探討酶解法提取蕎麥皮中活性物質(zhì)

1、.探討酶解法提取蕎麥皮中活性物質(zhì)1引言苦蕎,學(xué)名稱韃靼蕎麥,是我國(guó)特有的一種土生植物,具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，即使是惡劣的氣候條件，也能頑強(qiáng)生存?？嗍w麥生長(zhǎng)在環(huán)境原始的高山寒冷地區(qū),含有豐富的全面的氨基酸、油酸、亞油酸及多種維生素和活性物質(zhì)等?？嗍w麥?zhǔn)撬幬镒饔幂^強(qiáng)的植物,蕎麥面具有殺腸道病菌、消積化痰、解除病毒的功效。苦蕎富含比其他谷物高的生物類黃酮物質(zhì),是優(yōu)質(zhì)的保健食品來(lái)源之一。蘆丁是黃酮類活性物質(zhì)的主要成分之一,現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)表明,苦蕎麥及其制品可以幫助擴(kuò)張冠狀血管和降低血管脆性、降血糖、增強(qiáng)人體免疫功能,同時(shí)，在降低膽固醇及血脂方面有較好的效果,這與其含有黃酮類物質(zhì)蘆丁有很大的關(guān)系。對(duì)苦蕎

2、麥中各部分黃酮得率進(jìn)行深入研究,為苦蕎麥資源的開(kāi)發(fā)和保健食品的發(fā)展打了根基,也為評(píng)價(jià)苦蕎麥各部分的功效價(jià)值提供了有效依據(jù)。近年來(lái)，伴隨具各種生物活性的短肽的開(kāi)發(fā)和研究，其研究和價(jià)值日益受到各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注。大量科學(xué)研究顯示通過(guò)選擇合適的蛋白酶，水解的蛋白質(zhì)可以得到大量的具有有益生物活性功能的生物活性肽?？嗍w麥活性肽是苦蕎麥皮粉經(jīng)蛋白酶水解后產(chǎn)生的多肽和氨基酸的混合物質(zhì)，在人體消化吸收方面有著更加令人滿意的效果。近年國(guó)內(nèi)外科研人員不斷發(fā)現(xiàn)由苦蕎麥粉水解制得的水解產(chǎn)物具有降低血液膽固醇、降血壓、抑制有害物的吸收、抑制乳腺癌和大腸癌的發(fā)生、抑制脂肪蓄積、抑制膽結(jié)石的形成、抗氧化以及抗衰老等功能2。因

3、此，人們對(duì)苦蕎麥研究和開(kāi)發(fā)的不斷深入，它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能會(huì)引起人們的關(guān)注，也會(huì)不斷提升對(duì)苦蕎麥活性物質(zhì)的科學(xué)技術(shù)和鉆研水平。1.1生物活性肽的概述肽(peptides)是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物,是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能片段,也正是因?yàn)樗?，蛋白質(zhì)才會(huì)給人類帶來(lái)數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的生理功能。肽本身也具有很強(qiáng)的生物活性。氨基酸為肽的基本構(gòu)成單位,由2個(gè)或3個(gè)氨基酸脫水縮合而成的肽分別叫二肽和三肽,以此類推為四肽、五肽。一般說(shuō)來(lái),肽鏈上氨基酸數(shù)目在10個(gè)以內(nèi)的叫寡肽,1050個(gè)的叫多肽,50個(gè)以上的叫蛋白質(zhì)。人們習(xí)慣上也把寡肽中的二、三肽稱為小肽。因?yàn)闃?gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)目與排列順序的不

4、同,所以肽具有了紛繁復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能。生物活性肽(biologicallyactivepeptide/bioactivepeptide/biopeptide)是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益4或具有生理作用的肽類化合物,又稱功能肽(functionalpeptide)。肽是由氨基酸組成,人體擁有20種氨基酸,由于不同的氨基酸的種類排列,以及數(shù)量排列，還可能有二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu),通過(guò)這種方式排列出來(lái)的肽，其類別龐大而復(fù)雜。每一種活性肽都是由其獨(dú)特方式的組成,不同活性肽的組成結(jié)構(gòu)決定了其具有復(fù)雜多樣的功能。此外活性肽在生物體內(nèi)的含量也很微量,但卻顯示了其卓越的生理活性。據(jù)報(bào)道,有些多肽在10-7mol/L

