(lán)染色液屮，混勻后加蓋玻片 制成水浸片，先用低倍鏡后換高倍鏡觀(guān)察菌的形態(tài)和出芽生殖情況?；罱湍妇墒姑浪{(lán)還原，從 而使菌體不著色，用此方法可判斷酵母菌的死活。（第2犬）水一碘液浸片的觀(guān)察：在載玻片中央加一小滴革蘭氏染色用碘液，然后在其上加3小滴 水，取少許酵母菌液放在水一碘液中混勻，蓋上蓋玻片。3、鏡檢：取少許富集的菌液觀(guān)察菌的形態(tài)。（第2q4、菌液稀釋?zhuān)河脽o(wú)菌槍頭吸取0.5 ml富集

7、菌液，加入裝有4.5 ml無(wú)菌水的試管中，吹吸兒 次，讓菌液混合均勻，稀釋成10"稀釋液。再用1ml無(wú)菌槍頭，吸取10“稀釋液0.5 ml,移入裝 有4.5 ml無(wú)菌水的試管中，吹吸混勻，即成io-?稀釋液。同樣做法再一次，做成10；稀釋液。5、倒平板培養(yǎng)a9：倒篩選培養(yǎng)皋i平板，凝固待川。川無(wú)菌槍頭分別吸取102、1（）-3 濃度的稀釋液0.1 ml于平板上，用涂布棒將菌液在平板上涂抹均勻。平放桌而30 min,使菌液 滲透入培養(yǎng)皋內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，置3（）32 °c再培養(yǎng)24 h或稍長(zhǎng)（過(guò)長(zhǎng)則霉菌長(zhǎng)出）（第3, 4 天丿。6、純化：從長(zhǎng)有單菌落的平板中選取典型的大的透

8、明圈菌落，用接種環(huán)挑取一環(huán)的菌，在 篩選培養(yǎng)基i平板中采用劃線(xiàn)分離法分離菌。并同時(shí)制片做純度檢查。若不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取該 菌落采用劃線(xiàn)分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。涂片鏡檢，菌落觀(guān)察。（笫4, 5大）7、菌種保藏：將分離的酵母菌轉(zhuǎn)接于篩選斜而培養(yǎng)基上培養(yǎng)（從第6步中的每個(gè)平板保藏 810株），待長(zhǎng)好后置于冰箱內(nèi)4 °c下保存。（第4, 5天）8、將保藏的菌株接種到篩選培養(yǎng)基ii平板屮，每個(gè)板接810株，培養(yǎng)1-2天后，選擇4-5 株高產(chǎn)菌株保藏備份并分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，進(jìn)行酶活測(cè)定。五、酚活測(cè)定方法（1）dns 法篩選出高晦活菌株。標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)設(shè)定40 c時(shí)在5 min內(nèi)水解淀粉釋放1 m

9、g麥芽糖所需的悔量為1個(gè) 酶活力單位（u）。計(jì)算酶活力的公式為：酶活力單位二c梅x sx刀。式中館為酶液中麥芽糖的濃度；煽為提取酶液的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)。利川麥芽糖梯度標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，用spss 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算冋歸方程，求出相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤注：dns法測(cè)還原糖-dns-二硝基水楊酸dns即二硝基水楊酸法是利用堿性條件下，二硝基水楊酸（dns）與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度范吊i內(nèi)顏色深淺與還原糖含量成 比例關(guān)系的原理，川比色法測(cè)定還原糖含量的。因其顯色的深淺只與糖類(lèi)游離出還原基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)，而對(duì)還原糖的種類(lèi)沒(méi)

10、有選擇性，故dns方法適合川衣多糖(如纖維索、半纖維索和淀粉等)水解產(chǎn)生的 多種還原糖體系中。dns法測(cè)還原糖- dns試劑的制備將6. 3克dns和262ml 2mol/l氫氧化鈉,加到500ml含有182克酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,再加上5 克重苯酚和5克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加水定容到1000ml,即制成3, 5-二硝基水楊酸試劑，貯于 棕色瓶中備用。dns法測(cè)還原糖-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(lmg/ml) 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25 ml試管中,分別準(zhǔn)確加入d ns試劑2ml,沸水浴加熱2min,流水冷卻，用水補(bǔ)足到15ml刻度。在54onm

11、波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。dns法測(cè)還原糖-樣品的測(cè)定樣品液適當(dāng)稀釋,使糖濃度為0. l-l.omg/ml,取稀釋后的糖液1.0ml于15ml刻度試管中,加dns試 劑2.0ml,沸水煮沸2min,冷卻后用水補(bǔ)足到15ml刻度,在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)査出 葡萄糖mg/inl數(shù)。求出樣品中糖含量。六、【注意事項(xiàng)】1、美蘭染色濃度和時(shí)間嚴(yán)格掌握；2、平板培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)則霉菌長(zhǎng)出。【實(shí)驗(yàn)二】二、菌株的鑒定一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)酵母菌的鑒定方法，熟悉使用分子牛物學(xué)手段進(jìn)行微牛物鑒定。二、【實(shí)驗(yàn)原理】微生物鑒定是科研及生產(chǎn)過(guò)程中非常重要的工作。可以通過(guò)菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化分析及分子

