細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)

1、METHODS AND TECHNIQUES本章內(nèi)容提要 第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù) 第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù) 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交第一節(jié) 顯微技術(shù)光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡 1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機(jī)械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。Structure of MicroscopeLight Pathway of Micros

2、cope 3. 分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 光學(xué)顯微鏡的分辨力光學(xué)顯微鏡的分辨力 R=0.61/NA 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長； NA為鏡口率為鏡口率 sin/2； n=介質(zhì)折射率； =鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。表一、幾種介質(zhì)的折射率 顯微鏡的幾個光學(xué)特點：顯微鏡的幾個光學(xué)特點： 介質(zhì)折射率越接近鏡頭玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin /2的最大值小于1；鏡口率最大約1.6； 普通光線的波長為400700nm，光鏡分辨力約為0.2m，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特

3、點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）激光共聚焦掃描顯微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描； 能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)； 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍； 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。laser confocal scanning microscope, LCSM激光共聚焦掃

4、描顯微鏡光路圖（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，物體邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。（五）相差顯微鏡 把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。1. 環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。2. 相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。原理用途：

5、觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本。（六）偏光顯微鏡polarizing microscope 用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺可以旋轉(zhuǎn)。淀粉（七）微分干涉差顯微鏡 Differential interference contrast microscope （DIC） 1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強(qiáng)影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。（八）倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒

6、； 用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。 （九）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢 采用組合方式，集普通光鏡、相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體； 自動化與電子化。二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM1. 原理 以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比； 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成； 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍； 用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2m）。表二、不同光線的波長TEM L

7、IGHT PATHWAYTRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM2. 制樣技術(shù) 1）超薄切片）超薄切片 超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。2）負(fù)染技術(shù) 用重金屬鹽(如磷鎢酸) 染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右。Negative Stained Archaebacteria 3）冰凍蝕刻 freeze-etching亦稱冰凍斷

8、裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露斷面結(jié)構(gòu)。向斷面噴涂一層蒸汽鉑和碳。然后將組織溶掉，把鉑和碳的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。an onion root tip cell with no etching. 斷面的三種處理方法： 蝕刻（ etching ）、不蝕刻（no etching ）、深度蝕刻（deep etching ）培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 Clathrin衣被（二）掃描電子顯微鏡 20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)； 分辨力為610nm，因人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為

9、0.2mm/10nm=20000X。Scanning electron microscope（ SEM） 工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。SEM LIGHT PATHWAY人類紅細(xì)胞人類紅細(xì)胞酵母酵母人類精子人類精子（三）掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope，STM 原理：根據(jù)隧道效應(yīng)設(shè)計

10、，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向為0.10.2nm，縱向可達(dá)0.01nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。掃描隧道顯微鏡原理STM image of a DNA moleculeSchematic drawing of AFM三、顯微操作技術(shù)micromanipulation technique 是在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。 包括細(xì)胞核

11、移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。 細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，1952 年，Briggs和King等將不同階段的蛙胚細(xì)胞核注入去核的蛙卵，構(gòu)建核移植胚。Gordon（1962）證明原腸胚以后的細(xì)胞核移植能發(fā)育到成體。1997年，Wilmut等克隆了綿羊Dolly。 顯微操作儀顯微操作儀轉(zhuǎn)基因顯微操作過程 第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對某些細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。（一）固定（一）固定1. 物理固定：血膜空氣干燥、冷凍干燥。2. 化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定

12、，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。（二）顯示方法1.金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2.Schiff反應(yīng)：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。3.聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。4.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。5.茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。二、免疫細(xì)胞化學(xué) immunocytochemistry 是利用抗體同特定抗原專一結(jié)合的原理，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。 免疫熒光法

13、（immunofluorescent technique）：如異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody method）：如辣根過氧化物酶。三、放射自顯影術(shù) 用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。四

14、、分子雜交技術(shù) 具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。 （一）原位雜交（一）原位雜交（in situ hybridization）。）。 用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 （二）Southern雜交 是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過

15、放射自顯影，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。 將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。六、PCR 技術(shù) PCR即：polymerase chain reaction。 反應(yīng)體系：樣品DNA；引物（primer），約15-20個核苷酸；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus，最適作用溫度7580，短時間在95下不失活。緩沖體系和Mg2+。 反應(yīng)過程：變性：約90-95；復(fù)性：約60左右；延伸：70-75；重復(fù) “變性復(fù)性延伸” 過程20-30次循環(huán)。PCR原理第三節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)一、離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器及各種大分子基本手

16、段。 轉(zhuǎn)速1025kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89Kg者稱為超速離心機(jī)。 超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過500kg。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形

17、成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細(xì)胞無毒。1. 速度沉降 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。2.等密度沉降 isopycnic

18、sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、流式細(xì)胞術(shù) 用途：對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 原理：包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光

19、，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計（flow cytometer）。三、細(xì)胞電泳 原理：在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。 用途：檢測細(xì)胞生理狀態(tài)、分離不同種類的細(xì)胞。第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)（一）動物細(xì)胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合

20、（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層； 克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁生長，每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落，稱為克隆。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：即：培養(yǎng)來自動物機(jī)體的細(xì)胞群。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的容器中培養(yǎng)稱為傳代或傳代培養(yǎng)（passage），每代細(xì)胞分裂約3-6次。細(xì)胞系細(xì)胞系（cell line）：原代培養(yǎng)細(xì)胞成功傳代即為細(xì)胞系。細(xì)胞株細(xì)胞株（cell strain）：從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群。 克隆克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。表三、實驗室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP20骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物細(xì)胞培養(yǎng)1.外植