5、的濃度時(shí)，仍顯示了其顯著的生理活性,簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，1mL的多肽用60倍水稀釋后,仍然可以發(fā)揮他的生理功能。而且生物體可以參考自身生理狀態(tài)的情況下來(lái)合成或者降解其活性肽,因此,可以依據(jù)自身情況調(diào)節(jié)狀態(tài)的活性肽的半衰期均很短。1975年Hughes等首先報(bào)道從動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)了具有類嗎啡活性的小肽;1979年Brantl等從酶解的酪蛋白水解產(chǎn)物中分離到1個(gè)七肽物質(zhì)(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile),為-酪蛋白的第6066氨基酸殘基片段,具有阿片活性。阿片樣肽(opioidpeptide)顯示出類阿片受體配體活性,擁有激素和神經(jīng)遞質(zhì)與體內(nèi)的受體相互作用,具有鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)人體情緒、呼吸

6、、脈搏、體溫的功能。內(nèi)源性阿片肽有腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽、孤啡肽。目前已經(jīng)從小麥谷蛋白和大米蛋白中分離出了外源性阿片樣肽。它們與普通鎮(zhèn)痛劑的不同，經(jīng)過(guò)消化道進(jìn)入人體后沒(méi)有任何副作用,也不會(huì)讓人成癮,這一方面已經(jīng)上升為藥理學(xué)、功能食品學(xué)研究的熱點(diǎn)。至今，學(xué)者們已經(jīng)從動(dòng)、植物和微生物中分離提取出了眾多紛繁復(fù)雜的生物活性肽。生物活性肽的結(jié)構(gòu)有簡(jiǎn)單的二肽，也有較大分子的多肽(數(shù)百個(gè)氨基酸)。生物活性肽的生物學(xué)意義在于兩個(gè)方面，一是其吸收機(jī)制優(yōu)于氨基酸，二是具有氨基酸不可比擬的生理功能,其生理功能主要體現(xiàn)為有類嗎啡樣活性、激素和調(diào)節(jié)激素的功能,對(duì)生物體內(nèi)的酶具有調(diào)節(jié)和抑制作用,免疫調(diào)節(jié),抗血栓,抗高血壓

7、,降低膽固醇,抑制細(xì)菌、病毒滋生,抗癌,抗氧化和清除自由基等作用,促進(jìn)元素吸收和礦物質(zhì)運(yùn)輸,調(diào)節(jié)生長(zhǎng),改善食品風(fēng)味、口味和硬度等。因此,生物活性肽是篩選藥物、制備疫苗、食品添加劑和功能性因子的天然資源寶庫(kù)。1.2生物活性肽的研究歷史所有的生物，從最簡(jiǎn)單的病毒直到復(fù)雜生物人類，體內(nèi)龐大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，本質(zhì)上都由相同的20種氨基酸組成，也就構(gòu)成了千姿百態(tài)的蛋白質(zhì)世界。生物學(xué)家等在對(duì)蛋白質(zhì)的深入研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)一類由氨基酸構(gòu)成但又不同于蛋白質(zhì)的中間物質(zhì)，這類具有蛋白質(zhì)特性的物質(zhì)被稱作多肽。肽是比蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單、分子量小,由氨基酸通過(guò)肽鍵相連的一類化合物。多肽可以調(diào)理機(jī)體生理功能、為機(jī)體運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)，它幾乎影響

8、著人體的一切代謝合成。含有的氨基酸少于10個(gè)的肽稱為寡肽，超過(guò)的就稱為多肽；氨基酸為50多個(gè)以上的肽就成為人們熟悉的蛋白質(zhì)。1902年，倫敦大學(xué)醫(yī)學(xué)院的兩位生理學(xué)家Bayliss和Starling在動(dòng)物胃腸里發(fā)現(xiàn)了胰泌素，一種能刺激胰液分泌的物質(zhì)。這是人類第一次發(fā)現(xiàn)的多肽物質(zhì)。由于這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)創(chuàng)了多肽在內(nèi)分泌學(xué)中的功能性研究，具有深刻的意義，諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)授予他們諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。1931年，一種命名為P物質(zhì)的多肽被發(fā)現(xiàn)，它具有興奮平滑肌并能舒張血管而降低血壓的作用?？茖W(xué)家們自此開(kāi)始關(guān)注多肽類物質(zhì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，并把這類物質(zhì)命名為神經(jīng)肽。1953年，由Vigneand領(lǐng)導(dǎo)的生化小組第一次成功合成

