最全的G418篩選穩(wěn)定表達細胞系總結(jié)24頁

1、Protocal 1.G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。2.細胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細胞，制備成細胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時左右開始加藥。3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。4.加G418篩選: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。5.換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4

2、。6.確定最佳篩選濃度：在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細胞，而用下一個梯度的 G418的量在10天前就看不到活細胞了。假如是400ug/ml不能殺死細胞，而800ug/ml在第5天就把所有細胞都殺死了，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞 ，現(xiàn)在我告訴你

3、我測試過NIH3T3細胞對G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。通過預(yù)實驗確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細胞增長接近匯合時按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度增至5070匯合時；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選1014天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其

4、逐漸增大后；d 挑單克?。褐苽浼毎麘乙?，細胞計數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細胞到1個/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。e 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA，做RT-PCR檢測目的基因是否存在。常見問題：1.轉(zhuǎn)進去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細胞內(nèi)的？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進細胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細胞系。2.neo基因和目的基因是不是一定會整合在一起？整合是隨機發(fā)生的非同源性重組，

5、neo基因表達而目的基因不一定都表達，所以在篩選之后還要用RT-PCR的方法進一步鑒定。培養(yǎng)基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細胞生長因子。這個過程也是細胞同化培養(yǎng)基的過程。細胞越多則其同化作用越強，所以細胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長。在篩選后期，大批細胞死亡，不換液沒有死亡的細胞就會受到死亡細胞的影響，換液后殘留的少量細胞對培養(yǎng)基的同化作用不強，也不利于生長。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a 培養(yǎng)同源細胞至半?yún)R

6、合狀態(tài)時，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448小時后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：再經(jīng)直徑0.22um濾器過濾，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩eflying 1. G418篩選要做預(yù)試驗確定最佳濃度，將細胞稀釋至1000cell/mL，每孔100uL加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12個級別。培養(yǎng)10-14天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選

7、濃度的一半。. 我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的。 . 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。轉(zhuǎn)染后，每個細胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達有的多，有的少，外源蛋白表達少的細胞由于代謝負荷較小，所以生長較快，在生長若干代之后，表達少的細胞會形成優(yōu)勢，長期之后，表達最弱的細胞會由于競爭優(yōu)勢占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達越來越暗就是這個道理。所以，要進行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細胞，遺傳性狀盡量一致，也是對高表達細胞的保護。 操作用96孔板法，每代細胞長滿后

8、，大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細胞原代培養(yǎng)書中均有講述。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機的而且不是單拷貝的，這點我們做過FISH驗證過，表達量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對表達的影響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細胞應(yīng)該亮度一致，但實際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同一細胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細胞同一基因的數(shù)目也不會相同，這點可以用數(shù)學關(guān)于泊松分布的觀點理解。有時，neo表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。

9、2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細胞內(nèi)隨機含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋，抓100個紅球，再抓100個黃球，然后以從中抓若干個，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。我們用neo，實際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個紅球，另一次抓著10個紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因為二者出現(xiàn)的概率比是恒定的。3. 維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持?？梢栽俚托荒軟]有?；蛘吒粢欢〞r間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際上我們在篩選耐藥株呀。4. neo的產(chǎn)物是酶，過高的G418濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細胞也要被毒死的，而此時過多的酶要求會對細胞代謝造成太大負擔，細胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細胞，在不同濃度的G418液中生長速度也不同，嚴重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理會，有的細胞受影響，還有的細胞不受