12、生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定。三、【實(shí)驗(yàn)儀器和材料】a、dna提取需要配置的試劑高鹽的te buffer配制5（） ml0.5 ml（lm 母液）0.01 ml（0.5m 母液）終濃度10 mm tris.cl, ph &o0mm edta, ph 8.0室溫可保存幾年ctab提取液終濃度配制200 ml2%（w/v） ctab100 nim tris.cl, ph&o4g20 ml（ 1 m 母液）20 mm edta, ph&o10.22 g1.4mnacl室溫可保存兒年loxctab/nacl 溶液（i0%ctab/0.7 m nacl）在80 ml h2o中溶解4.1 g

13、nacl,緩慢加入10 gctab,同時(shí)加熱并攪拌。如果需要,可加熱 至65°c溶解。定容至100 ml其它化學(xué)試劑：異內(nèi)醇、乙醇、液氮、taq酶、dntps、引物。b、儀器移液槍?zhuān)?0、100、1000）11） ,0.2 ml pcr 管，槍頭，2 ml eppendorf 管，飯盒。四、【實(shí)驗(yàn)步驟】1 形態(tài)學(xué)鑒定：（第7天）a. 菌落形態(tài)觀(guān)察按普通微牛物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)觀(guān)察所分離的細(xì)菌菌落特征。b. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察按普通微牛物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)簡(jiǎn)單制片法觀(guān)察，先低倍鏡，后高倍鏡觀(guān)察并繪制細(xì)胞形態(tài)圖。2.分子生物學(xué)鑒定：（1）菌體dna的提取（ctab法捉取真菌基因組dna）（第7,8天）1）取

14、少量酵母菌落連同部分培養(yǎng)基一起放入研缽屮，加入液氮粉碎，然后加入800 pl 2% 65°c保溫的2xctab抽提液，混勻，65°c保溫3060 min。2）加入800 pl的氯仿/異戊醇（24： 1）,輕緩顛倒混勻，1000（） r/min,離心5 min。3）取上清（約600 |11）,加入1/10體積（約60卩1）的65°c的ctab/nacl溶液,顛倒混勻。4）用等體積（約600111）的氯仿/異戊醇（24： 1）抽提,10000 r/min,離心5 min。5）取上清（約450卩1）,加入0.8 v的異丙醇沉淀核酸，顛倒混勻，（如沉淀可見(jiàn)，繼續(xù)做 下步，

15、否則，20°c保溫1020 min）。6）4°c, 12000 r/min,離心 10 min。7）去上清，用高鹽的te buffer重懸（約100卩1）?？?5°c保溫30 min,至大部分溶解）。8）加入0.8體積的異內(nèi)醇沉淀核酸，充分混勻（如沒(méi)有沉淀,-20°c保溫10-20 min）, 4°c, 12000 r/min,離心 15 min。9）去上淸，70%乙醇洗滌沉淀，干燥，用盡可能少的te buffer重懸（3060卩1）。（2）dna質(zhì)量檢測(cè)（第入帚心以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)棊因組dna人小及提取質(zhì)量;紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)dna純

16、度(將dna 稀釋50倍后分別測(cè)od26()和od280，并計(jì)算od26()/od28()的比值)。dna濃度計(jì)算：(3) pcr擴(kuò)增c第9天丿核糖體dna普遍存在于生物屮，真核生物的核糖體rna中包插26s、18s、5.8s和5s 4種不同沉降系數(shù)的核糖體rna片段，它們分別對(duì)應(yīng)的基因片段既具有遺傳上的相對(duì)穩(wěn)定性，同時(shí)由于各 種原因具有一定的突變，使它們作為-種良好的生物分類(lèi)鑒定材料得到廣泛的重視。早期一般選収大小 適中的18s序列作為鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，隨后26s的d1/d2區(qū)序列和its序列也被用于應(yīng)用于鑒定工作 中(圖1)。木實(shí)驗(yàn)使用its序列進(jìn)行鑒定，包括its1和its2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。p

17、cr反應(yīng)引物使用 its1(5'tccgtaggtgaacctgcgg3')和 its4 (5,-tcctccgcttattgatatgc-3, )o18s5.8s26s5swits1 its2tigsligs2圖1真核生物鐘編碼核糖體的序列(5i 3j 取一 pcr管，按卜述pcr體系加入pcr擴(kuò)增所需的試劑：ddh2o34.6 plloxpcr buffe(withoih mgcb)5 plmgcl2(25mm)4 pldntp(lomm)lpl5'prime" 1() mm)2 pl3'primer(l() mm)2 pltemplate (50