9、了生物活性肽催產(chǎn)素。從此，整個(gè)50年代的多肽研究，都集中于腦垂體所分泌的多種多肽激素。1952年，生物化學(xué)家StanleyCohen在將肉瘤植入小鼠胚胎的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了小鼠交感神經(jīng)纖維生長(zhǎng)加快、神經(jīng)節(jié)明顯增大這一問(wèn)題。8年后到了1960年，我們才知道這是因?yàn)橐环N多肽發(fā)揮的作用，并將之稱為神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）。50年代末，Merrifield研究出了多肽固相合成的方法，因此被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。60年代初期，多肽的研究得到了迅猛的發(fā)展，多肽的結(jié)構(gòu)分析、生理功能等都得到了很多理論和實(shí)踐成效6。1965年，我國(guó)科學(xué)家成功地合成了牛結(jié)晶胰島素，這在世界范圍里第一次人工合成多肽類生物活性物質(zhì)。70年代，

10、神經(jīng)肽的研究被推向了頂峰，腦啡肽及阿片樣肽相繼被公布，科學(xué)界進(jìn)入了多肽影響生物胚胎發(fā)育的研究階段。1975年Hughes和Kosterlitz從人和動(dòng)物的神經(jīng)組織中提取出內(nèi)源性活性肽，增加了生物制藥內(nèi)容，拓展了“細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子”這一生物制藥領(lǐng)域。這一時(shí)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子有100種,比臨床應(yīng)用的多肽激素和其他活性多肽的總和還要多很多。90年代，人類基因組計(jì)劃開(kāi)始全面啟動(dòng)。隨著科學(xué)家們解開(kāi)一個(gè)個(gè)基因的原理，多肽研究及其應(yīng)用呈現(xiàn)空前繁榮的局面。肽是組成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)片段，蛋白質(zhì)發(fā)揮作用也是依靠他所具有的活性基因部分。實(shí)際上動(dòng)物體內(nèi)的功能性蛋白質(zhì)多數(shù)只是活性功能物質(zhì)的載體，它們所具有的的功能多數(shù)只

11、是由掛在其上的肽段來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)多肽這一中介，既能夠深入研究蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，又能為改善和組成新功能的蛋白質(zhì)補(bǔ)充新的基礎(chǔ)資源。同時(shí)，幾乎所有細(xì)胞都由多肽調(diào)節(jié)，它包括激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等各個(gè)領(lǐng)域，在生命活動(dòng)中，很多功能性生理作用如細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變、免疫調(diào)節(jié)等，均與活性多肽息息相關(guān)。伴隨現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展以及生命科學(xué)歷程的演進(jìn)，多肽在生物體內(nèi)的生理功能被越來(lái)越多的人熟知，尤其是許多活性肽生理功能和結(jié)構(gòu)的推進(jìn)，更是增進(jìn)了科學(xué)界對(duì)活性肽的重視和開(kāi)發(fā)。1.3生物活性肽的生理功能1.3.1免疫活性Jolles等在酪蛋白的降解物中分離提取出了免疫活性肽,他能激發(fā)巨噬細(xì)胞的吞噬功能

12、。Berthou等對(duì)人乳酪蛋白的消化物進(jìn)行研究，并提取得到六肽和三肽,并證明它能借助鼠巨噬細(xì)胞激活綿羊紅血細(xì)胞的吞噬功能。提供免疫活性肽的食物源有大豆蛋白。這些免疫活性肽常常與腸粘膜結(jié)合淋巴組織形成戰(zhàn)略伙伴,而且通過(guò)自由滲透腸壁而直接與外周淋巴細(xì)胞發(fā)生作用。胸腺肽可以化身免疫因子，寄身于載體上應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，已經(jīng)取得獲得可喜成果。1.3.2抗氧化作用抗氧化肽存在于動(dòng)物肌肉中的肌肽,可在體外抑制被鐵、血紅蛋白、脂質(zhì)氧化酶和單態(tài)氧催化的脂質(zhì)氧化作用3。某些肽和蛋白水解物承擔(dān)著重金屬清道夫作用和過(guò)氧化氫分解促進(jìn)劑的作用,因而可降低自氧化速率和減少脂肪過(guò)氧化氫含量。抗氧化活性肽被添加到肉制品中，可以有效防

