PCR技術(shù)的過程和意義

1、PC限術(shù)的過程和意義一、PCRfc術(shù)的根本原理類似于DNA勺天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核昔 酸引物。PCR1一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA引物和4種脫氧核甘酸存在 的條件下，依賴于DNAK合酶的酶促合反響，將待擴(kuò)增的DNAt段與其兩側(cè)互補(bǔ) 的寡核甘酸鏈引物經(jīng)高溫變性一一低溫退火一一引物延伸三步反響的屢次循 環(huán)，使DN*段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特 定基因片段。在環(huán)境檢測(cè)中，靶核酸序列往往存在于一個(gè)復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中， 且含量很低，對(duì)于探測(cè)這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個(gè)基因，雜交就顯得不敏感。使用PC曲術(shù)可將靶序列放大幾個(gè)數(shù)量

2、級(jí)，再用探針雜交探測(cè)對(duì)被擴(kuò)增序 列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。二、PC淑術(shù)的步驟PCRtt變性-退火-延伸三個(gè)根本反響步驟構(gòu)成： 1、模板DNAB變性模板DNAS加熱至93c左右一定時(shí)間后，使模板 DNAK鏈或經(jīng)PCFT增形 成的雙鏈DNA單離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反響作準(zhǔn)備； 2、模板DNAtf引物的退火（復(fù)性）模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至 55c左右，引物與模板DNAI鏈 的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 3、引物的延伸DNA真板-引物結(jié)合 物在TaqDNAK合酶的作用下，以dNTF%反響原料， 靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互

3、補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保 存復(fù)制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。到達(dá)平臺(tái)期 （Plateau） 所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 三、PCRfc術(shù)的意義1、特異性強(qiáng)PCRE響的特異性決定因素為：引物與模板DNA($異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原那么；Taq DN咪合酶合成反響的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原那么的。聚合酶合成反響的忠實(shí)性及 TaqDNAK合酶耐高溫性，使 反響中模板與引物的結(jié)合復(fù)

4、性可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大 增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。 再通過選擇特異性和保守 性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 (pg=10-12量級(jí)的起始 待測(cè)模板擴(kuò)增到微克以g二6水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在 病毒的檢測(cè)中，PCR勺靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU空斑形成單位；在細(xì)菌學(xué)中最小檢 出率為3個(gè)細(xì)菌。3、簡便、快速PC阪響用而寸高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反響液加好后，即在 DNA 擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反響，一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反響。 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一

5、定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4、對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要?jiǎng)e離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞， DNA粗制品及RNA勻可作為擴(kuò)增模板。 可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNAT增檢測(cè)。四、PCRK術(shù)主要應(yīng)用的領(lǐng)域1、核酸的根底研究：基因組克隆2、不對(duì)稱PCR®J備單鏈DNAffl于DNAW序3、反向PCRM定未知DNAg域4、反轉(zhuǎn)錄PCRRT-PCR用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNAW毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCRffl于對(duì)PCR物實(shí)時(shí)監(jiān)控6、cDNAHC端快速擴(kuò)增技術(shù)7、檢測(cè)基因的表達(dá)8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾??；診

6、斷月中瘤；應(yīng)用于法醫(yī) 物證學(xué)。五、關(guān)于RT-PCR4月17日，在北京檢驗(yàn)檢疫局承當(dāng)?shù)膰屹|(zhì)檢總局科技方案工程“禽流感 病毒H7N9亞型雙重?zé)晒釸T-PCRS型技術(shù)研究鑒定會(huì)上，專家組一致認(rèn)為：該 工程創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒 H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測(cè)中 確認(rèn)樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病 毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術(shù)優(yōu)勢(shì)突出。專家組同意工程成果通過鑒 定，并建議在進(jìn)一步擴(kuò)大和完善動(dòng)物臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根底上，盡快推廣應(yīng)用。RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄 RCR reverse transcription PCR 和實(shí)時(shí) PCRreal time PCR共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)是聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在 RT-PCR, 一條 RNAg被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA再以此為模板通過PCR®T DNAT增。RT-PCRg 術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平， 細(xì)胞中RNAW毒的含量 和直接克隆特定基因的cDNAff列。作為模板的RNA以