18、 -500 ng/pl)lpltaq dna polymerase(5u/gl)0.4 pltotal50 pl將上述加樣后的pcr管放到小離心機(jī)低速甩一下，放入pcr擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序按如 下設(shè)定：94°c預(yù)變性5 min94°c變性30 sec52°c退火30 sec40個(gè)循環(huán)l72°c延伸60 sec丿72°c延伸5 min4°c保溫(到達(dá)此溫度時(shí)停止pcr擴(kuò)增，將pcr管取出)(4) pcr擴(kuò)増檢測(cè)以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增是否有所想要的大小的目標(biāo)條帶，人概濃度如何。(5)測(cè)序?qū)⒎弦蟮臉悠?選5-6個(gè)

19、)，按公司測(cè)序訂單要求填寫(xiě)。(測(cè)序一般可以分為將pcr擴(kuò)展h標(biāo)dna連接到t載體上和直接利川pcr產(chǎn)物測(cè)序兩種方法，木方法采川直接利川pcr產(chǎn)物測(cè)序，需要自己捉供測(cè)序引物)(6)生物信息學(xué)分析方法演示(第10大丿使用軟件bioedit除去測(cè)序不口j靠部分及無(wú)用的部分，然后登陸n(yōu)cbi網(wǎng)站，進(jìn)行在線(xiàn)比対分析。五、【注意事項(xiàng)】1. pcr擴(kuò)增時(shí)pcr反應(yīng)緩沖液，特定公司的特種型號(hào)的taq酶會(huì)自帶自己所需的pcr反應(yīng) 緩沖液，不同的公司的產(chǎn)品（taqlw與pcr反應(yīng)緩沖液）z間一燉不可以混用；2. 觀(guān)察pcr反應(yīng)緩沖液是否包含mg?*,如杲包含，則不需要另加入；如杲不包含，則必須 加入。六、【思考題

20、】進(jìn)行微生物物種鑒定時(shí)為什么使川不同的鑒定方法綜合進(jìn)行鑒定？【實(shí)驗(yàn)三】誘變育種進(jìn)行誘變后，計(jì)算致死率，并進(jìn)行篩選，同時(shí)用原始菌株做產(chǎn)酶能力對(duì)照?！緦?shí)驗(yàn)四】四、淀粉酶的固定化技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮碡サ模簩W(xué)會(huì)交聯(lián)法制備固定化卿的操作技術(shù)內(nèi)容：制備固定化酶的方法很多，利用雙功能試劑或多功能試劑衣酶分子間，酶分子與惰性蛋白間, 或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法稱(chēng)為交聯(lián)法，本實(shí)驗(yàn)即采用這種方法。 交聯(lián)劑為戊二醸，載體為甲殼素。二、實(shí)驗(yàn)器材1. 恒溫水浴鍋2. 恒溫振搖儀三、實(shí)驗(yàn)試劑1. 5%戊二醛2. 甲殼素3. 碘原液：稱(chēng)取碘1.1g。碘化鉀2.2g, 于小燒杯中，加10ml蒸

21、鐳水使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶 中。再加少量的蒸徭水洗滌燒杯數(shù)次，洗滌液均轉(zhuǎn)入容量瓶屮，最后定容至50ml搖均后放于棕色試管 中備用。4比色稀碘液：取碘原液2ml,加碘化鉀20g,再用蒸館冰定容至5000ml。5. 2%淀粉溶液：稱(chēng)取2g可溶淀粉，放入小燒杯中，加少量熬徭水做成懸浮液。然后在攪拌卞注入 沸騰的蒸憎水中，繼續(xù)煮沸一分鐘，冷卻后加蒸憎水定容至100mlo6. ph6磷酸氫二鈉一一檸檬酸緩沖液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉(na2hpo4.12h2o) 45.23g,檸檬酸(ceh* o7.h2o) 8.07g,先在燒杯中使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至1000mlo7. 標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液,a液:精確

22、稱(chēng)取氯化鉆(coci.6h20) 40.2493g和重洛酸鉀(k2gro7) 0.48 78g,川熬館水定容至500ml.b液:：精確稱(chēng)取絡(luò)黑t40mg,用蒸謂水定容至100ml.同時(shí)取a液40ml、b液5ml、混合后置于冰箱中待用?；旌弦涸?5天內(nèi)使用有效。四、實(shí)驗(yàn)操作(一)酶液的制備精確稱(chēng)取a 淀粉酶2g,先用少量40°cph6的磷酸二氫鈉檸檬酸緩沖液溶解, 溶解過(guò)程屮輕輕川玻璃棒搗研。將上層液小心傾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少童上述緩沖液，如 此反復(fù)搗研34次。最后，將溶液與殘?jiān)恳迫肴萘科恐?，用緩沖液先定容搖勻后，通過(guò)四層紗布過(guò) 濾，溶液供測(cè)定使用。(二)固定化酶的制備1.稱(chēng)取50mg粉末甲殼素，加入5%戊二醛10ml,調(diào)節(jié)ph=8.5,攪拌均勻后，于25°c,恒溫振搖1小時(shí)。取出后，傾去戊二醛，然后以蒸徭水洗滌，傾去清夜,以除去多余的交聯(lián)劑。2.取前面制備的酶液10ml, 上述處理的卬殼素混合均勻，25°c,恒溫振搖1小