13、止氧化型脂肪酸敗,扮演者防腐劑的角色，在食品和動(dòng)物飼料中有無(wú)限的應(yīng)用潛力。1.3.3抗高血壓活性抗高血壓肽主要是通過(guò)抑制血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶,進(jìn)而影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)血壓影響的。一般我們覺(jué)得,維持高活性必須有抗高血壓肽的C末端的Pro、Phe和Tyr或序列中含有的疏水氨基酸。對(duì)二肽來(lái)說(shuō),最有效的方法是結(jié)合N未端的芳香氨基酸與血管緊張素。已知的抗高血壓肽大致上有4種來(lái)源:如乳蛋白的肽類;來(lái)自酸乳的肽類;來(lái)自魚(yú)貝類(沙丁魚(yú)、金槍魚(yú))的肽類;來(lái)自植物的肽類(玉米醇溶蛋白、無(wú)花果)等。1.3.4降膽固醇作用研究發(fā)現(xiàn),大豆多肽可以帶來(lái)降低血清膽固醇的作用5,與大豆蛋白相比存在特殊的優(yōu)點(diǎn)

14、。對(duì)于膽固醇值正常的人,沒(méi)有降低膽固醇的作用,而對(duì)于膽固醇值高的人具有降低膽固醇的作用;對(duì)膽固醇值正常的人,食用高膽固醇含量的食品時(shí),有預(yù)防血清膽固醇值升高的作用;使膽固醇中LDL、VLDL值降低,但不會(huì)使HDL值降低。大豆多肽主要是通過(guò)刺激甲狀腺激素分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)降膽固醇作用,促進(jìn)膽固醇的膽汁酸化,使糞便排泄膽固醇增加,從而降低血液膽固醇。1.3.5促生長(zhǎng)作用促生長(zhǎng)肽能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化,如大豆蛋白的酶解物可刺激細(xì)菌的生長(zhǎng),特別是乳酸菌族的生長(zhǎng);從雞蛋中提取的肽能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和DNA的合成;動(dòng)物循環(huán)中存在外源組織蛋白合成促進(jìn)肽。1.3.6抗血栓作用研究人員從北美水蛭中發(fā)現(xiàn)一種由39個(gè)氨基酸殘基

15、組成的肽,可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制纖維蛋白原與血小板表面的受體(GPb)與a結(jié)合,從而具有抗血小板聚集的功能和阻斷血栓的最終生成。Jolles等發(fā)現(xiàn),源于牛-酪蛋白的CasoplatelinC11肽可抑制腺苷酸二磷酸誘導(dǎo)的血小板凝集及其與纖維蛋白原結(jié)合的作用?？寡牡陌l(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用將為血栓類疾病的預(yù)防和治療提供了新的手段。1.3.7抑制腫瘤轉(zhuǎn)移某些小肽(如Arg-Gly-Asp、Leu-Asp-Val、Tyr-Ile-Sly-Ser-Arg)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用,人工合成含有這些氨基酸序列的外源性生物活性肽可以與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、纖維蛋白競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞和血小板表面的整合素等分子,干擾腫瘤細(xì)胞-

16、ECM的相互作用,抑制血小板瘤栓形成及腫瘤血管生成,達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。1.3.8抗衰老作用張政等采用堿抽提和等電點(diǎn)沉淀法從苦蕎麥皮籽粒中制備出蕎麥蛋白復(fù)合物，用20%苦蕎麥蛋白復(fù)合物飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血液和臟器中的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化酶和谷胱苷肽過(guò)氧化物酶活性均有不同程度的提高，脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛含量下降，表明苦蕎麥蛋白復(fù)合物對(duì)生物體有一定的營(yíng)養(yǎng)和抗衰老作用7。1.4苦蕎麥活性物質(zhì)的研究目的與前景1.4.1苦蕎麥活性物質(zhì)的研究目的蕎麥作為健康食品資源，正在被人們?cè)絹?lái)越熟悉和接受，并在世界范圍內(nèi)流行開(kāi)來(lái)8，主要原因在于蕎麥內(nèi)含高生物價(jià)的蛋白質(zhì)和豐富的生物活性物質(zhì)。近幾年的研究表明，多

17、酚類化合物是蕎麥中最重要的營(yíng)養(yǎng)保健功能因子。蘆丁作為主要的黃酮類化合物22，報(bào)道最多。具有強(qiáng)化毛細(xì)血管，降血壓，預(yù)防腦中風(fēng)等生理功能。本試驗(yàn)旨在盡可能得到用堿性蛋白酶的水解下得到高含量的活性物質(zhì)，找到最適合的水解條件，為苦蕎麥的進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)方法與基礎(chǔ)。1.4.2苦蕎麥活性物質(zhì)的研究前景苦蕎麥活性肽的研究極具實(shí)際意義18：苦蕎麥作為一種經(jīng)濟(jì)作物來(lái)源豐富、價(jià)格低廉，可滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求；自原始社會(huì)以來(lái)，人們就有食用蕎麥制品的習(xí)慣，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)蕎麥活性肽易為人們所接受；苦蕎麥活性肽產(chǎn)品安全健康，可靠養(yǎng)生，可以作為日常保健食品每天食用；開(kāi)發(fā)具有抗氧化性的苦蕎麥活性肽可以大幅度提高蕎麥制品的附加值，

18、拓寬蕎麥的用途；值得注意的是，目前苦蕎麥的研究大多是以有機(jī)溶劑抽提為基礎(chǔ)的，由苦蕎麥粉經(jīng)酶水解制得的活性物質(zhì)的研究還極少有報(bào)道。因此開(kāi)發(fā)利用苦蕎麥蛋白質(zhì)的生物功能，多渠道、多方位地開(kāi)辟蕎麥?zhǔn)袌?chǎng)，研究開(kāi)發(fā)苦蕎麥活性物質(zhì)必將具有廣闊的前景。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)材料、化學(xué)試劑與儀器2.1.1實(shí)驗(yàn)材料蕎麥皮粉：取產(chǎn)自陜西的苦蕎麥皮磨成粉并過(guò)60目篩；經(jīng)半微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量為2.39%。堿性水解蛋白酶（Alcalase）：購(gòu)自諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司2.1.2主要儀器名稱型號(hào)產(chǎn)地1)紫外分光光度計(jì)UV-1601日本島津公司2)電子天平AE-200上海梅特勒-托利多儀器有限公司3)電熱恒溫

19、水浴鍋DK-S12上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司4)離心沉淀機(jī)80-2上海手術(shù)器械廠5）電爐6）半微量凱氏定氮儀一套7）25ml酸式滴定管（附滴定臺(tái)）2.1.3化學(xué)試劑氫氧化鈉、檸檬酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、碳酸鈉、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、L-酪氨酸（Tyr）、Folin-酚（以上所用試劑均為分析純）。2.2酶解法提取蕎麥皮中的生物活性肽2.2.1酶解步驟蕎麥皮粉溶解熱變性處理(80恒溫水浴，30min)1mol/LNaOH調(diào)pH約11酶解滅酶(沸水浴10min)1mol/L檸檬酸調(diào)pH至4.5離心(3000rpm/25min)取上清液(提取液)2.2.2酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在探

20、索試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上得到適合堿性水解蛋白酶酶解反應(yīng)的相關(guān)參數(shù)，然后在此基礎(chǔ)上對(duì)苦蕎麥皮粉酶解反應(yīng)的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素分別是水解溫度(A)、酶量g(B)和反應(yīng)時(shí)間h(C)為條件，進(jìn)行黃酮含量的三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)10。詳見(jiàn)表1。2.3蛋白酶酶活測(cè)定酶活力單位定義為在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸的酶量定義為一個(gè)酶活單位。2.3.1Tyr標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取預(yù)先于105干燥至恒重的L-酪氨酸(Tyr)0.0lg，精確至0.00lg，用0.5mol/L的鹽酸溶解后定容至l00mL，即為100g/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后配置成0、20、40、60、80、100g/mL(須做

21、平行試驗(yàn))，向各試管依次中加入標(biāo)準(zhǔn)Tyr溶液、蒸餾水、碳酸鈉溶液、Folin-酚試劑(詳見(jiàn)表2)，迅速混勻后置予40水浴中顯色15min，取出冷卻至室溫，在波長(zhǎng)680nmI處用分光光度計(jì)分別測(cè)定其吸光度，其中不含酪氨酸的管為空白對(duì)照。2.3.2蛋白酶酶活測(cè)定精確稱取待測(cè)堿性水解蛋白酶1.0g(樣品需做3支平行試管)，用0.02mol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.5)稀釋2000倍。取lmL分別置于試管中(同時(shí)做空白對(duì)照，空白管立即加入10的三氯乙酸溶液3.0mL充分混勻)。另三管加入經(jīng)37預(yù)熱的pH7.8的1酪蛋白溶液2.0mL，混勻，連同空白管迅速放入37的恒溫水浴鍋中，用秒表

22、準(zhǔn)確計(jì)時(shí)精確反應(yīng)15min，立即向三個(gè)樣品管加入10三氯乙酸溶液3.0mL，充分混勻；同時(shí)向空白管加入1的酪蛋白溶液2.0mL搖勻，然后將四管繼續(xù)在40水浴中保溫15min。最后通過(guò)離心除去來(lái)被水解的酪蛋白和酶蛋白，上清液分別取lmL放入三支干燥試管中。加入0.55mol/L碳酸鈉溶液5.00mL，其余同標(biāo)準(zhǔn)曲線。在680nm波長(zhǎng)比色測(cè)定12。2.3.3蛋白酶酶活的計(jì)算酶活力=A/(t×W)×K×V×N式中K：A=1.00時(shí)所需的酪氨酸的重量本實(shí)驗(yàn)K=168.78；W：酶的重量(w=1.0g，精確到0.001g)；V：水解酪蛋白混合物體積(v=6.0mL

23、)；t：時(shí)間(t=15min)；2.4苦蕎麥皮中生物活性肽提取率的測(cè)定(以蛋白質(zhì)含量記，半微量凱氏定氮法)2.4.1.蛋白質(zhì)含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)原理樣品與濃硫酸共熱時(shí)，有機(jī)物被破壞，其中的碳和氫被氧化成二氧化碳和水逸出，而氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘痹倥c硫酸結(jié)合成硫酸銨留在消化液中。硫酸銨用氫氧化鈉中和生成氫氧化銨，加熱又分解成氨，經(jīng)硼酸吸收后用標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸液的消耗量計(jì)算總氮量，再乘以換算系數(shù)，即蛋白質(zhì)含量。其反應(yīng)式如下：H2SO4=SO2+H2O+O2CH3CHNH3COOH+12O6CO2+4H2O+2NH32NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NAOH=2NH3+NA2SO4

24、+2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCL+5H2O2NH4CL+4H3BO32.4.2苦蕎麥皮酶解液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定步驟吸取同一實(shí)驗(yàn)條件下的三組平行實(shí)驗(yàn)酶解液各5mL，于同一干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸銅，8g硫酸鉀及25mL硫酸，搖勻后先進(jìn)行樣品消化，待樣品消化完成后，進(jìn)行凱氏定氮，做三次平行測(cè)定。按同一方法作試劑空白試驗(yàn)。2.4.3結(jié)果計(jì)算公式蛋白質(zhì)含量的計(jì)算公式X=(V1-V2)×C×0.014×F×100/m×（10/100）式中：X-樣品中蛋白質(zhì)的含量，%；V1-樣

25、品中消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，%；V2-試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，%；C-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；0.014-1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液1mL相當(dāng)于氮的g數(shù)；F-蕎麥皮為5.83；m-樣品的質(zhì)量，g或mL；2.4.4苦蕎麥皮總蛋白質(zhì)的含量測(cè)定稱取固體樣品2g于干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸銅，8g硫酸鉀及25mL硫酸，搖勻后先進(jìn)行樣品消化，待樣品消化完成后，進(jìn)行凱氏定氮。2.4.5苦蕎麥皮抗氧化活性肽提取率的結(jié)果計(jì)算提取率（%）=苦蕎麥皮提取液中總蛋白/苦蕎麥皮總蛋白×100%2.5蕎麥皮中黃酮得率的測(cè)定2.5.1黃酮得率測(cè)定的實(shí)驗(yàn)原理在黃酮類化合物的紫外光譜圖上主要有

26、兩個(gè)吸收帶:環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶(300550nm)和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸收帶(240280nm)。若加入鋁鹽,則鋁離子與黃酮化合物形成穩(wěn)定的配合物,帶會(huì)明顯向長(zhǎng)波方向移動(dòng)(紅移)，在NaNO2的強(qiáng)堿性溶液中,其在510nm處吸光度值最大,從而為分光光度法測(cè)定提供了可靠的依據(jù)。黃酮13含量單位定義為在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，每克苦蕎麥皮中所含的黃酮的毫克數(shù)。2.5.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制14準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，搖勻得濃度為0.3000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL置于0#

27、、1#、2#、3#、4#、5#、6#25mL容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充至12.5mL，分別加0.7mL5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置5min后分別加入0.7mL10%硝酸鋁搖勻，6min后分別加入5mL1mol/L氫氧化鈉搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10min后于510nm處比色測(cè)定，0#作參比得黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.0104C+0.0062R2=0.9999A-吸光度C-ug/mL即C=95.853A-0.5905R2=0.99992.5.3分光光度法測(cè)定黃酮吸光度取0.5mL樣品于25mL容量瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充至12.

28、5mL，加入0.7mL亞硝酸鈉搖勻靜置5min，加入0.7mL硝酸鋁搖勻靜置6min，加氫氧化鈉5mL,30%乙醇定容至25mL.10min后測(cè)定其在510nm下比色測(cè)定，用無(wú)樣品的同樣的混合液作空白參比，測(cè)定吸光度A15-17。2.5.4黃酮得率計(jì)算苦蕎麥皮中黃酮得率（%）為C*25/0.5*100mL*10-6g/10g式中：C為由測(cè)定出的吸光度值根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線算出黃銅濃度單位ug/mL3.結(jié)果與討論3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3.1.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別配制酪氨酸系列濃度20µg/mL、40µg/mL、60µg/mL、80µg/mL、100µ

29、;g/mL，測(cè)量其對(duì)應(yīng)的吸光度值結(jié)果如表2。表2酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table2tyrosinestandardcurvedrawing濃度C（µg/mL）20406080100吸光度A0.1220.2410.3580.4770.594標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0059x+0.0044R2=1.0000。3.1.2蛋白酶酶活測(cè)定采用Folin-酚法測(cè)定堿性水解蛋白酶的平均吸光度值為0.124，代入計(jì)算公式，測(cè)得堿性水解蛋白酶的酶活為1.6743×104（U/g）。3.1.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，搖勻得濃度為

30、0.3000mg/mL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。分別系列的蘆丁溶液，測(cè)量其對(duì)應(yīng)的吸光度值，結(jié)果如表3。表3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制Table.3Therutinstandardcurvedrawn蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（mL）01.02.04.06.08.0吸光度（A）空白0.1350.2590.5080.7601.0043.2苦蕎麥皮酶解提取活性肽和黃酮的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析按2.2.2苦蕎麥皮酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)其活性肽提取率()進(jìn)行測(cè)定，如表四所示。表4蕎麥酶解反應(yīng)的正交試驗(yàn)結(jié)果Table.4Buckwheatenzymaticreactionoforthogonaltestresults樣品號(hào)因素活性

31、肽提取率(%)黃酮得率(%)ABC111142.20±1.283.40±0.01212230.50±5.442.69±0.01313338.86±1.283.43±0.00421236.36±0.663.51±0.04522333.84±0.263.16±0.04623133.44±5.023.12±0.15731328.42±2.042.84±0.10832133.44±1.383.24±0.14933245.96±3.183.40±0.01從表4中可以看出，10g苦蕎麥皮粉用堿性蛋白酶水解提取黃酮，黃酮的得率為3.00%左右，根據(jù)文獻(xiàn)，10g苦蕎麥皮粉用乙醇抽提所得的最高黃酮得率為1.80%，可見(jiàn)，苦蕎麥皮中的黃酮用堿性蛋白酶酶解提取要比用乙醇抽提效果好，堿性酶酶解提取黃酮切實(shí)可行。為了了解各因素對(duì)活性肽提取率和黃酮得率()，本文做了極差分析，如表五